Способ гибридизации нк

Способ гибридизации нк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биофизике и молекулярной биологии и, в частности, касается способа гибридизации нитей молекул двунитевых НК, сложных смесей однонитевых НК, способных к самоассоциации, или даже однонитевых НК, образующих сложные внутримолекулярные структуры с зондами, иммобилизованными на твердой фазе посредством перемещения раствора с НК между зонами тепловой денатурации, охлаждения и гибридизации. Настоящее изобретение может быть использовано в приложениях секвенирования, идентификации последовательностей, обнаружения мутаций, минорного полиморфизма, изучения термодинамики и в иных приложениях, где требуется проведение гибридизации с зондами, иммобилизованными на твердой фазе (биочипами, микрочипами, микроматрицами), исключая стадию предварительной наработки однонитевой ДНК из двунитевой. Данный способ полностью совместим со стандартной технологией анализа ДНК и РНК, основанной на применении биочипов. Он может применяться без каких-либо ограничений и изменения в технологии изготовления биочипов.

Предшествующий уровень техники

Технология гибридизационного анализа с зондами, иммобилизованными на твердой фазе, и, в частности, микроматрицы, включая микрочипы, биочипы и чипы (далее эти термины используются взаимозаменяемо), является эффективным средством многопараметрического анализа экспрессии генов и генетических вариаций. В настоящее время она широко используется в различных генетических, биомедицинских и экологических приложениях. Известны способы: [1-5], способы заключаются в проведении гибридизации однонитевой НК-мишени при фиксированной температуре на твердой фазе, содержащей двумерные микроматрицы (микрочипы) с различной длинной и количеством иммобилизованных однонитевых НК-зондов. Эти способы являются самыми распространенными, однако, несмотря на это, всем им присущ существенный недостаток, связанный с тем, что однонитевая НК склонна к самоассоциации и образованию как внутри-, так и межмолекулярных структур, которые, своим образованием не дают возможность гибридизоваться НК с зондами, иммобилизованными на твердой фазе, комплементарными к этим проблемным участкам. Это снижает чувствительность анализа и мешает интерпретировать результаты [6]. Времена протекания этой самоассоциации как при образовании внутри- так и при образовании межмолекулярных комплексов, как правило, гораздо меньше [7], чем общее время гибридизации, необходимое для того, чтобы получить значимые величины гибридизационных сигналов для проведения дальнейшего анализа [8]. Более того, у этого подхода есть еще один недостаток.

Обычно для того, чтобы подготовить к гибридизационному анализу образцы ДНК, выделенной из клеток, сначала проводят амплификацию, в результате которой получают специфические фрагменты двунитевой ДНК. В дальнейшем необходимо использовать еще одну дополнительную стадию для наработки однонитевой ДНК в количестве, достаточном для гибридизации с однонитевыми зондами на твердой фазе. Для получения однонитевой ДНК наиболее часто используют несколько способов: [9] - использующий асимметричную ПЦР, [10, 11] - использующие экзонуклеазную реакцию гидролиза одной из цепей, [12, 13] - использующие химически модифицированные праймеры, [14] - использующий аффинную очистку. Способы заключаются в проведении дополнительной ферментативной стадии либо синтеза одной из цепей [9], либо гидролиза одной из цепей [10, 11], либо заключаются в непосредственном физическом разделении цепей при использовании фракционирования или афинной хроматографии, если фрагменты сделаны различными по какому-либо физико-химическому свойству или одна из цепей предварительно была помечена афинной меткой или [12-14]. Однако способы [1-5] обычно всегда предполагают в качестве предварительной стадии наработку однонитевых продуктов способами [9-14], что требует проведения дополнительной стадии, а значит дополнительного времени и реагентов для осуществления наработки или разделения однонитевых фрагментов из двунитевых.

В мире была предпринята попытка преодолеть эти недостатки, используя анализ по связыванию двунитевой ДНК без ее денатурации. Известен способ [15], который заключается в проведении связывания, при котором происходит образование комплексов из двунитевой ДНК с однонитевыми зондами на твердой фазе (микрочипе, биочипе). Иначе эти комплексы называются триплексами. Однако этот способ не обладает достаточной специфичностью и чувствительностью и как способ анализа не может конкурировать с гибридизацией однонитевой ДНК.

Эффективность гибридизации также зависит от вторичной структуры анализируемой однонитевой ДНК. Образующиеся внутримолекулярные структуры затрудняют гибридизацию исследуемых фрагментов однонитевой ДНК с олигонуклеотидными зондами при стандартном способе гибридизации, изложенном в [1-5]. Для преодоления этого недостатка был предложен еще один подход. Известен способ [16, 17], который заключается в использовании блокирующих олигонуклеотидов при стандартном способе гибридизации [1-5]. Эти нуклеотиды добавляются в раствор, содержащий гибридизуемую НК, которую гибридизуют с зондами, иммобилизованными на твердой фазе (микрочипе). Они комплементарны к тем участкам НК, которые подвержены образованию внутримолекулярных структур, чтобы конкурировать за их раскрытие, а следовательно, за смещение равновесия в пользу гибридизации с иммобилизованными зондами комплементарных к закрывающим блокирующими фрагментами последовательностей. Эта конкуренция происходит в момент однократного нагрева до температуры денатурации, обеспечивающий раскрытие шпилек, и последующего охлаждения перед гибридизацией. После этого смесь гибридизуют обычным образом при постоянной температуре, как в [1-5], получая уже ненулевые сигналы от зондов, комплементарных к проблеммным участкам. Однако этот способ требует знания последовательности анализируемой ДНК, чтобы знать, какие последовательности должны быть у блокирующих олигонуклеотидов. Также он требует расчета вторичной структуры НК, что не всегда является приемлемым. Скорость схлопывания внутримолекулярных структур [18] всегда быстрее, чем межмолекулярных [7]. Поэтому блокирующим олигонуклеотидам трудно конкурировать, и сигналы редко достигают значимых величин.

Для повышения эффективности гибридизации однонитевой ДНК и подавления влияния самоассоциации и образования внутримолекулярных структур было также предложено использовать еще один способ, использующий микрофлюидные устройства. Известен способ [19], который заключается в использовании денатурации нагреванием и высоких градиентов скоростей при перемещении раствора с НК в узком капилляре из зоны денатурации через зону охлаждения в зону гибридизации. Это делается с целью поддержания денатурированных внутримолекулярных структур в ДНК в открытом состоянии силами вязкого трения, поскольку, будучи охлаждены, внутримолекулярные структуры мгновенно (менее 1 микросекунды) схлопываются [18]. Далее сохраненная денатурированная структура НК в охлажденном растворе становится открытой для гибридизации с иммобилизованными зондами при дальнейшем движении в охлажденной части узкого канала, где размещались иммобилизованные зонды. При организации возвратно-поступательных циклов происходит создание постоянной концентрации денатурированной ДНК рядом с иммобилизованными на твердой фазе зондами, и происходит гибридизация ранее не доступных для этого участков НК. Однако, несмотря на явные преимущества, этот способ также имеет ряд недостатков, заключающихся в том, что предложенные автором устройства сложны в изготовлении и не совместимы с широко используемым и производимым во всем мире матричным типом микрочипов (биочипов, микрочипов, микроматриц) с большим количеством ячеек, при расположении ячеек в виде двумерного регулярного массива на плоскости, которые не представляют из себя узкий капилляр. Кроме того, эти способы пригодны не для всех последовательностей однонитевой ДНК. Время образования внутримолекулярной «шпильки», например, длиной 10 пар оснований и с длинной последовательности «головки» 4 пары - меньше микросекунды [18], а характерное время охлаждения растворов в работе авторов - порядка секунды. Поэтому эти способы могут быть использованы только для однонитевых ДНК, где участки, способные ассоциироваться, находятся достаточно далеко друг от друга в цепи однонитевой ДНК. Например, способ может быть использован в случае, если ДНК находится в состоянии «клубка» из-за неспецифической ассоциации. Этот способ также может быть использован в случае, если ДНК, имеющая шпильку, имеет достаточно длинные последовательности с 3'- и 5'-концов этой шпильки, чтобы вышеописанные гидродинамические силы были бы способны с помощью сил вязкого трения растянуть сформировавшуюся шпильку за эти концы. Гидродинамические силы, вытягивающие молекулу вдоль канала, могут противостоять термодинамике ассоциации комплементарных участков однонитевой ДНК в случае, если длина ДНК не менее 1400 оснований. С другой стороны, гидродинамические силы не должны быть слишком сильными, чтобы не смыть потоком из-за сил вязкого трения молекулы ДНК, связавшиеся с зондами, иммобилизованными на чипе. Эти условия существенно ограничивают длину области самокомплементарности (длину возможных «шпилек» с короткими последовательностями в «головках») в анализируемой однонитевой ДНК, которая, очевидно, не может быть больше, чем длина дуплексов, образующихся на чипе.

В уровне техники известен и другой подход, направленный на уменьшение влияния внутримолекулярных структур в НК. Известен способ [20, 21], который заключается в проведении фрагментации, перед гибридизацией по способу [1-5], которая приводит к разрывам в петлях внутримолекулярных структур. Однако этот способ лишь частично может улучшить анализ последовательностей НК, переводя внутримолекулярные комплексы в межмолекулярные. Такой перевод не способен решить проблему ассоциации фрагментов между собой как таковую, что, в свою очередь, снова приводит к задаче анализа двунитевой ДНК.

Указанные недостатки уровня техники могут быть успешно преодолены с помощью способа гибридизации нитей НК на твердой фазе посредством перемещения раствора с НК между зонами тепловой денатурации, охлаждения и гибридизации, который может быть использован как перспективный способ в практике гибридизационного анализа НК. Предлагаемый способ преодолевает недостатки способов [1-5], посредством одновременной комбинации двух способов: фрагментации, изложенной в [20,21], и модифицированной циклической денатурации-гибридизации [19], без использования узкого канала. Применение первого переводит внутримолекулярные комплексы НК в межмолекулярные, а второе разрушает межмолекулярные. Последнее происходит посредством перемещения раствора с НК между зонами денатурации охлаждения и гибридизации, за время, меньшее, чем ренатурация двунитевых НК. Это, в результате, приводит к полному освобождению НК как от внутри-, так и от межмолекулярных структур, мешающих НК гибридизоваться с зондами, иммобилизованными на твердой фазе. Организация замкнутого цикла циркуляции при перемещении НК приводит, так же, как и в [19], к созданию постоянной концентрации однонитевых НК над твердой фазой с иммобилизованными зондами в течениие всего времени гибридизации. Как следствие, это приводит к накоплению значимых сигналов гибридизации с величинами того же порядка, что и в способах [1-5], примененных к однонитевыми НК, не склонными к образованию каких-либо структур в растворе. Также этот способ преодолевает недостатки способов [9-14], которые используются совместно с [1-5] в качестве необходимой предварительной стадии. Эти недостатки преодолеваются посредством использования для проведения гибридизации сразу двунитевых НК, минуя стадию наработки однонитевых продуктов. Также этот способ преодолевает недостатки способа [15], используя универсальный гибридизационный подход на базе образования дуплексов между однонитевыми НК, который более универсален и свободен от неспецифичного связывания. Также этот способ преодолевает недостатки способов [16, 17] по избавлению от внутри- и межмолекулярных структур, используя более универсальные вышеописанные приемы по преодолению недостатков способов [1-5], которые не требуют синтеза блокирующих олигонуклеотидов. Также этот способ преодолевает недостатки способа [19-21], комбинируя вместе два способа, а именно: (а) фрагментацию, используемую в способах [20, 21], которая не освобождает раствор от межмолекулярных структур в НК, но в нашем случае, произведенную особым образом, и (б) денатурацию нагреванием с циклическим перемещением НК [19], которая не освобождает от внутримолекулярных структур с короткими последовательностями в «головках» шпилек, но, в нашем случае, не используя узкий канал. Поскольку внутримолекулярные структуры, способные к мгновенной ренатурации, разрушаются фрагментацией, а межмолекулярные структуры ренатурируют (восстанавливаются) гораздо медленнее [7, 22], а именно за времена, которые подбором концентрации НК можно достичь в механических устройствах при охлаждении раствора от температур денатурации до температур гибридизации, то надобность использования сложного и неуниверсального узкоканального чипа для поддержания внутримолекулярных структур открытыми (несформировавшимися) отпадает. Таким образом, открывается совместимость предлагаемого способа с широко известной технологией матричных микрочипов, расположенных на двумерных твердых фазах (двумерных плоскостях), которые в настоящее время являются основным, если не единственным типом чипов, используемых в практических приложениях.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способ гибридизациии НК посредством перемещения раствора с НК между зонами денатурации, охлаждения и гибридизации. Предложенный способ включает стадии:

(а) нагревание гибридизационного раствора, содержащего НК, до температуры, при которой происходит денатурация НК,

(б) охлаждение нагретого гибридизационного раствора до температуры, при которой происходит гибридизация НК с зондами, иммобилизованными на твердой фазе,

(в) гибридизация НК, содержащихся в охлажденном гибридизационном растворе, с зондами, иммобилизованными на твердой фазе, которая находится при температуре гибридизации,

при этом гибридизуемые нуклеиновые кислоты перемещаются между зонами денатурации, охлаждения и гибридизации.

Согласно изобретению нуклеиновые кислоты включают синтетические и/или природные олигонуклеотиды и/или НК в однонитевой и/или двунитевой форме, НК, выделенные и/или наработанные из биологического образца и/или ПЦР продукты симметричной или асимметричной ПЦР.

Согласно изобретению НК, содержащиеся в гибридизационном растворе, маркируют радиоактивными метками, флуоресцентными метками или масс-метками. Согласно изобретению флуоресцентные метки включают красители CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3.5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR, BlackHoleQuencherl, BlackHoleQuencher2 и/или BlackHoleQuencher3.

Согласно изобретению НК не фрагментируют.

Согласно изобретению НК фрагментируют перед гибридизацией или во время гибридизации.

Согласно изобретению НК фрагментируют не зависящим от последовательности способом, случайным способом или случайным и не зависимым от последовательности способом.

Согласно изобретению НК фрагментируют так, чтобы средняя длина фрагментов была примерно равна длинам иммобилизованных зондов.

Согласно изобретению НК фрагментируют ферментативно, с помощью урацил-гликозилазы, с помощью ДНКазы и/или с помощью ультразвука.

Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) осуществляют за один цикл, многократно, путем рециркуляции в замкнутом цикле, возвратно-поступательно или прерывисто.

Согласно изобретению нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) производят до температур выше, чем температуры денатурации гибридизуемых НК.

Согласно изобретению время нахождения НК в нагретом состоянии на стадии (а) при температурах выше, чем температура денатурации НК, больше, чем общее время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК.

Согласно изобретению время охлаждения НК на стадии (б) меньше, чем время ренатурации НК.

Согласно изобретению общее время нахождения НК в охлажденном состоянии на стадии (б) при температурах ниже температур денатурации в сумме со временем контактирования НК с твердой фазой на стадии (в) должно быть не больше, чем время ренатурации НК.

Согласно изобретению стадия охлаждения совмещена со стадией гибридизации.

Согласно изобретению температура охлаждения на стадии (б) отличается от температуры гибридизации.

Согласно изобретению температура гибридизации на стадии (в) ниже, чем температура нагревания на стадии (а).

Согласно изобретению температура гибридизации на стадии (в) равна или ниже, чем температура ренатурации НК.

Согласно изобретению температура гибридизации находится в диапазоне температур плавления дуплексов между гибридизуемыми НК и зондами или ниже, чем диапазон температур плавления дуплексов между гибридизуемыми НК и зондами.

Согласно изобретению зонды, иммобилизованные на твердой фазе, экспонированы в жидкой фазе гибридизационного раствора.

Согласно изобретению скорость перемещения при потоке гибридизационного раствора с НК в местах иммобилизации зондов на твердой фазе отлична от нуля.

Согласно изобретению время прохождения НК от попадания в зону охлаждения до непосредственного момента гибридизации меньше времени ренатурации.

Согласно изобретению стадию (в) гибридизации проводят в камере, через которую осуществляют перемещение гибридизационного раствора с НК. Камера представляет собой герметичный сосуд, предназначенный для организации потока гибридизационного раствора, содержащий внутри твердую фазу с иммобилизованными зондами, через которую осуществляют перемещение гибридизационного раствора с НК. Камера имеет вход и выход для организации перемещения гибридизационного раствора.

Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) проводят в одной камере.

Согласно изобретению камера имеет охлаждаемую и нагреваемую зоны для организации потока гибридизационного раствора с помощью конвекции.

Согласно изобретению камера имеет охлаждаемую и нагреваемую поверхность, а организацию перемещения гибридизационного раствора осуществляют с помощью внутреннего или внешнего насоса. Насос включает ультразвуковой и/или лепестковый насос.

Согласно изобретению поверхность твердой фазы в местах прикрепления зондов является гидрофильной.

Согласно изобретению твердая фаза включает стекло, пористое стекло, кремний, пористый кремний, металл, керамику, полимерный материал, пористый полимерный материал, целлюлозу или нитроцеллюлозу.

Согласно изобретению на поверхности твердой фазы сформирован дополнительный слой пористого сорбента или гидрогеля. Пористый сорбент или гидрогель включает акриламид, полиметаакрилат, агарозу, гиалуроновую кислоту, альгиновую кислоту и/или декстран. Слой пористого сорбента или гидрогеля сформирован в виде ячеек, которые отделены друг от друга промежутками или располагаются вплотную друг к другу и образуют регулярный одномерный или двумерный массив. Гидрогелевые ячейки включают акриламид, полиметаакрилат, агарозу, целлюлозу, гиалуроновую кислоту, альгиновую кислоту, декстран.

Согласно изобретению время диффузии НК гибридизационного раствора через пористые структуры твердой фазы к иммобилизованным зондам в сумме с временем прохождения зоны охлаждения и гибридизации меньше, чем время ренатурации НК.

Согласно изобретению твердая фаза включает биочип, микрочип или микроматрицу.

Согласно изобретению твердая фаза дополнительно включает температурные маркеры для определения температуры, содержащие однонитевую НК с внутримолекулярной структурой-шпилькой, которая раскрывается при заданной температуре, а на ее концах располагаются флуоресцентная метка и тушитель флуоресценции. Флуоресцентная метка включает красители: CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR. Тушитель флуоресценции включает красители BlackHoleQuencherl, BlackHoleQuencher2, BlackHoleQuencher3, CY-7, CY5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.

Согласно изобретению зонды, иммобилизованные на твердой фазе, включают фрагменты НК или пептидно-нуклеиновых кислот, синтетические олигонуклеотиды, фрагменты к-ДНК и/или все переборы олигонуклеотидов заданной длинны.

Согласно изобретению зонды маркируют.

Согласно изобретению зонды маркируют флуоресцентными метками для определения количества иммобилизованных зондов на твердой фазе методом измерения сигнала от маркированных зондов.

Согласно изобретению зонды маркированы температурными маркерами, позволяющими определять температуру в месте их расположения. Температурные маркеры включают однонитевую НК с внутримолекулярной структурой-шпилькой, которая раскрывается при заданной температуре, а на ее концах располагаются флуоресцентная метка и тушитель флуоресценции. Флуоресцентная метка включает красители CY-7,CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR. Тушитель флуоресценции включает красители BlackHoleQuencherl, BlackHoleQuencher2, BlackHoleQuencher3, CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.

Согласно изобретению перемещение осуществляют при помощи организации потока жидкости гибридизационного раствора с помощью прокачивания, диффузией, конвекцией или с помощью насоса.

Согласно изобретению насос включает перистальтический насос, ультразвуковой насос, мембранный насос, поршневой насос.

Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) до температур выше, чем температура денатурации НК раствора.

Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает общее время нагревания на стадии (а), большее, чем время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК.

Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает охлаждение гибридизационного раствора на стадиях (б) и (в) до температуры гибридизации.

Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает общее время охлаждения на стадиях (б) и (в), меньшее, чем время ренатурации НК.

Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) до температур выше, чем температура денатурации при общем времени нагрева, большем, чем время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК, и охлаждение на стадиях (б) и (в) до температуры гибридизации, при общем времени охлаждения на стадиях (б) и (в), меньшем, чем время ренатурации НК.

Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) проводят фиксированное время, до достижения величины гибридизационных сигналов стационарного уровня, который обеспечивает установление термодинамического равновесия в образовании дуплексов НК с зондами твердой фазы. Достижение величин обеспечивается с точностью до погрешности. Погрешность определяется стандартным отклонением математического ожидания суммарного сигнала со всех одинаковых зондов.

Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) проводят до достижения такой величины гибридизационных сигналов, при которой интегральные сигналы, полученные со всех одинаковых зондов, соответствующие количеству образовавшихся при гибридизации дуплексов зондов с НК, отличаются друг от друга на величины, большие чем стандартное отклонение математического ожидания при усреднении этого сигнала по одинаковым зондам или площади, где расположены одинаковые зонды.

Согласно изобретению величины сигналов определяют с помощью аналитического способа, который включает радиоактивный способ с применением радиоактивных меток для маркирования НК; флуоресцентный способ с применением флуоресцентных меток для маркирования НК; способ плазмонного резонанса, не требующий меток, и способ регистрации, основанный на измерении электромагнитных полей и электрических токов, включающий размещение чувствительных элементов под зондами, которые включают гальванический или изолированный электрод и/или полевой транзистор.

Краткое описание чертежей

Для более ясного понимания сущности заявленного изобретения, а также для демонстрации его характерных особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание изобретения со ссылками на чертежи, на которых изображено следующее.

Фиг.1. Схема устройства для анализа двунитевых нуклеиновых кислот, основанного на накоплении продуктов гибридизации при циркуляции между камерами денатурации и гибридизации.

Фиг.2. Структура чипа, разработанного для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину (Пример 1).

(А) Схема расположения олигонуклеотидов в ячейках микрочипа, разработанного для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину. Обозначения в ячейках отвечают мутациям в гене rpoB.

(Б) Таблица, в которой приведены последовательности олигонуклеотидов с указанием последовательности, мутации, расположения в геноме и места расположения на чипе.

Фиг.3. Флуоресцентное изображение чипа для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину (Пример 1).

Нормализованное флуоресцентное изображение микрочипа после проведения анализа двунитевой ДНК, соответствующего участку гена rpoB М. tuberculosis длиной 126 п.н., на предлагаемом устройстве. Гибридизовали ДНК дикого типа (мутации отсутствуют). Получено после проведения процесса гибридизации при анализе двунитевой ДНК М. Tuberculosis - дикий тип (с отсутствием мутаций) после симметричной ПЦР с помощью предлагаемого устройства. Процесс проводили до полного насыщения сигнала в течение 8 часов при температуре чипа 37°С, скорости потока 0.5 см/сек (соответствует времени охлаждения 18 сек) и температуре нагревателя 100°С.

Фиг.4. Графики зависимости интенсивностей сигналов в ячейках чипа для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину от времени при гибридизации двуцепочечной ДНК в примере 1, демонстрирующие работу устройства в разных режимах.

Графики получены в результате анализа двунитевой ДНК на чипе, разработанном для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину, при различных режимах работы нагревателя и насоса. ДНК дикого типа, sequence of rpoB gene (Genbank асc. No. L27989), была получена с использованием маркирования праймера в симметричной ПЦР. Температура охладителя и чипа = 37°С. Над графиком помечены 5 разных случаев изменения режимов. 1. Температура нагревателя (20°С) при времени охлаждения 3 сек. 2. Температура нагревателя (60, затем 80°С) при том же времени охлаждения. 3. Температура нагревателя (100°С) при временах охлаждения 3, 6, 9, 18 сек. 4. Время охлаждения раствора увеличили до 90 сек при той же температуре нагревателя. 5. Время охлаждения раствора уменьшили до 18 сек. Температура нагревателя (110°С).

Квадратики (■) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2В, в которой иммобилизован зонд 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-CAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel образующий совершенный дуплекс со значащей цепью двунитевой ДНК раствора.

Кружочки (•) - флуоресцентному сигналу другой ячейки чипа с индексом 2А, в которой иммобилизован другой зонд 5'-GCT-GTC-TGG-TGC-CGA-AGA-NH-3'-gel, образующий другой совершенный дуплекс с другим участком значащей цепи двунитевой ДНК раствора.

Ромбики (♦) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 3В 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-TAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel, в которой иммобилизован зонд, образующий несовершенный дуплекс,

Крестики (Χ) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2F, содержащей пустой гель.

Фиг.5. Графики зависимости интенсивностей сигналов в ячейках чипа для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину от времени при гибридизации двунитевой ДНК в оптимальных условиях в примере 1.

Температура нагревателя 100°С, время охлаждения 18 сек.

Квадратики (■) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2 В, в которой иммобилизован зонд 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-CAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel, образующий совершенный дуплекс со значащей цепью двунитевой ДНК раствора.

Кружочки (•) - флуоресцентному сигналу другой ячейки чипа с индексом 2А, в которой иммобилизован другой зонд 5'-GCT-GTC-TGG-TGC-CGA-AGA-NH-3'-gel, образующий другой совершенный дуплекс с другим участком значащей цепи двунитевой ДНК раствора.

Ромбики (♦) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 3В 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-TAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel, в которой иммобилизован зонд, образующий несовершенный дуплекс, Крестики - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2F, содержащей пустой гель.

Фиг.6. Графики зависимости интенсивностей флуоресцентных сигналов в ячейках чипа от времени при сравнительном анализе двунитевой (семейства кривых а и b) и однонитевой (семейство с) ДНК в ходе трех разных процессов гибридизации, демонстрирующие работу устройства на примере микрочипа для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину в примере 1.

Использовались 2 образца амплифицированной ДНК, полученные из одного штамма дикого типа, sequence of rpoB gene (Genbank асе. No. L27989). Образцы получали в симметричной и асимметричной ПЦР с использованием маркирования праймером значимой цепи. Температура охладителя и чипа = 37°С. Время охлаждения раствора в охладителе при циркуляции = 18 сек, (скорость потока = 0.5 см/сек). Общее время гибридизации=8 часов. На графике помечены 3 разных семейства кривых: а, Гибридизовали dsDNA, температура нагревателя = 20°С, b, Гибридизовали dsDNA,температура нагревателя = 100°С. с, гибридизовали ssDNA для сравнения, температура нагревателя=100°С.

Кружочки (•) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2В, в которой иммобилизован зонд 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-CAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel.

Квадратики (■) - 2D - 5'-Т САА ССС CGA CAG CG-NH-3'-gel.

Ромбики (♦) - 9А - 5'-ТС CAT GAA TTG GCT CAG СТ-NH-3'-gel.

Фиг.7. График корреляции гибридизационных сигналов способа гибридизации двунитевой ДНК и стандартного способа гибридизации на чипе для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis в примере 1. Производили сравнения гибридизационных сигналов всех ячеек чипа после проведения гибридизации одно- и двунитевой ДНК при одинаковых условиях гибридизации. Гибридизацию проводили 8 часов при одинаковых условиях. Использовались 2 образца амплифицированной ДНК, полученные из одного штамма дикого типа, sequence of rpoB gene (Genbank асc. No. L27989). Образцы получали в симметричной (двунитевая ДНК) и асимметричной (однонитевая ДНК) ПЦР с использованием маркирования праймером значимой цепи. Температура охладителя и чипа = 37°С. Время охлаждения раствора в охладителе при циркуляции = 18 сек, (скорость потока = 0.5 см/сек). После гибридизации фиксировали сигналы и откладывали на графике. Каждый из экспериментов повторяли 8 раз. Стандартное отклонение отложено в виде крестиков соответствующего размера. Использовалась последовательность фрагмента ДНК М. Tuberculosis - дикий тип (последовательность в ген банке L27989). Значимая цепь была маркирована при проведении ПЦР, используя флуоресцентно-меченый праймер, окрашенный красителем CY5.

Ось X: данные сигналов всех ячеек чипа после гибридизации однонитевой ДНК, полученной несимметричной ПЦР.

Ось У: данные сигналов всех ячеек чипа после гибридизации двунитевой ДНК, полученных симметричной ПЦР.

Фиг.8. Дискриминационные соотношения, полученные после гибридизационного анализа одно- и двунитевой ДНК между совершенными и средней суммой соответствующих несовершенных дуплексов в примере 1.

Гибридизацию проводили 8 часов при одинаковых условиях. Использовались 2 образца амплифицированной ДНК, полученные из одного штамма дикого типа, sequence of гроВ gene (Genbank асc. No. L27989). Образцы получали в симметричной (двунитевая ДНК) и асимметричной (однонитевая ДНК) ПЦР с использованием маркирования праймером значимой цепи. Температура охладителя и чипа = 37°С. Время охлаждения раствора в охладителе при циркуляции = 18 сек, (скорость потока = 0.5 см/сек). После гибридизации фиксировали сигналы и получали дискриминационные отношения. Каждый из экспериментов повторяли 8 раз. Стандартное отклонение отложено в виде вертикальных линий соответствующего размера. Черные бары обозначают дискриминационные соотношения, полученные после гибридизации однонитевой ДНК. Светлые бары обозначают дискриминационные соотношения, полученные после анализа двунитевой ДНК. Индексы под осью X означают координаты совершенных дуплексов на схеме чипа. Вдоль оси Y отложены обратные значения величины дискриминации. Вертикальные крестики обозначают стандартное отклонение.

Фиг.9. Графики зависимости интенсивностей сигналов в ячейках универсального чипа от времени при гибридизации короткого двунитевого фрагмента, демонстрирующие работу устройства в примере 2 в разных режимах.

(А): Графики получены в результате процесса гибридизации при анализе короткого участка двунитевой ДНК (дуплекса) 5'-Cy3-NH-GGT-CTC-TCC-3'/5'-GGA-GAG-ACC-NH-Су3-3' на универсальном чипе при различных режимах работы нагревателя и постоянной скорости прокачки (время охлаждения во всех случаях = 3 сек). Температура охладителя и чипа = -5°С. Сверху над графиком указаны 4 разных случая изменения режимов. 1: Нагреватель отключен. Его температура (20°С) ниже температуры плавления дуплекса (40°С). 2: Температура нагревателя (60°С) выше температуры плавления дуплекса. 3: Нагреватель выключили (20°С). 4: Нагреватель снова включили (60°С).

Кружочки (•) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-TCT-CTC-N-3', образующий совершенный дуплекс с одной из двух нитей анализируемого дуплекса в растворе.

Квадратики (■) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-GAG-AGA-N-3', комплементарный предыдущему, который образует совершенный дуплекс с другой нитью анализируемого дуплекса в растворе.

Крестики (X) соответствуют флуоресцентному сигналу от той же ячейки чипа, как в случае отображенной кружочками, но при анализе нерасщепленной шпильки 5'-Cy3-NH-GGTCTCTCC-TTTT-GGAGAGACC-3' при проведении отдельного проверочного эксперимента.

Ромбики (♦)- флуоресцентному сигналу отдельной ячейки чипа, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-TGATCG-N-3', комплементарный контрольному однонитевому праймеру р1272 5'-Cy3-NH-CGCCG-CGATC-AAGGA-GTTCT-3', добавленному в раствор в той же концентрации, что дуплекс или шпилька в ходе основного и проверочного экспериментов.

(Б) Пояснение к эксперименту 2: структура и последовательность анализируемого в эксперименте 2 короткого участка двунитевой ДНК (дуплекса) и схема его получения из шпильки, используемой в отдельном проверочном эксперименте. Рамками выделены последовательности зондов 2 ячеек чипа, от которых получали сигналы, показанные на графике (А).

Фиг 10. Сравнительный гибридизационный анализ неразрезанной шпильки, дуплекса, полученной при разрезании этой шпильки и однонитевых цепей разрезанной шпильки по отдельности, в примере 2 с помощью предлагаемого устройства.

(А) Графики зависимости интенсивностей флуоресцентных сигналов в ячейках универсального чипа от времени. При проведении анализа температура охладителя и чипа = -5°С. Время охлаждения=3 сек (скорость потока = 3 см/сек). На графике помечены 4 разных семейства кривых, соответствующих 4 разным экспериментам: а - семейство кривых при проведении анализа неразрезанной внутримолекулярной шпильки 5'-Cy3-NH-GGTCTCTCC-TTTT-GGAGAGACC-3' при температуре нагревателя 60°С (отсутствие сигнала), b - проведение анализа разрезанной шпильки (дуплекса) 5'-Cy3-NH-GGT-CTC-TCC-3V5'-GGA-GAG-ACC-NH-Cy3-3' при температуре нагревателя 20°С (слабые сигналы), с - проведение анализа этого же дуплекса при температуре нагревателя 60°С (сильные сигналы), d - проведение контрольного анализа частей разрезанной шпильки по отдельности при температуре нагревателя 60°С.

ЛЕГЕНДА

Кружочки (•) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа Pad 1, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-TCT-CTC-N-3'.

Квадратики (■) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа Pad 2, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-GAG-AGA-N-3', комплементарный предыдущему.

(Б) Нормализованные флуоресцентные изображения ячеек универсального чипа

Изображения получены после проведения гибридизации, как в пункте (А):

а - после проведения анализа неразрезанной внутримолекулярной шпильки пр