Противотуберкулезное лекарственное средство на основе 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлората, способ его получения и способ лечения

Противотуберкулезное лекарственное средство на основе 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлората, способ его получения и способ лечения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, конкретно к новому противотуберкулезному лекарственному средству, которое содержит в качестве активного вещества 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлорат в терапевтически эффективном и безопасном количестве, а также фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Кроме того, изобретение относится к способу получения вышеуказанного лекарственного средства (варианты) и способу лечения всех форм легочного и внелегочного туберкулеза, а также профилактике в составе комбинированной терапии туберкулеза.

Предшествующий уровень техники

На сегодняшний день остро стоит проблема смертности от туберкулеза (ТБ). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2007 г. во всем мире насчитывалось 9,27 миллиона случаев заболевания ТБ. Это представляет собой увеличение по сравнению с 9,24 миллиона случаев в 2006 г., 8,3 миллиона случаев в 2000 г. и 6,6 миллиона случаев в 1990 г. Большинство предполагаемых случаев в 2007 г. произошли в Азии (55%) и Африке (31%), с небольшой долей случаев в Регионе Восточного Средиземноморья (6%), Европейском регионе (5%) и Регионе стран Америки (3%). Пятью первыми странами по общему числу случаев заболевания в 2007 г. являются Индия (2,0 миллиона), Китай (1,3 миллиона), Индонезия (0,53 миллиона), Нигерия (0,46 миллиона) и Южная Африка (0,46 миллиона). Согласно оценкам из 9,27 миллиона случаев заболевания 1,37 миллиона (15%) были ВИЧ-положительными; 79% из этих ВИЧ-положительных случаев были в Африканском регионе и 11% - в Регионе Юго-Восточной Азии.

Хотя общее число случаев заболевания ТБ в абсолютном выражении увеличивается в результате роста численности населения, число таких случаев на душу населения падает. Темпы этого снижения являются медленными, менее чем на 1% в год. Частота случаев заболевания в мире в 2004 г. достигла пика и составляла 142 случая на 100000 человек. В 2007 г. эта цифра составляла приблизительно 139 случаев заболевания на 100000 человек. Частота случаев заболевания падает в пяти из шести регионов ВОЗ (исключением является Европейский регион, в котором коэффициенты являются практически стабильными).

В 2007 г. насчитывалось приблизительно 0,5 миллиона случаев ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (ТБ-МЛУ). На 27 стран (из которых 15 - в Европейском регионе) приходится 85% таких случаев. Пятью странами с наибольшим числом случаев ТБ-МЛУ являются Индия (131000), Китай (112000), Российская Федерация (43000), Южная Африка (16000) и Бангладеш (15000). К концу 2008 г. 55 стран и территорий сообщили по крайней мере об одном случае ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ТБ-ШЛУ) [1].

Наиболее важные достижения в лечении больных ТБ связаны с химиотерапией. В настоящее время из уровня техники известно большое количество противотуберкулезных средств. Первые химиопрепараты появились в конце 40-х годов (стрептомицин, натрия пара-аминосалицилат, тибон). Затем были созданы фтивазид, изониазид и новые эффективные химиопрепараты - этионамид, канамицин, флоримицин, циклосерин, протионамид. Это позволило осуществлять выбор химиопрепаратов, наиболее показанных для лечения конкретных больных. Далее появились очень эффективные препараты - рифампицин, этамбутол, микобутин. Однако одновременно с появлением новых противотуберкулезных препаратов (ПТП) расширяется развитие устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) к ним.

В стандартной химиотерапии ТБ (при лечении всех форм) в качестве основных и наиболее эффективных противотуберкулезных препаратов применяются изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты - ГИНК) [2], который принят нами в качестве прототипа, а также рифампицин [2, 3]. Изониазид обладает высокой терапевтической эффективностью, однако является высокотоксичным (LD₅₀ равно 150 мг/кг), кроме того, при применении данного препарата в курсе длительного лечения у пациента, как правило, возникают расстройства пищеварения, деятельности почек, нервно-психические, гематологические, аллергические проявления и токсические гепатиты. Помимо этого, основным его недостатком является быстрое развитие лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. Резистентность микобактерий туберкулеза к изониазиду развивается у 70% больных, а 30% пациентов переходят в разряд хронических больных. Полусинтетический антибиотик рифампицин также обладает высокой активностью в отношении МБТ и сильным токсическим эффектом. Кроме того, его основным недостатком, как и для изониазида, является быстрое развитие лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза, что существенно снижает его эффективность. Резистентность микобактерий туберкулеза к рифампицину развивается у 40-50% больных. При развитии устойчивости возбудителя к данному антибиотику его следует сочетать с другими ПТП (стрептомицином, изониазидом, этамбутолом и другими препаратами [2]. В связи с проблемой развития резистентности микобактерий туберкулеза к имеющимся препаратам возникает необходимость разработки новых ПТП и их комбинаций.

Авторы настоящего изобретения поставили перед собой задачу разработки нового высокоэффективного противотуберкулезного средства с минимальными токсическими эффектами и стабильного в процессе хранения.

Подробное описание осуществления изобретения

Поставленная задача решается тем, что авторами настоящего изобретения было разработано получение нового оригинального противотуберкулезного лекарственного средства, включающего активное вещество 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлорат в эффективном и безопасном количестве и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

Получают 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлорат способом, который ранее был разработан авторами настоящего изобретения и заключается во взаимодействии 4-пиридинальдегида (в избытке) с тиосемикарбазидом в присутствии 48-55%-ной хлорной кислоты в водно-этанольном растворе при 80-85°С [4].

Согласно изобретению предлагаемое противотуберкулезное лекарственное средство содержит активного вещества в количестве от 5,0 до 90,0% от массы лекарственной формы, а также фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества в количестве от 11,0 до 100,0% от массы действующего вещества. В пересчете на массу всей лекарственной формы противотуберкулезное лекарственное средство содержит от 5,0 до 90,0 мас.% 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлората от массы лекарственной формы и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества до 100 мас.%.

Эффективное количество активного вещества в лекарственной форме составляет от 5 до 1000 мг.

Предпочтительно, что заявляемое противотуберкулезное лекарственное средство дополнительно содержит, по меньшей мере, еще одно противотуберкулезное средство для достижения синергетического действия.

Лекарственное средство в качестве дополнительного противотуберкулезного лекарственного средства может содержать одно из таких активных веществ, как изониазид, пиразинамид, рифампицин, рифабутин, амикацин, этамбутол, антибиотик группы фторхинолонов или их комбинации.

Предпочтительно лекарственное средство может быть изготовлено в виде таблеток (кишечно-растворимых, с модифицированным высвобождением), комбинированных таблеток, капсул, драже, гранул, покрытых оболочкой, суппозиторий, суспензий. Лекарственные формы могут быть выполнены традиционным способом [5].

Средство по изобретению может вводиться обычным образом перорально или парентерально. Дозировка зависит от возраста, состояния и веса пациента, а также от вида введения.

Наряду с активным веществом лекарственное средство может при этом содержать обычные вспомогательные вещества, принятые в технологии приготовления лекарственных средств, такие как связующие, наполнители, консерванты, регуляторы текучести, смягчители, смачиватели, диспергаторы, эмульгаторы, растворители, антиокислители и/или пропелленты, пролонгаторы действия [6].

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно в качестве целевых добавок используют сахарозу, повидон, целлюлозу микрокристаллическую, кремния диоксид коллоидный, этилцеллюлозу, сополимеры метакриловой кислоты и этилакрилата, триэтилцитрат, макрагол, тальк, краситель железа оксида при следующем соотношении компонентов, % от действующего вещества:

Сахароза - 3,1-50,4

Повидон - 0,9-14,4

Целлюлоза микрокристаллическая - 1,1-18,0

Кремния диоксид коллоидный - 0,2-3,6

Этилцеллюлоза - 0,2-3,6

Наиболее распространенными способами получения таблеток являются три технологические схемы: с влажным гранулированием, сухим гранулированием и прямым прессованием.

В соответствии с настоящим изобретением предложен способ получения нового противотуберкулезного лекарственного средства.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому объекту является способ с влажным гранулированием, включающий следующие этапы: смешивание ингредиентов, увлажнение, гранулирование, сушка, опудривание, таблетирование [7].

Способ получения заявленного лекарственного средства включает следующие этапы:

а) раздельно просеивают через сито порошки 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлората, кремния диоксид коллоидный, кросповидона, магния стеарата, повидона, целлюлозы микрокристаллической, гипромелозы (гидроксипропилметилцеллюлоза), гипромелозы (гидроксипропилметилцеллюлоза), талька, полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, титана диоксида, железа оксида желтого;

б) в реактор для приготовления увлажнителя загружают холодную воду очищенную и повидон, перемешивают в течение 30 минут при температуре 60°С до получения прозрачного, однородного, бледно-желтого раствора;

в) для получения массы для таблетирования в смеситель загружают 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлорат и целлюлозу микрокристаллическую и перемешивают в течение 15 мин, после окончания перемешивания заливают увлажнитель, увлажнение и перемешивание проводят в течение не менее 15 мин до равномерного распределения увлажнителя и получения однородной массы;

г) осуществляют влажное гранулирование массы, полученной на стадии в);

д) влажный гранулят, полученный на стадии г), сушат в течение 20 мин при давлении 0,2 мПа и температуре 55±2°С до остаточной влажности 1,0-2,0%;

е) осуществляют опудривание и сухое гранулирование полученного на стадии д) высушенного гранулята, загружая его в бункер вибросита и затем загружая в смеситель сухой гранулят и опудриватель (аэросил, кросповидон, магния стеарат), избегая пылеобразования, перемешивают полупродукт в течение 15 мин, получают массу для таблетирования;

ж) полученную на стадии е) массу таблетируют на таблет-прессе;

з) на таблетки-ядра наносят водную суспензию пленочной оболочки, состоящей из смеси гипромеллозы, железа оксида желтого, макрогола, талька, пропиленгликоля и титана диоксида, и получают заявленное лекарственное средство.

Полученные таблетки лекарственного средства по изобретению покрыты оболочкой от желтого до темно-желтого цвета, овальной формы, двояковыпуклые. На изломе таблетка от светло-желтого до желтого со слабым зеленоватым оттенком цвета.

Выход на стадии составляет 99,47%. Таким образом, способ позволяет получить заявленное лекарственное средство с максимально возможным выходом.

Также в соответствии с настоящим изобретением предложен альтернативный способ получения нового противотуберкулезного лекарственного средства.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому объекту является способ прямого прессования, а также с влажным гранулированием, включающий следующие этапы: смешивание ингредиентов, увлажнение, гранулирование, обкатка и наращивание гранул, нанесение пленочного покрытия и сушку [7].

Альтернативный способ получения нового противотуберкулезного состава включает следующие этапы. Порошок 4-тиоуреидоиминометилпиридиния перхлората смешивают с кремнием диоксидом коллоидным, микрокристаллической целлюлозой и этилцеллюлозой, увлажняют 3,0-5,0% водным раствором повидона и 30,0-35,0% сахарным сиропом, гранулируют и обкатывают полученные гранулы. Гранулы сушат при 40-45°С до остаточной влажности 1,5-4,5%.

Покрытие на гранулы-ядра наносят известным способом из 20% водного раствора метакриловой кислоты и этилакрилата сополимер и суспензии пигментов талька и красителя железа оксида.

Также в соответствии с настоящим изобретением заявляется способ лечения всех форм легочного и внелегочного туберкулеза, а также профилактики в составе комбинированной терапии.

Согласно заявляемому способу лекарственное средство по настоящему изобретению применяют перорально или парентерально (подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно), кратность приема - 1 раз в сутки; разовая суточная доза - 20 мг/кг (1200 мг/сутки); максимальная разовая доза - 30 мг/кг (1800 мг/сутки).

Для замедления развития устойчивости микобактерий назначают совместно с другими противотуберкулезными препаратами или их комбинациями (изониазид, пиразинамид, рифампицин, рифабутин, амикацин, этамбутол, антибиотики группы фторхинолонов).

Биологическая активность лекарственного средства по изобретению

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

1. Оценка действия in vitro (культуры микроорганизмов и методики)

Использованные штаммы микроорганизмов:

1) лабораторные тест-штаммы, входящие в Mycobacterium tuberculosis complex, полученные из Федерального Государственного учреждения «НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича», чувствительные к существующим противотуберкулезным препаратам:

- М. tuberculosis Erdman;

- М. tuberculosis H37Rv;

- М. tuberculosis «Academia»;

- M. bovis bovinus 8;

2) культуры с множественной лекарственной устойчивостью, выделенные от больных с впервые выявленным туберкулезом (всего 14 штаммов):

- №5419 СПбНИИФ, устойчивость к изониазиду (10 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл) и стрептомицину (50 мкг/мл);

- №2483 СПбНИИФ, устойчивость к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл), стрептомицину (5 и 10 мкг/мл), рифабутину (40 мкг/мл), этамбутолу (2 мкг/мл);

- №3485 и №3589 СПбНИИФ, устойчивы к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (20 и 50 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), канамицину (30 мкг/мл), этамбутолу (2 мкг/мл); этионамиду (30 мкг/мл);

- №3019 СПбНИИФ, устойчивость к изониазиду (1 и 25 мкг/мл), рифампицину (20 и 50 мкг/мл), стрептомицину и канамицину (30 и 50 мкг/мл соответственно), этионамиду (30 мкг/мл);

- №3655 СПбНИИФ, устойчивость к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (20 и 50 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), канамицину и этамбутолу (30 мкг/мл);

- №3689 СПбНИИФ, устойчивость к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (20 и 50 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), канамицину (30 мкг/мл);

- №3910 СПбНИИФ, устойчивость к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (20 и 50 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), канамицину и этионамиду (30 мкг/мл);

- №1201 СПбНИИФ, устойчивость к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (20 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), канамицину (30 мкг/мл), этамбутолу (2 мкг/мл);

- №41 и №779 СПбНИИФ, устойчивы к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (20 и 50 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл);

- №1081 СПбНИИФ, устойчивость к рифампицину (20 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл);

- №1719 и №1279 СПбНИИФ, устойчивы к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (20 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл) канамицину и этионамиду (30 мкг/мл);

3) неспецифические микроорганизмы, чувствительные к антимикробным препаратам (из коллекции ФГУ «СПб НИИФ Росздрава»)

- грамотрицательные палочки - Е. coli;

- грамположительные кокки - Staphylococcus aureus, Streptococcus aureus, Corynebacterium pseudodiphtericum (дифтероид).

Антибактериальную активность перхлозона изучали стандартным методом двукратных серийных разведений в питательных средах с учетом биологических свойств тест-штаммов:

- синтетическая среда Сотона с 10% нормальной сывороткой (для микобактерий);

- сахарный бульон (для грамположительных и грамотрицательных бактерий).

Микробную суспензию готовили ex tempore, рабочая концентрация - 5×10⁶ клеток/мл.

Диапазон исследуемых доз перхлозона составил от 100 до 0,19 мкг/мл, с каждой культурой выполняли по 3 повторных исследования. Суспензию тест-штаммов вносили по 0,2 мл в опытные и контрольные пробирки: микобактериальную взвесь методом поверхностного наслоения, взвесь неспецифических бактерий - методом глубинного посева. Интенсивность роста неспецифических микробов учитывали через 24 часа, микобактериальной пленки - через 7-10 дней. Критерием активности служила величина минимальной концентрации средства по изобретению в питательной среде, полностью ингибирующая рост микроорганизмов (МИК, мкг/мл).

Для моделирования экспериментального туберкулеза использовали штамм М.bovis bovinus 8, чувствительный к противотуберкулезным препаратам.

Оценка терапевтического эффекта средства по изобретению. Использовали индекс эффективности лечения ИЭ (%) - долевая разница показателей тяжести течения туберкулезной инфекции в контрольных группах и в группах животных, получавших средство по изобретению. Индекс эффективности определяли по формуле

где n_к и n_o - средние значения показателей соответственно в контрольной и опытной группах.

Положительное значение ИЭ (плюс-эффект) указывает на снижение показателя пораженности или повышение терапевтической активности композиции противотуберкулезных препаратов под действием средства по изобретению.

Отрицательное значение ИЭ (минус-эффект) свидетельствует об увеличении показателя пораженности или ослаблении терапевтического действия композиции противотуберкулезных препаратов под влиянием средства по изобретению.

При оценке действия препаратов сравнения эффекты рассчитывали аналогично и обозначали их в соответствии с общепринятой символикой (по первой букве препарата).

Степень связи в вариации полученных терапевтических эффектов определяли по коэффициенту корреляции (r), количественно измеряли по коэффициентам регрессии в у/х. Для этого использовали стандартные методы расчетов Стьюдента - Фишера.

2. Антибактериальная активность средства по изобретению in vitro

Результаты изучения влияния средства по изобретению на рост стандартных тест-штаммов, входящих в Mycobacterium tuberculosis complex, чувствительных к существующим противотуберкулезным препаратам, приведены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние средства по изобретению на рост чувствительных тест-штаммов микобактерий (плотность микобактериальной суспензии 106 клеток/мл)
Концентрация средства по изобретению в среде (мкг/мл)	Интенсивность роста микобактериальной пленки
М. bovis bovinus 8	М. tuberculosis H37RV	М. tuberculosis Erdman	М. tuberculosis "Academia"
100	---	---	---	---
50	---	---	---	---
25	---	---	---	---
12,5	---	---	---	---
6,25	---	---	---	---
3,125	---	++	---	++
1,56	---	+++	+	+++
0,78	+	+++	++	+++
0,39	++	+++	++	+++
0,19	++	+++	++	+++
Контроль культуры	+++	+++	+++	+++

Как видно из таблицы 1, средство по изобретению подавляло рост тестируемых штаммов в диапазоне концентраций от 1,56 до 6,25 мкг/мл. Наибольшую ингибирующую активность средство по изобретению проявило в отношении М.bovis bovinus 8, начальная ингибиция роста (++) обнаружена при концентрации 0,19 мкг/мл, полное угнетение роста (МИК) - при концентрации 1,56 мкг/мл. Далее в порядке ослабления ингибирующего эффекта штаммы распределились следующим образом:

- М. tuberculosis Erdman (МИК=3,125 мкг/мл)

- M. tuberculosis H37RV u М. tuberculosis «Academia» (МИК=6,25 мкг/мл)

С целью выявления широты спектра антибактериальной активности перхлозона изучено его действие в отношении грамположительных кокков (Staphylococcus aureus, Streptococcus aureus), а также грамположительных и грамотрицательных палочек (E. coli и дифтероида). Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Влияние средства по изобретению на рост грам (+) и грам (-) тест-штаммов микроорганизмов (плотность микробной суспензии 106 клеток/мл)
Концентрация средства по изобретению в среде (мкг/мл)	Интенсивность роста тест-штамма
Staphyl. aureus	Strept. aureus	E. coli	Дифтероид
100	+++	+++	+++	+++
50	+++	+++	+++	+++
25	+++	+++	+++	+++
12,5	+++	+++	+++	+++
6,25	+++	+++	+++	+++
3,125	+++	+++	+++	+++
1,56	+++	+++	+++	+++
0,78	+++	+++	+++	+++
0,39	+++	+++	+++	+++
0,19	+++	+++	+++	+++
Контроль культуры	+++	+++	+++	+++

Как видно из приведенных в таблице 2 данных, средство по изобретению даже при высоких концентрациях в питательной среде (100 мкг/мл) не оказывало влияния на рост грамположительных и грамотрицательных культур микроорганизмов.

Ингибирующее действие средства по изобретению в отношении лекарственно-чувствительных микобактерий изучено на 14 клинических изолятах, из них у 2 (14,3%) выявлена резистентность к 6 противотуберкулезным препаратам (ПТП), у 7 (50%) - к 5 ПТП, у 1 (7,1%) - к 4 ПТП, у 3 (21,4%) - к 3 ПТП, у 1 (7,1%) - к 2 ПТП (таблица 3).

Таблица 3
Влияние средства по изобретению на рост лекарственно-устойчивых клинических изолятов МБТ (плотность микобактериальной суспензии 5×106 микробных клеток/мл)
Исследованные изоляты МБТ	Минимальная ингибирующая концентрация (МИК, мкг/мл)
Устойчивость к 6 ПТП N3485	6,25
Устойчивость к 6 ПТП N3589	6,25
Устойчивость к 5 ПТП N2485	50
Устойчивость к 5 ПТП N1201	6,25
Устойчивость к 5 ПТП N3019	3,125
Устойчивость к 5 ПТП N3655	3,125
Устойчивость к 5 ПТП N3910	3,125
Устойчивость к 5 ПТП N1719	3,125
Устойчивость к 5 ПТП N1279	3,125
Устойчивость к 4 ПТП N3689	6,25
Устойчивость к 3 ПТП N5419	3,125
Устойчивость к 3 ПТП N779	1,56
Устойчивость к 3 ПТП N41	3,125
Устойчивость к 2 ПТП N1081	1,56

Тестирование показало, что средство по изобретению ингибировало рост всех лекарственно-устойчивых клинических изолятов:

- 14,3% (2 штамма) - в дозе 1,56 мкг/мл;

- 50,0% (7 штаммов) - в дозе 3,125 мкг/мл;

- 28,6% (4 штамма) - в дозе 6,25 мкг/мл;

- 7,1% (1 штамм) - в дозе 50,0 мкг/мл.

Необходимо отметить эффективность ингибирующего действия средства по изобретению в отношении штаммов, устойчивых к 5-6 противотуберкулезным препаратам, где МИК для 88,8% культур составляла 3,125-6,25 мкг/мл.

Таким образом, в результате проведенных исследований in vitro установлено, что средство по изобретению:

- имеет избирательную антимикробную активность, действуя только на жизнеспособность микобактерий туберкулеза;

- обладает выраженным противотуберкулезным действием как в отношении чувствительных, так и устойчивых штаммов МБТ.

1.2. Эффективность монотерапии средством по изобретению при экспериментальном туберкулезе у мышей

Исследование выполнено на 200 белых нелинейных мышах-самцах массой 18-20 г. У мышей штамм М. bovis bovinus 8 вызывал клиническую картину генерализованного туберкулеза, на 11-й день после инфицирования в легких визуализированы очаги специфического воспаления. С этого дня животным опытных групп начато введение исследуемых препаратов.

На 52-й день после заражения летальность в группе контроля (зараженные, нелеченные животные) составила 95,8% (таблица 4).

Средство по изобретению в дозе 10 мг/кг снизило летальность на 31,6%, а в дозах 20 мг/кг и 30 мг/кг - на 73,9% и на 97,5% соответственно (см. таблицу 4). Защитное действие средства по изобретению проявилось также и в виде уменьшения потери массы тела больных мышей. В дозе 10 мг/кг средство по изобретению сократило падение массы тела на 5,3%, а в дозах 20 мг/кг и 30 мг/кг - на 21,5% и на 19,0% (см. таблицу 4).

Таблица 4
Протективное действие средства по изобретению по показателям летальности и изменению массы тела мышей, зараженных М. bovis bovinus 8
№ гр.	Условия опыта	Летальность	Масса тела
%	ИЭ%	% от исходной	ИЭ%
2	зараженные нелеченные n=24	95,8	0	77,8	0
3	средство по изобретению 10 мг/кг, per os n=16	62,5	+31,6	81,9	+5,3
4	средство по изобретению 20 мг/кг, per os n=16	25,0	+73,9	94,5	+21,5
5	средство no изобретению 30 мг/кг, per os n=16	2,4	+97,5	92,6	+19,0
Примечание: ИЭ - индекс эффективности.

Таким образом, высокие протективные и терапевтические показатели средства по изобретению в условиях монотерапии мышей с экспериментальным туберкулезом характеризуют его как эффективное антимикобактериальное средство. Эти результаты соответствуют способности средства по изобретению подавлять рост тест-штамма М. bovis bovinus 8 in vitro (см. таблицу 1).

2. Эффективность монотерапии средства по изобретению при экспериментальном туберкулезе у кроликов

Исследование выполнено на 18 кроликах-самцах породы шиншилла, инфицированных в краевую ушную вену тест-штаммом М. bovis bovinus 8. Средство по изобретению начинали вводить животным (n=6) в день заражения в дозе 20 мг/кг перорально, длительность курса - 2 месяца.

Группы сравнения: зараженные нелеченные кролики (контроль заражения, n=6) и зараженные, леченные изониазидом (15 мг/кг, перорально, n=6). Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Таблица 5
Протективное действие средства по изобретению по показателям летальности и изменению массы тела кроликов, зараженных М. bovis bovinus 8
№ гр.	Условия опыта	Летальность	Масса тела
% (от исходного n)	ИЭ (%)	% от исходной	ИЭ (%)
1	Контроль заражения n=6	100	0	-27,6	---
2	Изониазид 15 мг/кг per os n=6	0	+100,0	-6,99	+74,67
3	Средство по изобретению 20 мг/кг per os n=6	0	+100,0	-7,13	+77,17

Как следует из данных таблицы 5, средство по изобретению эффективнее, чем изониазид, предотвращало гибель кроликов от туберкулезной инфекции, способствовало повышению их массы тела (в среднем на 77,17% против 74,67% для изониазида).

2.1. Влияние средства по изобретению на лечебный эффект противотуберкулезных препаратов при экспериментальном туберкулезе у мышей

Исследование выполнено на 250 белых нелинейных мышах-самцах. Проведена оценка 6 комбинаций средства по изобретению (20 мг/кг, перорально) с противотуберкулезными препаратами (ПТП), обладающими различной специфической активностью. В группах сравнения проводили монотерапию исследуемыми ПТП в средних терапевтических дозах. Лечение начинали во всех группах на 12-й день после инфицирования на фоне подтвержденного специфического воспалительного процесса в легких при вскрытии мышей из группы контроля заражения. Результаты опыта учитывали через 42 дня (6 недель) терапии.

Влияние средства по изобретению на терапевтическое действие ПТП по показателям пораженности органов варьировало в зависимости от свойств используемых препаратов (таблица 6). В зависимости от особенностей результата взаимодействия со средством по изобретению ПТП распределены на 3 группы.

Группа 1. ПТП, проявляющие синергидное взаимодействие со средством по изобретению (усиление лечебного эффекта по всем показателям пораженности органов):

- Изониазид - повышение терапевтической активности в среднем на 13,9% с вариацией от 3,6% (снижение коэффициента массы печени) до 25% (уменьшение массивности КОЕ в селезенке);

- Амикацин - увеличение эффективности в среднем на 11,34% с вариацией от 34,6% (снижение коэффициента массы селезенки, р<0,001) до 1,8% (уменьшение индекса поражения легких).

Группа 2. ПТП, у которых терапевтическая активность усиливается по большинству показателей пораженности (три из пяти):

- Рифампицин - прирост эффективности на 9,66% за счет снижения коэффициентов массы легких (на 18,2%, р<0,05), селезенки (на 34,6%, р<0,01) и печени (на 1,6%) при увеличении числа КОЕ на 6,19%;

- Рифабутин - прирост эффективности на 7,68% за счет уменьшения коэффициентов массы легких (на 12,4%) и селезенки (на 20,6%, р<0,05), снижения высеваемости МБТ из селезенки (на 13,2%), но при этом повышались два показателя - коэффициент массы печени и индекс поражения легких (на 0,4% и 7,4% соответственно);

- Этамбутол - прирост эффективности на 11,44% за счет уменьшения коэффициентов массы селезенки (на 22,1%), печени (8,9%) и числа КОЕ в селезенке (на 33,3%) при увеличении индекса поражения легких и их массы (на 4,0 и 3,1% соответственно).

Группа 3. Препараты, взаимодействующие со средством по изобретению преимущественно по типу антагонизма:

- Офлоксацин - снижение эффективности на 6,2% с вариацией показателей от 4,65 до 11,9%, за исключением индекса поражения легких с положительным лечебным эффектом в 2,6%.

Состояние фагоцитарной функции пМф в группах наблюдения представлено в таблице 7. Как видно из таблицы, средняя макрофагальная активность пМф при монотерапии средством по изобретению была на уровне интактных мышей (132,41 против 154,97). Активирующее действие средства по изобретению распространялось на те препараты, которые снижали эффективность фагоцитоза при монотерапии. Под влиянием средства по изобретению регистрировали активацию фагоцитоза в комплексе с 3 ПТП: рифампицином - в 1,4 раза (с 71,43 до 99,12), рифабутином - в 1,3 раза (с 66,88 до 83,55), офлоксацином - в 1,2 раза (с 95,14 до 111,66). У трех ПТП наблюдали снижение активности пМф при сочетанном применении со средством по изобретению. Так, уменьшение средней макрофагальной активности на фоне средства по изобретению отмечено у изониазида в 1,2 раза (с 77,66 до 66,54); у этамбутола - в 1,3 раза (со 106,35 до 81,95), у амикацина - в 2,8 раза (с 193,42 до 68,29).

Морфологические показатели в условиях моноприменения шести противотуберкулезных препаратов и в композиции со средством по изобретению приведены в таблице 7. По совокупности тестируемых показателей средство по изобретению способствовало уменьшению степени пораженности легочной ткани при сочетанном применении с рифампицином - на 16,9%, с изониазидом - на 10,1%, с офлоксацином - на 3,24%, с этамбутолом - на 3,19%, с амикацином - на 2,56%. Повышение показателей поврежденности легких отмечено только при совместном назначении средства по изобретению с рифабутином (на 15,9%).

Классификация ПТП по выраженности терапевтического действия на фоне средства по изобретению, учтенная по семи наиболее информативным тестам, установленным с помощью корреляционного анализа, представлена в таблице 8. Можно отметить три композиции с наибольшим положительным эффектом по семи тестам поражения (20 случаям). Из этого числа лидируют композиции рифабутин + средство по изобретению и рифампицин + средство по изобретению (в 7 случаях каждая). Реже встречаются композиции амикацин + средство по изобретению (в 4 случаях) и изониазид + средство по изобретению (в 2 случаях). Слабое действие отмечено в композициях средства по изобретению с офлоксацином и этамбутолом.

Таблица 7
Действие средства по изобретению на активность противотуберкулезных препаратов по данным морфологических повреждений
№ гр.	Лекарственные препараты	Сумма площадей в баллах
дышащая ткань легких	плотный лимфоцитарный инфильтрат	десквамативная пневмония	полиморфно-клеточный инфильтрат	общая легочная ткань
4	рифампицин	19,65	2,37	1,94	0	23,96
5	рифампицин + средство по изобретению	17,9	3,63	2,7	0	24,23
	% ПЭ	-8,9	+53,1	+39,2	0	+1,1
8	рифабутин	23,27	0,53	0,16	0	23,96
9	рифабутин + средство по изобретению	23,24	0,64	0	0	23,88
	% ПЭ	-0,13	+20,7	-100,0	-	-
6	изониазид	17,5	1,59	3,52	0,86	23,47
7	изониазид + средство по изобретению	19,23	3,01	1,81	0	24,05
	% ПЭ	+9,89	+89,3	-48,6	-	-
9	амикацин	17,7	3,12	2,94	0	23,76
10	амикацин + средство по изобретению	17,32	2,98	3,51	0,07	23,88
	% ПЭ	-2,1	-4,5	+19,4	-	-
12	этамбутол	9,78	6,8	6,93	0,27	23,78
13	этамбутол + средство по изобретению	14,49	4,65	4,68	0,14	23,96
	% ПЭ	+48, 14-5	-31,6	-32,5	-	-
14	офлоксацин	7,32	6,32	10,49	0,04	24,17
15	офлоксацин + средство по изобретению	8,95	3,47	11,18	0,42	24,02
	% ПЭ	+22,3	-45,1	+6,6	-	-

Таблица 8
Классификация ПТП в зависимости от выраженности терапевтического действия на фоне средства по изобретению
Тест поврежденности	Эффект ПТП на фоне средства по изобретению
потенцирование	ослабление
коэффициент массы легких	рифампицин	офлоксацин
амикацин
рифабутин	этамбутол
коэффициент массы селезенки	рифампицин	офлоксацин
амикацин
рифабутин	этамбутол
число КОЭ в селезенке	рифампицин	офлоксацин
амикацин
рифабутин
балл дышащей ткани легкого	рифабутин	офлоксацин
рифампицин	этамбутол
балл плотного лимфоцитарного инфильтрата	рифабутин	этамбутол
амикацин
рифампицин
балл десквамативной пневмонии	рифабутин	офлоксацин
изониазид	этамбутол
рифампицин

Подводя итоги, можно с уверенностью сказать, что средство по изобретению обладает выраженным, строго избирательным ингибирующим действием на жизнеспособность микобактерий туберкулеза, чувствительных и устойчивых к существующим противотуберкулезным препаратам. Средство по изобретению является малотоксичным веществом, не оказывает существенных структурно-функциональных нарушений жизненно важных органов и систем, а также раздражающего действия на слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта.

Средство по изобретению обладает умеренной эмбриотоксичностью, преимущественно при введении его в период органогенеза, действует избирательно в зависимости от индивидуальной восприимчивости к нему отдельных особей. Тератогенное действие средство по изобретению проявляет только в дозе 100 мг/кг (в пять раз превышающей терапевтическую) при введении в период органогенеза в виде увеличения нежизнеопасных аномалий скелета, замедления оссификации грудины и костей конечностей, а также появления отеков и подкожных кровоизлияний. Нарушений в развитии плаценты и сдвигов в формировании пола не происходит. Средство по изобретению при длительном введении животным не нарушает репродуктивную функцию, не влияет на качество развития потомства.

Средство по изобретению не проявляет аллергенных, иммунотоксических, мутагенных свойств.

Таким образом, учитывая вышеприведенные экспериментальные данные можно с уверенностью отметить, что технический результат заявленного изобретения заключается в создании нового лекарственного средства, обладающего повышенной туберкулостатической активностью (в 200 раз более высокой) и в 2,4 раза меньшей токсичностью, по сравнению с лекарственным средством по прототипу.

Кроме того, средство по изобретению в сочетании с другими ПТП (комбинации с рифабутином, рифампицином, изониазидом, амикацином и этамбутолом) способствовало увеличению терапевтической эффективности по сравнению с монотерапией средством по изобретению.