Антитела против il2

Антитела против il2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к антителам и их фрагментам, которые специфически связываются с человеческим цитокином IL2 (интерлейкин 2). Данное изобретение дополнительно относится к полинуклеотидам, кодирующим такие антитела и их фрагменты, к фармацевтическим композициям, содержащим их, и к медицинским применениям, включающим такие антитела и их фрагменты.

Человеческий IL2 представляет собой белок из 133 аминокислот (15,4 кДа), который не имеет значительной гомологии последовательности с какими-либо другими факторами. IL2 синтезируется как белок-предшественник из 153 аминокислот с первыми 20 аминоконцевыми аминокислотами, функционирующими в качестве гидрофобной секреторной сигнальной последовательности. Данный белок содержит одну дисульфидную связь (связывающую положения Cys58/105), существенную для биологической активности.

Биологические активности IL2 опосредованы мембранным рецептором, который экспрессируется почти исключительно на активированных, но не находящихся в стадии покоя (G_o), Т-клетках. Полный IL2-рецептор состоит из трех трансмембранных белковых субъединиц типа I: альфа, бета и гамма; функциональный рецептор с меньшей аффинностью может быть образован только бета- и гамма-рецепторными белками. В-клетки в стадии G_o и мононуклеарные лейкоциты в стадии G_o редко экспрессируют этот рецептор. Экспрессия IL2-рецeптора, в частности альфа-субъединицы, модулируется множеством факторов, например IL5, IL6 и фактором, индуцирующим L2R/p55.

Как мышиный, так и человеческий IL2 вызывают пролиферацию Т-клеток гомологичных видов с высокой эффективностью. Человеческий IL2 также является функциональным на мышиных клетках, но не наоборот. IL2 представляет собой фактор роста для всех субпопуляций Т-лимфоцитов. Он является фактором антиген-неспецифической пролиферации Т-клеток, который индуцирует прогрессию клеточного цикла в клетках в стадии G_o, и, таким образом, обеспечивает клональное размножение активированных Т-лимфоцитов. IL2 также стимулирует пролиферацию и дифференцировку активированных В-клеток. Как и в случае с пролиферацией Т-клеток, эта активность также требует присутствия дополнительных факторов, например IL4.

Благодаря этим эффектам на Т-клетки и В-клетки IL2 представляет собой центральный регулятор иммунных ответов. Центральное значение IL2 в инициации и усилении адаптивных иммунных ответов хорошо проиллюстрировано клинической эффективностью лекарственных средств, которые чаще всего используются для подавления нежелательных иммунных ответов как, например, при отторжении трансплантатов. Иммуносупрессивные лекарственные средства циклоспорин А и FK506 (такролимус) ингибируют продукцию IL2 путем нарушения сигнализации через Т-клеточный рецептор, тогда как рапамицин (сиролимус) ингибирует сигнализацию через IL2-рецептор. Циклоспорин А и рапамицин действуют синергично для ограничения иммунных ответов путем предотвращения размножения клонов Т-клеток, запускаемого IL2. Однако все эти соединения нацелены на внутриклеточные сигнальные пути, которые препятствуют не исключительно IL, но также и другим факторам. Это подразумевает, что клиническое применение этих лекарственных средств включает значительный риск нежелательных побочных эффектов из-за их ограниченной специфичности к мишени.

В данной области также известны многочисленные примеры антител-ингибиторов активности IL2, например, имеющееся в продаже антитело даклизумаб (Zenapax®, Protein Design Lab, Inc.). Однако известные антитела-ингибиторы активности IL2 оказывают свой биологический эффект путем связывания с IL2-рецептором, а не с самим антигеном. Принимая во внимание важные клинические применения ингибиторов активности IL2, целью настоящего изобретения является предложение альтернативных специфических ингибиторов активности IL2.

Соответственно согласно одному аспекту данного изобретения предложено гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с человеческим интерлейкином-2 (IL2), где указанное гуманизированное моноклональное антитело нейтрализует активность человеческого IL2 путем связывания с указанным человеческим IL2 до, во время и/или после связывания указанного человеческого IL2 с человеческим IL2-рецептором, и где вариабельная область легкой цепи указанного гуманизированного моноклонального антитела содержит в своей второй каркасной области последовательность смежных аминокислот КАРКА, предпочтительно в аминокислотных положениях 42-46.

Термины "гуманизированное моноклональное антитело", или "гуманизированное антитело", или "гуманизированный иммуноглобулин", или их грамматически родственные варианты в том виде, как они здесь используются, применяются взаимозаменяемо в отношении молекулы, содержащей антиген-связывающий сайт, происходящий из одного или более чем одного иммуноглобулина, не являющегося человеческим, причем указанная молекула дополнительно содержит по меньшей мере часть, например, по меньшей мере одну из каркасных областей вариабельного домена легкой или тяжелой цепи, происходящую из одного или более чем одного человеческого иммуноглобулина или их последовательностей зародышевой линии. Термин "гуманизированное антитело" в том виде, как он здесь используется, включает гуманизированный вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина и гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина. Гуманизированное антитело может включать константную область, частично или полностью происходящую (включая синтетические аналоги) из одной или более чем одной последовательности человеческого гена. Ожидается, что гуманизированное антитело будет связываться с тем же самым антигеном-мишенью, что и донорное антитело, которое обеспечивает CDR. Типично, все сегменты или участки гуманизированного антитела или иммуноглобулина, за исключением CDR, являются по существу идентичными или по существу гомологичными соответствующим сегментам или участкам встречающихся в природе или консенсусных последовательностей человеческих иммуноглобулинов.

Вариабельная область легкой цепи (VL) указанного гуманизированного моноклонального антитела содержит в своей второй каркасной области последовательность смежных аминокислот КАРКА, предпочтительно в аминокислотных положениях 42-46. Эта предпочтительная нумерация последовательности, т.е. положения 42-46, относится к нумерации, как изложено в базе данных "VBase" (© MRC Centre for Protein Engineering), доступной по адресу в Интернете http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk. Для ясности, выравнивания последовательностей каркасных VL-областей (таких как последовательности V-каппа и V-лямбда) и VH-областей зародышевой линии включены в настоящую заявку в том виде, как они находятся в Vbase (см. соответственно Фиг.7, 8 и 9; в частности, Фиг.8а и 9а в отношении нумерации вторых каркасных областей легких цепей в человеческих последовательностях V-каппа и V-лямбда зародышевой линии).

В то время как здесь приведена предпочтительная нумерация (т.е. положения аминокислот 42-46) аминокислотной последовательности КАРКА (т.е. Lys-Ala-Pro-Lys-Ala), для легкости корреляции с процитированной выше ссылкой следует понимать, что природа аминокислот в этой частичной последовательности, а не нумерация последовательности в ней и сама по себе последовательность, является определяющей для активности гуманизированного моноклонального антитела по изобретению. Как известно специалисту в данной области, существует множество способов нумерации последовательностей человеческих антител зародышевой линии, причем процитированная выше ссылка (VBase) представляет собой только один из них. Следовательно, частичной аминокислотной последовательности КАРКА, содержащейся во второй каркасной области некоторых вариабельных областей легкой цепи человеческой зародышевой линии, может быть приписана другая нумерация согласно иному способу нумерации, чем тот, который определен в приведенной выше ссылке. В таком случае частичная аминокислотная последовательность КАРКА несла бы нумерацию, отличную от положений предпочтительных аминокислот 42-46, тогда как последовательность, соответствующая предпочтительным аминокислотным положениям 42-46 при этом другом способе нумерации, вероятно, была бы аминокислотной последовательностью, отличной от КАРКА. В таком случае, как будет понятно специалисту в данной области, частичная аминокислотная последовательность с "правильной" последовательностью (КАРКА), но с отклоняющейся нумерацией (какой-либо другой, чем предпочтительные аминокислотные положения 42-46) должна рассматриваться как существенный отличительный признак данного изобретения, а не другая частичная аминокислотная последовательность, нумерация которой является "правильной" (предпочтительные аминокислотные положения 42-46), но природа которой является отличной от КАРКА.

Неожиданно обнаружили, что антитела или их фрагменты, не имеющие консенсусной последовательности КАРКА во второй каркасной области легкой цепи, в частности не имеющие в этом отрезке концевого остатка аланина, способны специфически связываться с IL2, но не способны нейтрализовать его активность. Это имеет место особенно, когда CDR-области, содержащиеся в вариабельных областях легкой и тяжелой цепей гуманизированного моноклонального антитела, являются такими, как представлено в SEQ ID NO 1-3 (соответственно для CDR 1-3 вариабельной области легкой цепи) и в SEQ ID NO 4-6 (соответственно для CDR 1-3 вариабельной области тяжелой цепи). Не будучи связанными теорией, авторы данного изобретения приписывают эту потерю нейтрализующей активности при исключении консенсусной последовательности КАРКА, в частности, при замещении концевого остатка аланина в этом отрезке другой аминокислотой, отличной от аланина, дестабилизации и/или конформационным перестройкам, оказывающим неблагоприятный эффект на нейтрализацию, но не на связывающую активность.

Термин "специфически связывает" или грамматически родственные выражения, такие как "специфическое связывание", "связывающий специфически", "специфический связыватель" и т.д. в том виде, как они здесь используются, относятся к способности гуманизированного моноклонального антитела или его фрагмента различать человеческий IL2 и любое количество других потенциальных антигенов, отличных от человеческого IL2, в такой степени, что из пула множества разных антигенов в качестве потенциальных партнеров связывания связывается или в значительной степени связывается только человеческий IL2. В пределах значения по данному изобретению человеческий IL2 "значительно" связывается, когда в пуле из множества в равной степени доступных разных антигенов в качестве потенциальных связывающих партнеров человеческий IL2 связывается по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно в 50 раз, наиболее предпочтительно в 100 раз или чаще (в кинетическом смысле), чем другие антигены, отличные от человеческого IL2. Как понятно обычному специалисту в данной области, такие кинетические измерения можно провести, например, на установке Biacore.

Гуманизированное антитело или его фрагмент по данному изобретению является моноклональным. Термин "моноклональное" в том виде, как он здесь используется, следует понимать как имеющий значение, обычно приписываемое ему в данной области, а именно антитело, которое распознает один эпитоп на связанном антигене. Этим оно отличается от поликлонального антитела, которое представляет собой набор отличающихся антител, связывающихся с одним и тем же антигеном, хотя и с разными эпитопами на этом антигене. По этой причине одна молекула антигена может одновременно связываться многими молекулами поликлонального антитела, специфического к этому антигену, но только одной молекулой конкретного моноклонального антитела, специфического к этому антигену; после связывания одной молекулой моноклонального антитела связанный эпитоп блокируется и, следовательно, больше не является доступным для связывания другой молекулой идентичного моноклонального антитела. Моноклональная природа антитела делает его особенно подходящим для применения в качестве терапевтического агента, так как такое антитело будет существовать в виде одиночных гомогенных молекулярных частиц, которые можно хорошо охарактеризовать, воспроизводимо получить и очистить. Эти факторы приводят к получению продукта, биологическую активность которого можно предсказать с высоким уровнем точности, что является очень важным фактором, если для такой молекулы собираются получить одобрение регулирующего органа для терапевтического введения млекопитающим, в частности людям.

Термин "нейтрализация", "нейтрализатор", "проведение нейтрализации" и его грамматически родственные варианты в том виде, как он здесь используется, относится к частичному или полному ослаблению биологического(их) эффекта(ов) IL2. Такое частичное или полное ослабление биологического(их) эффекта(ов) IL2 происходит в результате модификации, прерывания и/или отмены IL2-опосредованной сигнальной трансдукции, что проявляется, например, во внутриклеточной сигнализации, клеточной пролиферации, высвобождении растворимых веществ, в повышающей или понижающей регуляции внутриклеточной активации генов, например, которая приводит к экспрессии поверхностных рецепторов для лигандов, отличных от IL2. Как понятно специалисту в данной области, существует множество способов определения того, следует ли агент, например рассматриваемое антитело или его фрагмент, классифицировать как нейтрализатор. Обычно это можно осуществить стандартным тестом in vitro, который обычно проводят следующим образом. В первом эксперименте по пролиферации клеточную линию, для которой известно, что уровень ее пролиферации зависит от активности IL2, инкубируют в серии образцов с варьирующими концентрациями IL2, после чего измеряют уровень пролиферации данной клеточной линии. Из этого измерения определяют концентрацию IL2, которая обеспечивала полумаксимальную пролиферацию клеток. Затем проводят второй эксперимент по пролиферации с использованием в каждой серии образцов того же количества клеток, которое используется в первом эксперименте по пролиферации, концентрации IL2, определенной выше, и, на этот раз, варьирующих концентраций антитела или его фрагмента, которое, как подозревают, является нейтрализатором IL2. Снова измеряют пролиферацию клеток для определения концентрации антитела или его фрагмента, достаточной для осуществления полумаксимального ингибирования роста. Если получающийся график ингибирования роста относительно концентрации антитела (или его фрагмента) имеет сигмоидную форму, тогда осуществлялась некоторая степень антитело-зависимого ингибирования роста, т.е. активность IL2 была в некоторой степени нейтрализована. В таком случае данное антитело или его фрагмент следует рассматривать как "нейтрализатор" в контексте настоящего изобретения. Одним примером клеточной линии, для которой известно, что уровень ее пролиферации зависит от активности IL2, является клеточная линия CTLL-2, имеющаяся в продаже от LGC Promochem. Другим примером подходящей клеточной линии является NK92 (DSMZ).

Неожиданно, гуманизированное моноклональное антитело по изобретению нейтрализует активность человеческого IL2 путем связывания с указанным человеческим IL2 до, во время и/или после связывания указанного человеческого IL2 с человеческим IL2-рецептором. Этот способ нейтрализации является весьма неожиданным. Традиционно антитело-опосредованная нейтрализация биологической активности лиганда, где указанная биологическая активность зависит от связывания указанного лиганда с рецептором, осуществляется путем предотвращения образования такого лиганд-рецепторного комплекса. Согласно этому классическому сценарию нейтрализации нейтрализующее антитело связывает лиганд или рецептор в участке на границе контакта лиганда и рецептора. Таким образом, присутствие антитела стерически и/или электростатически предотвращает образование лиганд-рецепторного комплекса: лиганд-рецепторный комплекс не образуется, и биологическая активность, обычно приписываемая связыванию лиганда с его рецептором, не осуществляется.

Способ нейтрализации, наблюдаемый для гуманизированного моноклонального антитела по данному изобретению, резко отличается от этого классического сценария тем, что отмена биологической активности, обычно приписываемой IL2, не зависит от предотвращения образования комплекса между IL2 и его рецептором. Это означает, что биологическая активность IL2 отменяется независимо от того, был ли IL2 уже связан с IL2-рецептором или нет, подразумевая, что эпитоп, распознаваемый гуманизированным моноклональным антителом по изобретению, не располагается на участке IL2, который взаимодействует с IL2-рецептором. Нейтрализация IL2, как таковая, может быть достигнута гуманизированным моноклональным антителом по изобретению несколькими способами.

Согласно первому способу данное антитело связывается с IL2 в растворе перед образованием комплекса между IL2 и его рецептором, так что IL2-опосредованная трансдукция сигнала не происходит в случае, когда IL2 связывается с его рецептором.

Согласно второму способу данное антитело связывается с IL2 одновременно с образованием комплекса IL2 с его рецептором. Здесь одновременное образование тройного комплекса рецептор-IL2-антитело снова не приводит к какой-либо или по меньшей мере к какой-либо значительной трансдукции сигнала.

Согласно третьему способу IL2 уже образовал комплекс с его рецептором, и антитело связывается с IL2, в то время как IL2 находится в комплексе с его рецептором на поверхности клетки, несущей IL2-рецептор. По этому третьему сценарию любая IL2-опосредованная трансдукция сигнала, уже имеющая место до связывания IL2 антителом, отменяется, как только связывается антитело.

Такая неклассическая нейтрализация, т.е. нейтрализация в том виде, как она осуществляется гуманизированным моноклональным антителом по изобретению, является весьма неожиданной и имеет несколько терапевтических преимуществ.

Во-первых, поскольку гуманизированное моноклональное антитело по изобретению распознает эпитоп IL2, который не принимает непосредственного участия в контакте с IL2-рецептором, между терапевтическим антителом, с одной стороны, и IL2-рецептором, с другой стороны, не возникает конкуренции. Эффект состоит в том, что пациенту можно вводить более низкие концентрации терапевтического антитела, чем было бы возможно в ином случае, если бы между антителом и IL2-рецептором существовала конкуренция за связывание одного и того же эпитопа. Это эффективно увеличивает терапевтическую эффективность гуманизированного моноклонального антитела по изобретению, так как можно уменьшить вводимую концентрацию (относительно той, которая требуется при условии классического способа нейтрализации) без потери биологического эффекта. Введение меньшего количества терапевтического агента является весьма желательным не только с точки зрения переносимости пациентом, но также и с экономической точки зрения, так как ценовое бремя данной терапии снижается или, с другой стороны, большее число пациентов может получить пользу от данного количества терапевтического антитела.

Во-вторых, как упомянуто выше, способность гуманизированного моноклонального антитела по изобретению связываться с IL2 и нейтрализовать его биологическую активность уже в комплексе с его рецептором имеет огромное преимущество в том, что уже происходящая IL2-опосредованная трансдукция сигнала может быть выключена без необходимости первоначальной диссоциации IL2 от его рецептор-связывающего партнера. Конечный эффект этого состоит в том, что желательная нейтрализующая биологическая активность гуманизированного моноклонального антитела по изобретению реализуется in vivo более быстро, чем это возможно для других "классических" антител-нейтрализаторов, которые сначала должны конкурировать с IL2-рецептором за связываемый эпитоп на IL2 перед тем, как вызвать какой-либо терапевтический эффект. Эта скорость действия может быть особенно полезной при острых сценариях, таких как иммунное отторжение трансплантатов органов, которое является известной областью для анти-IL2 терапии.

Третье преимущество такого нетипичного способа нейтрализации, как описано выше, относится к тому факту, что IL2-рецепторы локализуются на поверхности Т-клеток. Т-клетки сами продуцируют IL2 и также отвечают на IL2 пролиферацией, потенцируя тем самым свою собственную пролиферацию. При некоторых острых воспалительных реакциях, таких как отторжение ткани после операции по трансплантации, желательно не только снизить величину воспалительной реакции, приписываемой существующим Т-клеткам, но также уменьшить количество Т-клеток, генерирующих иммунный ответ. Гуманизированное моноклональное антитело по изобретению является особенно эффективным в достижении этой цели. Как было объяснено выше, биологическая активность IL2, уже связанного с его рецептором на поверхности Т-клетки, будет отменяться. Однако после такой отмены гуманизированное моноклональное антитело по изобретению обычно будет оставаться связанным с IL2 (который сам связан с IL2-рецептором) в течение некоторого периода времени, программируя, таким образом, Т-клетку на разрушение посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности ("ADCC", antibody-dependent cellular cytotoxicity). При ADCC клетка-мишень, которая покрыта иммуноглобулином, убивается эффекторной клеткой с Fc-рецепторами, распознающими Fc-участок иммуноглобулина, покрывающего клетку-мишень. В большинстве случаев эффекторные клетки, участвующие в ADCC, представляют собой натуральные киллеры ("NK", natural killer), которые несут на своей поверхности, среди прочих, Fc-рецептор Fc-гамма-RIII. Таким образом, убиваются только клетки, покрытые иммуноглобулином, так что специфичность убийства клеток прямо коррелирует со специфичностью связывания антитела. Тогда в контексте настоящего изобретения Т-клетки, которые декорированы гуманизированным моноклональным антителом по изобретению через IL2 в комплексе с его рецептором, становятся клетками-мишенями в упомянутом выше смысле, которые затем лизируются, среди прочих, NK-клетками. Данный эффект является быстрым и эффективным ослаблением иммунного ответа, приписываемого клеткам, несущим IL2-рецепторы, таким как Т-клетки.

Согласно одному воплощению данного изобретения по меньшей мере одна из первой, третьей и/или четвертой области(ей) каркасной области легкой цепи, содержащейся в человеческом моноклональном антителе или его фрагменте, соответствует(ют) человеческой последовательности зародышевой линии для этой области/этих областей.

Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела или его фрагмента по изобретению содержит в ее CDR1-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела или его фрагмента по изобретению содержит в ее CDR2-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела или его фрагмента по изобретению содержит в ее CDR3-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела или его фрагмента по изобретению дополнительно содержит в ее CDR1-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, в ее CDR2-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и в ее CDR3-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит в ее CDR1-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит в ее CDR2-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5. Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит в ее CDR3-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6.

Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит в ее CDR1-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, в ее CDR2-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, и в ее CDR3-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6.

Согласно другому воплощению данного изобретения вариабельная область легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела или его фрагмента по изобретению дополнительно содержит в ее CDR1-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, в ее CDR2-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и в ее CDR3-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, и вариабельная область тяжелой цепи содержит в ее CDR1-области аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, в ее CDR2-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, и в ее CDR3-области - аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6. Было обнаружено, что эти CDR-области являются особенно полезными при связывании с IL2 и нейтрализации биологического эффекта IL2 способом, описанным выше.

Согласно другому воплощению данного изобретения аминокислотная последовательность первой каркасной области легкой цепи, остальные аминокислотные последовательности второй каркасной области легкой цепи и аминокислотная последовательность третьей каркасной области легкой цепи соответствуют любой из последовательностей подгруппы VKI человеческой зародышевой линии в локусах O12, O2, O18, O8, А30, L1, L15, L4, L18, L5, L19, L8, L23, L9, L11 или L12; или подгруппы VL1 человеческой зародышевой линии в локусе 1а; или любой из последовательностей подгруппы VL2 человеческой зародышевой линии в локусах 2с, 2е, 2а2 или 2b2. В этом воплощении выражение "остальные аминокислотные последовательности второй каркасной области легкой цепи" относится к тем аминокислотам во второй каркасной области легкой цепи, которые отличаются от последовательности КАРКА. Таким образом, при использовании нумерации базы данных Vbase выражение "остальные аминокислотные последовательности второй каркасной области легкой цепи" означает аминокислоты в положениях второй каркасной области легкой цепи 35-41 и 47-49 включительно, независимо от того, является ли каркасная область этой легкой цепи V-каппа или V-лямбда каркасной областью (см. Фиг.7а и 8а в отношении нумерации последовательностей человеческой зародышевой линии, относящихся соответственно к каркасной области V-каппа и V-лямбда). Предпочтительным в этом воплощении является дополнительное включение в четвертую каркасную область легкой цепи последовательности, соответствующей последовательности, обнаруженной в последовательности JK4 человеческой зародышевой линии, в частности FGGGTKVEIK.

Другие аминокислотные последовательности, подходящие для применения в качестве четвертой каркасной области легкой цепи, включают, но не ограничиваются FGQGTKVEIK, FGQGTKLEIK, FGPGTKVDIK, FGQGTRLEIK, FGTGTKVTVL, FGGGTKLTVL и FGGGTQLTVL.

Согласно другому воплощению по меньшей мере одна из первой, второй и/или третьей каркасной области(ей) тяжелой цепи, содержащейся в человеческом моноклональном антителе или его фрагменте, соответствует последовательности этой области/этих областей в человеческой зародышевой линии.

Согласно другому воплощению аминокислотная последовательность первой каркасной области тяжелой цепи, аминокислотная последовательность второй каркасной области тяжелой цепи и аминокислотная последовательность третьей каркасной области тяжелой цепи соответствует любой из последовательностей подгруппы VH3 человеческой зародышевой линии, в частности в локусе 3-07, где аминокислотная последовательность первой каркасной области тяжелой цепи представляет собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS, аминокислотная последовательность второй каркасной области тяжелой цепи представляет собой WVRQAPGKGLEWVA, и аминокислотная последовательность третьей каркасной области тяжелой цепи представляет собой RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR. Предпочтительно можно выбрать аминокислотную последовательность четвертой каркасной области тяжелой цепи, например, в комбинации с тремя каркасными последовательностями, процитированными выше, в локусе 3-07 зародышевой линии из одной из следующих последовательностей: WGQGTLVTVSS, WGRGTLVTVSS, WGQGTMVTVSS, WGQGTLVTVSS, WGQGTLVTVSS и WGQGTTVTVSS.

В предпочтительном воплощении гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7 и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8. Особенно предпочтительным является гуманизированное моноклональное антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10. Далее гуманизированное антитело IgG1 против IL1, содержащее SEQ ID NO 9 и 10 и/или SEQ ID NO 7 и 8, будет именоваться "Aнтн-IL2".

Данное гуманизированное моноклональное антитело может находиться в форме антитела IgG, в частности антитела IgG1 или IgG4. Как хорошо известно в данной области, IgG содержит не только вариабельные области антитела, ответственные за высокоизбирательное распознавание и связывание антигена, но также и константные области тяжелой и легкой полипептидных цепей антитела, обычно присутствующие в эндогенно продуцируемых антителах, и, в некоторых случаях, даже декорирование в одном или более чем одном сайте углеводами, причем такое гликозилирование обычно присутствует на Fc-участке IgG. Известно, что эти Fc-участки вызывают разные эффекторные функции in vivo, такие как ADCC и комплемент-зависимую цитотоксичность ("CDC"). Механизм ADCC описан здесь выше. При CDC два идентичных иммуноглобулина связываются с двумя идентичными антигенами (например, в данном случае с IL2 на Т-клетке) на поверхности клетки-мишени, так что их соответствующие Fc-участки находятся очень близко друг к другу. Этот сценарий вовлекает белки комплемента, среди них белки комплемента, например C1q, С3, С4 и С9, последний из которых создает пору в клетке-мишени. Клетка-мишень погибает в результате этой перфорации. В то же время клетка(и)-мишень(и) также станови(я)тся декорированными в других участках на ее/их поверхности(ях). Это декорирование вовлекает эффекторные клетки, которые затем убивают клетку(и)-мишень(и) способом, аналогичным способу, описанному выше в контексте механизма ADCC (см., например, Gelderman et al. (2004), Trends Immunology 25, 158-64).

Предпочтительно антитело IgG представляет собой антитело IgG1 или антитело IgG4, форматы, которые являются предпочтительными, так как их механизм действия in vivo является особенно хорошо понятым и охарактеризованным. Это особенно верно для антител IgG1.

Согласно другому воплощению данного изобретения фрагмент гуманизированного моноклонального антитела может представлять собой scFv, однодоменное антитело, Fv, диатело, тандемное диатело, Fab, Fab′ или F(ab)2. Эти форматы обычно можно подразделить на два подкласса, а именно на подкласс форматов, которые состоят из одной полипептидной цепи, и на подкласс форматов, которые содержат по меньшей мере две полипептидные цепи. Члены первого подкласса включают scFv (включающий одну VH-область и одну VL-область, соединенные в одну полипептидную цепь посредством полипептидного линкера); и однодоменное антитело (включающее один вариабельный домен антитела, который специфически связывает человеческий IL2). Члены последнего подкласса включают Fv (включающий одну VH-область и одну VL-область в виде отдельных полипептидных цепей, которые нековалентно связаны друг с другом); диатело (включающее две нековалентно связанные полипептидные цепи, каждая из которых содержит две вариабельные области антитела - обычно одну VH и одну VL на полипептидную цепь - и организованные так, что при нековалентной связи VH на одной полипептидной цепи с VL на соответствующей другой полипептидной цепи и наоборот образуется молекула двухвалентного антитела); тандемное диатело (биспецифические одноцепочечные Fv-антитела, содержащие четыре ковалентно связанные вариабельные иммуноглобулиновые VH- и VL-области двух разных специфичностей, образующие гомодимер, который в два раза больше, чем диатело, описанное выше); Fab (содержащий в качестве одной полипептидной цепи целую легкую цепь антитела, которая сама по себе содержит VL-область, и целую константную область легкой цепи и в качестве другой полипептидной цепи часть тяжелой цепи антитела, содержащую целую VH-область, и часть константной области тяжелой цепи, причем две указанные полипептидные цепи связаны между собой посредством межцепьевой дисульфидной связи); Fab' (такой же, как и Fab, описанный выше, за исключением того, что на тяжелой цепи антитела содержатся дополнительные восстановленные дисульфидные связи); и F(ab)2 (содержащий две молекулы Fab', причем каждая молекула Fab' связана с соответствующей другой молекулой Fab' посредством межцепочечных дисульфидных связей). В общем, фрагменты антитела описанных здесь выше типов обеспечивают большую гибкость в формировании, например, фармакокинетических свойств антитела, желательного для терапевтического введения, в соответствии с конкретными имеющимися запросами. Например, может быть желательным уменьшение размера введенного антитела для того, чтобы увеличить степень проникновения в ткань при лечении тканей, для которых известно, что они являются слабо васкуляризованными (например, суставы). В некоторых обстоятельствах также может быть желательным увелические скорости, с которой терапевтическое антитело устраняется из организма, причем указанная скорость обычно ускоряется путем уменьшения размера вводимого антитела.

Согласно другому воплощению данного изобретения гуманизированное моноклональное антитело может присутствовать в одновалентной моноспецифической или многовалентной моно- или мультиспецифической, в частности, в двухвалентной моно- или биспецифической формах. В общем, многовалентное моноспецифическое, в частности двухвалентное моноспецифическое антитело, может давать терапевтическое преимущество в том, что нейтрализация, осуществляемая таким антителом, усиливается эффектами авидности, т.е. связыванием многих молекул одного и того же антигена, здесь человеческого IL2, одним и тем же антителом. Несколько одновалентных моноспецифических форм антитела по изобретению было описано выше (например scFv, Fv или однодоменное антитело). Многовалентные мультиспецифические, в частности двухвалентные, биспецифические формы гуманизированного моноклонального антитела против человеческого IL2 по изобретению могут включать целый IgG, в котором один связывающий домен связывается с человеческим IL2, тогда как другой связывающий домен связывается с другим антигеном, отличным от человеческого IL2. Другой многовалентной мультиспецифичной, в частности двухвалентной, биспецифической формой преимущественно может быть гуманизированное одноцепочечное биспецифическое антитело, т.е. конструкция рекомбинантного гуманизированного антитела, содержащая две структуры scFv, как описано выше, соединенные в одну непрерывную полипептидную цепь коротким полипептидным спейсером между двумя указанными структурами scFv, как известно в данной области. Здесь один scFv-участок биспецифического одноцепочечного антитела, содержащийся в данном биспецифическом одноцепочечном антителе, будет специфически связывать человеческий IL2, как изложено выше, тогда как другой соответствующий scFv-участок этого биспецифического одноцепочечного антитела будет связывать другой антиген, для которого определено, что он будет иметь терапевтическую пользу.

Согласно другому воплощению из гуманизированного моноклонального антитела или его фрагмента может быть получено производное, например, с