Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности субкомпонентов c1r2s2 первого компонента комплемента человека

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности субкомпонентов c1r2s2 первого компонента комплемента человека

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Субкомпоненты C1r и C1s, синтезируемые в организме в равных количествах и представляющие собой зимогены протеиназ, образуют прочный Ca-зависимый тетрамерный комплекс C1r₂s₂, связанный с субкомпонентом C1q также Ca-зависимым образом и формирующий с ним компонент C1. При связывании C1 с иммунным комплексом происходит активация протеиназ C1r и C1s. Активация этих ферментов - существенный этап инициации каскада активации комплемента по классическому пути, поэтому их функциональный дефицит может быть причиной различного рода патологических состояний организма.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонентов C1r₂s₂ [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия для сорбции на иммуноглобулине только субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс C1r₂s₂ с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5) в качестве источника компонентов С4, С2 и С3. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание C3b на сорбированном иммуноглобулине в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1r₂s₂. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом.

Недостатком этого способа является трудность получения иммунохимически чистых препаратов иммуноглобулина G человека и плохое сохранение активирующей способности при хранении.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность комплекса C1r₂s₂ комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемый в обычных условиях, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для сорбции на деринате только субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс C1r₂s₂ с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5) в качестве источника компонентов С4, С2 и С3. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание C3b в лунках микропанели в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1r₂s₂. Количество связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Тем самым достигается определение функциональной активности C1r₂s₂ иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности комплекса C1r₂s₂ комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.

Пример 1. Определение функциональной активности субкомпонентов C1r₂s₂ первого компонента комплемента человека. Аптечный препарат дерината в 0,15 М NaCl в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4 (VBSE), содержащим 0,15 М NaCl, 50 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBSE и 1,25 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C и отмывки вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²*), в лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора VBS²⁺, содержащего 15 мкл псевдоглобулиновой фракции сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5 - реагент R1) и анализируемую пробу, содержащую комплекс C1r₂s₂ с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т) и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность C1r₂s₂ рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности субкомпонентов C1r₂s₂ первого компонента комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом и C1q морской свинки, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R1, субстратный буфер и стандарт с известной активностью C1r₂s₂.

Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от активности C1r₂s₂ с коэффициентом корреляции R²=0,995, что позволяет достоверно определять функциональную активность C1r₂s₂ описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

Козлов Л.В., Колесникова Е.А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности субкомпонентов C1r₂s₂ первого компонента комплемента человека. Патент РФ 2251698. Бюл. № 13. 10.05.2005.

1. Способ определения функциональной активности субкомпонентов C1r₂s₂ первого компонента комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесение раствора, содержащего сыворотку морской свинки и этилендиамин-тетраацетат натрия, затем после инкубации и осушения планшета внесение анализируемой пробы, содержащей комплекс C1r₂s₂ комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновой фракции сыворотки крови человека, получаемой диализом против дистиллированной воды, (R1), а также буферного раствора, содержащего ионы кальция и магния, проведение инкубации и после отмывки и осушения планшета внесение в лунки конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрата этого фермента, проведение расчета активности субкомпонентов C1r₂s₂ по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат.

2. Набор для определения функциональной активности субкомпонентов C1r₂s₂ первого компонента комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом и C1q морской свинки, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R1, субстратный буфер и стандарт с известной активностью C1r₂s₂.