Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности

Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретения относится к медицине, трансплантологии, клеточной трансплантологии, могут быть использованы при коррекции и лечении печеночной недостаточности. Предлагаемые способ и трансплантат могут быть использованы в специализированных отделениях, занимающихся лечением и коррекцией печеночной недостаточности.

Известен способ лечения печеночной недостаточности, основанный на использовании суспензии изолированных ксеногенных гепатоцитов в экстрокорпоральной системе «вспомогательная печень», через которую перфузируется кровь реципиента с пораженной печенью (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).

Изолированные гепатоциты в таких системах, будучи ксеногенными, способны в организме больного лишь кратковременно осуществлять детоксикационные и синтетические функции. В то же время способность суспензии изолированных гепатоцитов выделять регуляторные пептиды, стимулирующие процессы регенерации в пораженной печени реципиента, пролонгирована до 0,5-8 часов (Шумаков В.И. и др. Лечение тяжелой печеночной недостаточности перфузией крови больного через взвесь криоконсервированных гепатоцитов // Хирургия. - 1990. - №2. - с.113-116).

Известен другой способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались микрофрагменты ткани печени, что позволило пролонгировать метаболическую активность гепатоцитов, содержащихся в микрофрагментах до 24-34 и даже до 48 часов (Соловьев В.В., Онищенко Н.А., Акатов B.C., Лежнев Э.И. Функциональная активность гепатоцитов в фрагментах печени in vitro: зависимость от размеров фрагментов и длительности их культивирования // Бюлл. Экспер. Биол. и Мед., - 1997. - №10. - с.406-408). Увеличение сроков метаболической активности гепатоцитов в составе микрофрагментов происходит за счет сохранения в них межклеточных контактов и естественного межклеточного геля, а так же из-за сохранения пространственной структуры ткани печени, в результате чего оптимизируются условия функционирования всех типов клеток, в том числе и гепатоцитов.

Также известен способ лечения печеночной недостаточности, предполагающий для пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов в перфузионных биореакторах использовать изолированные гепатоциты с микроносителями (используют, например, цитодекс-3 при соотношении 1,6 г микроносителя на 1×10⁹ клеток), которые предварительно покрывают коллагеном (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J.gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl. 208. - p.111-117; Chen S., Eguchi S. Watanabe Hepatic support strategies // Transplant. Proc. - 1996. - 28, №4. - р.2036-2038).

Также известен способ лечения печеночной недостаточности, предполагающий использующий новые экстракорпоральные системы, заполненные коллагеновым гелем с гепатоцитами (Naka S., Takeshita K., Yamamoto Т. Bioartificial liver support system using porcine hepatocytes entrapped in a three-dimensional hollow fiber module with collagen gel: an evaluation in the swine acute liver failure model // Artif. Organs. - 1999. - V.23. - P.822-828).

Также известен способ лечения и коррекции печеночной недостаточности путем внутримышечной имплантации пула изолированных гепатоцитов в микро- или макрокапсулах (Hunkeler D., Cherrington A., Prokop A., Rajotte R. Bioartificial Organs III. Tissue Sourcing, Immunoisolation, and Clinical Trials // Annals of the New York. Academy of Sciences. - N.Y., 2001. - V.944).

В качестве прототипа нами выбран известный способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались изолированные гепатоциты для вспомогательной поддержки печени и, соответственно, восполнения дезинтоксикационной и биорегуляторной функции поврежденной печени (Van de Kerkhove M.P., Hoekstra R., Chamuleau R.A., van Gulik T.M. Clinical application of bioartificial liver support systems // Ann. Surg. - 2004. - Vol.240. - P.216-230).

К недостаткам использования известных способов, в том числе и прототипа, предпологающих использование экстракорпорального биореактора с микрофрагментами ткани печени или изолированными гепатоцитами относятся:

- необходимость использования специальных измельчителей для получения фрагментов заданного размера, повышающих опасность инфицирования донорского материала;

- необходимость использования перфузионных систем и включения в перфузионный контур дополнительных технических узлов для оксигенации и детоксикации крови (плазмы), поступающих к микрофрагментам ткани печени, что повышает экономическую себестоимость метода;

- необходимость использования в биореакторах микрофрагментов в смеси с частицами пористого биосовместимого носителя для предотвращения слипания микрофрагментов и обеспечения эффективного массопереноса;

- использование частиц пористого носителя не создает условий для предотвращения отсроченной гибели гепатоцитов в микрофрагментах, т.к. при увеличении сроков культивирования микрофрагментов из-за низкой скорости пролиферации гепатоцитов начинает формироваться монослой из быстро прикрепляющихся и пролиферирующих стромальных клеток, окутывающих местные ткани печени и затрудняющих их функционирование;

- необходимость использования ксеногенного материала, что повышает угрозу переноса опасных инфекций и служит фактором избыточной активации иммунной системы реципиента с сокращением срока функционирования этого материала;

- раннее прекращение (через 1-2 дня) метаболических и регуляторных функций гепатоцитов;

- необходимость регулярно осуществлять сеансы подключения перфузионных систем «биоискусственная печень»;

- невозможность создания трехмерной структуры, сходной по архитектонике с тканью печени.

Известно устройство для лечения печеночной недостаточности методом экстракорпорального подключения изолированных гепатоцитов (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J.Gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl.208. - p.111-117). Также известно устройство, предназначенное для лечения печеночной недостаточности, позволяюшее увеличивать сроки жизнеспособности изолированных гепатоцитов (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).

В качестве прототипа предлагаемого трансплантата для лечения печеночной недостаточности нами выбрано интракорпоральный трансплантат (биомодуль) «вспомогательная печень» (Uyama S., Kaufman P., Kneser U., Vacanti J., Rodriges X. Hepatocyte transplantation using biodegradable matrices in ascorbic acid-deficient rats: comparsion with heterotropically transplanted liver grafts // Transplantation. - 2001. - Vol.7. - P.1-7).

К недостаткам использования известных устройств, в том числе и прототипа, предпологающих использование биомодулей с изолированными гепатоцитами относятся:

- выраженная воспалительная реакция на трансплантат;

- гибель большого количества изолированных гепатоцитов;

- низкая плотность прикрепления клеток печени;

- дороговизна матрикса-носителя.

Задачей изобретения является разработка способа, повышающего эффективность коррекции и лечения печеночной недостаточности за счет пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов и выполнения ими функциональной и органоспецифической активности путем трансплантации долгосрочно функционирующего интракорпорального трансплантата типа «вспомогательная печень».

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретений, заключается в коррекции и лечении печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными гепатоцитами детоксикационной функции, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов печени и/или сосудов брыжейки и сосудов, проросших в каркас, к иммобилизированным печеночным клеткам и клеткам костного мозга; а также в профилактике осложнений, связанных с тромбообразованием и клеточной инфильтрацией в месте трансплантации трансплантата с клеточным материалом.

Достоинствами предложенных способа и трансплантата для лечения печеночной недостаточности, позволяющих, по существу, создать интракорпоральную систему «вспомогательная печень» для длительного поддержания в функциональном состоянии изолированных гепатоцитов являются:

- отсутствие необходимости применения сложных перфузионных систем;

- создание с помощью гетерогенного геля культуральных условий для пролиферации клеток и формирования «тканеподобной» структуры;

- создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости и прорастания сосудов через гель, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток;

- использование аллогенных клеток, которые позволяют этой системе оказывать в организме длительное биорегуляторное воздействие.

В предлагаемых изобретениях не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован клеточный материал взрослых доноров.

Этот способ способствует более быстрой интеграции трансплантата в систему кровообращения после трансплантации и поддержания метаболизма и жизнедеятельности клеток за счет доставки по вновь образованным и проросшим сосудам кислорода; создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток. Использование антикоагулянтов и антиагрегантов сразу после трансплантации тормозит клеточную реакцию на трансплантат как инородное тело и препятствует тромбообразованию в месте трансплантации. Использование иммуносупрессантов препятствует отторжению трансплантата.

Сущность изобретений заключается в следующем.

Для лечения печеночной недостаточности используют изолированные клетки печени донора. Осуществляют забор аллогенных прогениторных клеток костного мозга у донора. Затем осуществляют забор аллогенных клеток печени у донора. Выполняют посадку свежевыделенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга на гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель. Размеры пор гетерогенного геля варьируют от 30 до 500 мкм. Суммарная пористость гетерогенного геля составляет 50-98%. Суммарная концентрация клеток печени и костного мозга составляет 2×10⁶ - 15×10⁶ клеток на 1 см³ геля. При этом соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4. Причем общий объем геля не менее 0,1 мл. Наименьший объем геля должен быть не менее 0,2 мм. Трансплантацию гетерогенного геля с аллогенными клетками печени и костного мозга производят в паренхиму поврежденной печени и/или в брыжейку тонкой кишки.

В частном случае сразу после трансплантации назначают антикоагулянты в профилактической дозе. Доза составляет: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например, трентал из расчета 45 мг/м² поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.

В частном случае сразу после трансплантации назначают иммуносупрессанты в профилактической дозе. Доза составляет: хорионический гонадотропин 500-5000 ME 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.

Предлагаемый трансплантат для лечения печеночной недостаточности включает гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель и посаженные на него аллогенные клетки костного мозга и аллогенные клетки печени. Общий объем гетерогенного геля не менее 0,1 мл. Размеры пор гетерогенного геля 30-500 мкм, суммарная пористость 50-98%. Концентрация клеток печени и костного мозга 2×10⁶ - 15×10⁶ клеток на 1 см³ гетерогенного геля и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4.

Предлагаемые способ и трансплантат позволяют пролонгировано корригировать острую или хроническую печеночную недостаточность за счет прологнирования функционирования изолированных гепатоцитов. Трансплантация аллогенных клеток с последующим применением иммуносупресантов позволяет исключить осложнения, связанные с реакцией отторжения. Предлагаемая группа изобретений позволяет также:

1. создавать условия для прикрепления изолированных клеток печени и клеток костного мозга на гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель, активизирует их пролиферацию, которая поддерживается диффузией в гель питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови и плазмы, притекающей к гелю из сосудов печени или брыжейки;

2. создать каркас, на основе гетерогенных биосовместимых биодеградируемых гелей, имитирующий пространственную структуру для прикрепления клеток донорской печени и прогениторных клеток костного мозга, а также условия для прорастания в этот каркас сосудов, питающих прикрепленные клетки;

3. создать условия, препятствующие клеточной инфильтрации трансплантата и поддерживающие его клетки в жизнеспособном состоянии за счет использования антикоагулянтов и антиагрегантов;

4. создать условия, препятствующие отторжению трансплантата и поддерживающие его клетки в жизнеспособном состоянии за счет использования иммуносупрессантов.

Способ осуществляется следующим образом и включает в себя несколько последовательных этапов.

1) Выделение аллогенных прогениторных клеток костного мозга.

Выделение прогениторных клеток костного мозга у донора осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов // Вестник трансплантации и иск. органов 2002, 4, с.3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций // Москва, Лавр. 2009. - с.61-67). Пунктируют подвздошную кость донора и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хенкса, содержащим 200 мкг/мл гентамицина; 10,0 мкг/мл инсулина; 0,25 мкМ дексамезатона; 250 ед/мл гепарина. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH₄Cl; 7,5 мМ KHCO₃; 100 мкМ EDTA), в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата, в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде.

2) Выделение аллогенных клеток печени.

Производят резекцию 2-4×2-4×1-2 см ткани печени у доноров для получения клеток печени. Выделение аллогенных клеток печени осуществляют по традиционной методике (Seglen О. Preparation of isolated rat liver cells // Methods. Cell. Biol. 1976. - vol.13. - p.29-83; Fontaine M., Schloo B., Jenkins R., Uyama S., Hansen L., Vacanti J.P. Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs // Pediatr. Surg. - 1995. - vol.30(1). - p.56-60; Hang H., Shi X., Gu G., Wu Y., Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int. J. Artif. Organs. 2009 Oct; 32(10):720-7; Lehec S.C., Hughes R.D., Mitry R.R., Graver M.A, Verma A., Wade J.J., Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation // Cell Transplant. 2009; 18(8):941-947).

Выделение аллогенных клеток печени производят из резецированного участка печени путем 3-кратной отмывки кусочка печени от крови и измельчения его на холоде (t=4°С) в чашке Петри, с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция [1000 мл дистиллированной воды, 8,3 г NaCl, 0,5 г KCl, 2,38 г HEPES, pH 7,4, 37°С] в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени инкубируются 3 раза раствором коллагеназы [1000 мл дистиллированной воды, 8,3 г NaCl, 0,5 г KCl, 0,7 г CaCl₂, 2,38 г HEPES, 7,5 мг ингибитор трипсина и 500 мг коллагеназы Тип IV-S (>125 CDU/mg), pH 7,3; 37°С] в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносят на сито с ячейками 200 мкм и фильтруют промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию отдельных клеток и небольших агрегатов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в такой же свежей среде и опять центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Жизнеспособность клеток оценивают методом окрашивания трипановым синим. Добиваются получения количества клеток в пределах от 3,0×10⁸ до 4,0×10⁸ гепатоцитов на 12-15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия должна содержать: гепатоциты, непаренхиматозные клетки печени, которые определяют при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполняют. Взвесь клеток печени концентрируют в 1-2 мл физ. р-ра.

3) Посадка (иммобилизация) аллогенных клеток печени и аллогенных клеток костного мозга на гетерогенный гель.

Посадку (иммобилизацию) клеточного материала осуществляют по традиционной методике (Mooney D.J., Sano K., Kaufinann P.M., Majahod K., Schloo В., Vacanti J.P., Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted о biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res. - 1997. - Vol.5. - P.413-420).

Аллогенные клетки печени и аллогенные прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×10⁶ клеток печени/мл и 2,0-4,0×10⁶ прогениторных клеток клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию в концентрации 2×10⁶-15×10⁶ на 1 см³ аккуратно смешивали с гетерогенным гель в соотношении 1:1, до равномерной консистенции, набирали в шприц и хранили до введения в печень и/или брыжейку при 4°С не более 5 часов.

В качестве гетерогенного геля может быть использован, например, биоматериал, «СфероГЕЛЬ», изготовленный на основе коллагена сельскохозяйственных животных (70%) и коллагенсодержащего экстракта (30%), имеющего вид плотного желеобразного вещества.

Гетерогенные гели используют как элемент экстракорпоральных систем, для инкапсуляции различных типов клеток (β-клетки, гепатоциты, генетически измененные клетки, стволовые клетки) и факторов роста и др. (Shoichet M.S., Li R.H., White M.L. et al. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose // Biotechnol. Bioeng. - 1996. - V.50. - P.374-381.; Naka S., Takeshita K., Yamamoto T. Bioartificial liver support system using porcine hepatocytes entrapped in a three-dimensional hollow fiber module with collagen gel: an evaluation in the swine acute liver failure model // Artif. Organs. - 1999. - V.23. - P.822-828; Tan W., Desai M.S., Desai T.A. Microfluidic patterning of cells in extracellular matrix biopolymers: effect of channel size, cell type, and matrix composition on pattern integrity // Tissue Engineering. - 2003. - V.9. - №2. - P.255-268; Hedberg L.E., Kroese-Deutman H.C., Shih C.K. et al. Effect of varied release kinetics of the osteogenic thrombin peptide TP508 from biodegradable polymeric scaffolds on bone formation in vivo II g]. Biomed. Mater. Res. - V.72A. - №4. - 2005. - P.343-353; Allemann F., Mizuno S. et al. Effect of hyaluronan on engeneered articular cartilage extracellular matrix gene expression in 3-dimensional collagen scaffolds // J. Biomed. Mater. Res. - 2001. - V.55. - P.13-19; Houweling D.A., Lankhorst A.J., Gispen W.H. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery // Exp. Neurol. - 1998. - V.153. - №1. - P.49-59; Marchand R., Woerly S., Bertrand L. et al. Evaluation of two cross-linked collagen gels implanted in the transected spinal cord // Brain Res. Bull. - 1993. - V.30. - №3-4. - P.415-422; Marchant R., Hiltner A., Hamlin C. et al. In vivo biocompatibility studies. 1. The cage implant system and biodegradable hydrogel // J. Biomed. Mater. Res. - 1983. - V.17. - P.301-325; Motoyuki S., Kazuhiro I., Akiyoshi S. et al. Long-term culture of primary rat hepatocytes with high albumin secretion using membrane-supported collagen sandwich // Cytotechnology. - 1993. - V.11. - №3. - P.213-218).

Гель «СфероГЕЛЬ» имеет следующие характеристики:

Размер пор	~ 100-400 µм
Количество сцепленной воды	~ 32,8±0,5 wt.%
Набухание (в воде)	~ 86,6±3,0 wt.%
Время полной резорбции	~ от 3-4 недель до 6-9 месяцев

Разнородная система гидрогеля содержит коллаген в форме микрочастиц (~35-300 µm) в коллагеновом растворе.

Физико-химические, механические и технологические свойства «СфероГЕЛЬ» делают этот биополимер весьма привлекательным для разработки временных каркасов для гибридных биоискусственных органов, т.к. обладает следующими свойствами (Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины: Монография. 2-е изд., дополн. и переработ. - Красноярск, Платина, 2006. - 288 с.):

- многофункциональностью (выполняет одновременно функции каркаса, подложки и питательной среды для клеточных культур);

- механической прочностью и эластичностью, достаточной для хирургических манипуляций;

- биосовместимостью на белковом и клеточным уровнях;

- способностью стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток;

- пористостью (размер микропор 100-400 мкм), обеспечивающей процессы неоваскуляризации;

- возможностью стерилизации стандартными способами без изменения их медико-технических свойств;

- способностью к биодеградации (от 3-4 недель до 6-9 месяцев).

Используемые гели были в шприце одноразового использования объемом 2,0 мл, которые были помещены в двойную хирургическую стерильную упаковку. Изделие «СТЕРИЛЬНО» (стерилизуется радиационным методом).

4) Трансплантация гетерогенного биосовместимого биодеградируемого геля, с иммобилизированными аллогенными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм.

Трансплантацию гетерогенных гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга осуществляют пациентам с печеночной недостаточностью в паренхиму печени и/или в брыжейку тонкой кишки. Для чего использовали гель с иммобилизированными клетками, которые хранились в шприце. Причем при трансплантации в паренхиму печени осуществляют, по меньшей мере, одну инъекцию геля с иммобилизированными на нем клетками. При трансплантации в брыжейку тонкой кишки осуществляют, по меньшей мере, одну инъекцию геля с иммобилизированными на нем клетками. При трансплантации в паренхиму печени и брыжейку тонкой кишки осуществляют соответственно, по меньшей мере, по одной инъекции геля с иммобилизированными на нем клетками в каждую из указанных областей.

5) Использование антикоагулянтов и антиагрегантов.

После трансплантации гетерогенных биосовместимых биодеградируемых гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга пациентам назначают антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 5000 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например трентал, из расчета 45 мг/м² поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.

6) Использование иммуносупрессантов.

После трансплантации гетерогенных биосовместимых биодеградируемых гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга пациентам назначают иммуносупрессанты в профилактической дозе, например: хорионический гонадотропин 500-5000 ME 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.

Предложенный трансплантат для лечения печеночной недостаточности состоит из гетерогенного биосовместимого биодеградируемого геля и посаженых на него аллогенных прогениторных клеток костного мозга и аллогенных клеток печени.

Для доказательства возможности достижения заявленных назначений и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример осуществления предлагаемого способа с использованием предлагаемого трансплантата в эксперименте.

Моделирование хронической печеночной недостаточности у животных (крысы) осуществляли по признанной и адекватной модели (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени // А.Фишер. - Будапешт, 1961, - 230 с.; Колпащикова И.Ф. Влияние трансплантации клеток тимуса, костного мозга и селезенки на восстановительные процессы в патологически измененной печени // Бюл. эксперим. биол. и мед., - 1979, №10. - С.477-480; Колпащикова И.Ф. Общие и местные изменения в организме при экспериментальном повреждении печени и ее регенерация // Автореф. докт. дисс. - 1982, Казань. - 41 с.) путем введения 60%-ного раствора CCL₄, первое введение 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела. Курс введения 6 недель с частотой - 2 введения в неделю.

Моделирование острой печеночной недостаточности у животных (собаки) осуществляли путем резекции 45-50% ткани печени, также являющейся признанной и адекватной моделью острой печеночной недостаточности (Demetriou A., Reisher A., Sanchez J. Et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatomized rats // Hepatology. - 1988. - Vol.8. - P.1006-1009; Чикотеев С.П., Плеханов А.Н. Печеночная недостаточность // в кн. Печеночная недостаточность. Иркутск. - 2002. - 260 с.; Michalopoulos G.K. Liver regeneration: Molecular mechanisms of growth control // FASEB J. - 1990. - Vol.l04. - P.176; Bowling WM, Kennedy SC, Cai SR, Duncan JR, Gao C, Flye MW. Portal branch occlusion safely facilitates in vivo retroviral vector transduction of rat liver // Hum. Gen. Ther. - 1996 - vol.7(17). - p.2113-2121).

1) Осуществляли по традиционной методике выделение аллогенных прогениторных клеток костного мозга.

Получали клеточный аспират из костномозгового канала большеберцовых костей (крысы) или плечевых костей (собаки) путем промывания полости фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ед/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе при комнатной температуре в течение 3 мин и снова центрифугировали 3-5 мин при 1500 об/мин. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде. Интерфазу с мононуклеарными клетками собирали с поверхности эритроидного осадка и ресуспендировали в лизирующем растворе, в соотношении 1:4, в течение 5-8 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляли. Добивались полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводили дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, в количестве 60-150×10⁶ клеток объединяли с осадком клеток, полученным из плазмы, и далее ресуспендировали в ростовой среде для стимуляции роста клеток.

2) Выделение аллогенных клеток печени осуществляли по традиционной методике.

Выделение аллогенных клеток печени из резецированного участка печени (4×4×2 см у собак и 1×1×0,5 см у крыс) производилось путем 3-кратной отмывки от крови и измельчения его на холоде (t=4°С), с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени были проинкубированы 3 раза раствором коллагеназы в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносился на сито с ячейками 200 мкм и фильтровался промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию клеток центрифугировали при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в такой же свежей среде и опять центрифугировали. Процедуру повторяли 3 раза. Жизнеспособность клеток, колебавшаяся в пределах от 83 до 95% оценивали методом окрашивания трипановым синим. Количество клеток колебалось в пределах от 3,0×10⁸ до 4,0×10⁸ гепатоцитов на 15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия содержала: гепатоциты ~95÷98%, и ~5÷2% непаренхиматозных клеток печени, которые были определены при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполнялось. Взвесь клеток печени концентрировали в 1-2 мл физиологического раствора.

3) Посадка (иммобилизация) аллогенных клеток печени и аллогенных клеток костного мозга на гетерогенный гель.

Посадку (иммобилизацию) аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга на гель также осуществляли по традиционной методике.

В качестве гетерогенного геля может быть использован, например, биоматериал «СфероГЕЛЬ», изготовленный на основе коллагена сельскохозяйственных животных (70%) и коллагенсодержащего экстракта (30%), имеющего вид плотного желеобразного вещества. С размерами пор ~100-400 µм, временем полной резорбции ~ от 3-4 недель до 6-9 месяцев.

Аллогенные клетки печени и аллогенные прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×10⁶ клеток печени/мл и 2,0-4,0×10⁶ прогениторных клеток клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию в концентрации 2×10⁶-15×10⁶ на 1 см³ аккуратно смешивали с гетерогенным гелем в соотношении 1:1, до равномерной консистенции, набирали в шприц и хранили до введения в печень и/или брыжейку при 4°С не более 5 часов.

4) Трансплантацию гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм животным:

A) собакам осуществляли в паренхиму печени на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени;

Б) собакам осуществляли в брыжейку тонкой кишки на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени;

B) собакам осуществляли в паренхиму печени и в брыжейку тонкой кишки на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени;

Г) крысам в паренхиму печени на 42-44 сутки после моделирования хронической печеночной недостаточности путем путем введения 60%-ного раствора CCl₄ (первое введение 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела частотой - 2 введения в неделю).

Перед трансплантацией животных (собаки) наркотизировали: смесью препаратов осуществляли путем внутримышечного введения смеси препаратов: Калипсол (5% 10 мг/кг), Дроперидол (1,5 мг/кг), Атропин (0,1% - 0,02 мг/кг), Димедрол 1% - 0,5 мл. После чего, в операционной, осуществляли вводный наркоз путем внутривенного введения 1% Пропофола из расчета 7 мг/кг. Операцию проводили под интубационным наркозом. Поддержание анестезии проводили 1% Пропофолом 0,5 мг/кг/ч и Калипсолом 2 мг/кг. У крыс осуществляли анестезиологическое пособие из расчета на 100 гр массы тела при этом вводили внутримышечно: Калипсол 10% - 2 мл, Ксилазин 2% - 1 мл, Атропин 0,2 мл.

Суммарный клеточный материал, содержащий аллогенные клетки печени и костного мозга в концентрации 2×10⁶-15×10⁶ на см³ и соотношении 1:1, иммобилизированные на гетерогенном геле СферооГЕЛЬ, трансплантировали в паренхиму печени и/или в брыжейку тонкой кишки животных.

Брюшную полость ушивали послойно наглухо. Для профилактики инфекционных осложнений интраоперационно животным назначали внутривенно Офлоксацин - 40 мл; Метронидазол - 30 мл; Дитилин 5% - 20 мг/кг/ч. Проводили контроль показателей биохимии, коагулограммы, общего анализа крови на 1, 3, 9, 14, 18 сутки после операции.

5) Использование антикоагулянтов и антиагрерантов.

В частном случае для профилактики клеточной инфильтрации трансплантата клетками крови сразу после трансплантации геля с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга ежедневно назначали антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например трентал, из расчета 45 мг/м² поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.

6) Использование иммуносупрессантов.

В частном случае для профилактики отторжения сразу после трансплантации геля с иммобилизированными аллогенными клетками печени и алогенными прогениторными клетками костного мозга ежедневно назначали иммуносупрессанты в профилактической дозе, например: хорионический гонадотропин 500-5000 МЕ 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.

Всего нами проведено 19 экспериментов, при этом коррекция острой печеночной недостаточности по предложенному способу была проведена в 3 экспериментах и хронической печеночной недостаточности - в 16 экспериментах.

На фиг.1 представлена динамика синтетической функции печени (фибриноген) при острой печеночной недостаточности. Проведенные исследования показали, что после резекции 50% печени минимальная синтетическая функция печени отмечалась в период первых 3 дней после резекции. По сравнению с исходом показатели фибриногена уменьшились в 2,4 раза, что указывает на значительные функциональные нарушения печеночных клеток. После чего отмечается постепенное возвращение этих показателей к исходным 18 суткам после моделирования печеночной недостаточности. В эксперименте после трансплантации гетерогенного геля с посаженными на него аллогенными прогениторными клетками костного мозга и аллогенными клетками печени по предложенному способу динамика синтетической функции печени была сходной с контрольной группой. Однако с момента трансплантации (3 сутки после моделирования печеночной недостаточности) аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на гетерогенный гель, отмечается более быстрое восстановление до исходных показателей синтетической функции печени, например к 5 суткам трансплантации этот показатель был меньше исходных на 6,1%, а в контрольной группе на 37,6%.

На фиг.2 представлена динамика синтетической функции печени (АЧТВ) при острой печеночной недостаточности. Проведенные исследования показали, что после резекции 50% печени синтетическая функция печени на 1 день после резекции снизилась, что проявилось в виде увеличения АЧТВ на 41%. По сравнению с исходом на 3 день после резекции показатели АЧТВ увеличились в 1,4 раза, что указывает на значительные функциональные нарушения печеночных клеток. После чего отмечается постепенное (причем в исследуемой группе, практически к 5 суткам после трансплантации) возвращение этих показателей к исходным, а в контрольной группе на исследуемом сроке (18 дней после операции) этот показатель (АЧТВ) так и не достиг исходного. Это произошло только к 28-32 суткам после операции.

Из представленных данных следует, что до момента трансплантации аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на гетерогенный гель, динамика показателей, характеризующих синтетическую функцию печени, была сходной в обеих группах (контрольная, эксперимент), однако в исследуемой группе (эксперимент) восстановление синтетической функции печени (по протромбиновому индексу т AT III) происходило быстрее, и эти показатели были более приближены к исходным.

На фиг.3 через 90 дней в контрольной группе (без лечения по предложенному способу) выявлено формирование фиброзной ткани в области гетерогенного геля (1), лимфоидно-клеточная инфильтрация (2), полнокровие мелких сосудов (3). Окр. по Массону, ув. 400.

На фиг.4 через 180 дней в контрольной группе (без лечения по предложенному способу) выявлена лимфоидно-клеточная воспалительная инфильтрация (4) и фиброзная ткань (5). Окр. по Массону, ув. 200.

На фиг.5 через 90 дней в контрольной группе (с лечением по предложенному способу) выявлена значительно менее выраженная воспалительная реакция на гетерогенный гель, определяются пролиферирующие гепатоциты (6). Окр. Гематоксилин-эозин, ув. 200.

На фиг.6 через 180 дней в контрольной группе (с лечением по предложенному способу) выявлены жизнеспособные пролиферирующие гепатоциты (7). Окр. Гематоксилин-эозин, ув. 400.

Во всех случаях был достигнут желаемый результат, а именно была получена и адекватно корригирована печеночная недостаточность. Способ позволяет улучшить результаты лечения печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными аллогенными гепатоцитами детоксикационной и биорегуляторной функций, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с аллогенными прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов печени и/или сосудов б