Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности

Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретения относятся к медицине, трансплантологии, а именно к клеточной трансплантологии, и могут быть использованы при коррекции и лечении печеночной недостаточности. Предлагаемые способ и трансплантат могут быть использованы в специализированных отделениях, занимающихся лечением и коррекцией печеночной недостаточности.

Известен способ лечения печеночной недостаточности, основанный на использовании суспензии изолированных ксеногенных гепатоцитов в экстрокорпоральной системе «вспомогательная печень», через которую перфузируется кровь реципиента с пораженной печенью (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).

Изолированные гепатоциты в таких системах, будучи ксеногенными, способны в организме больного лишь кратковременно осуществлять детоксикационные и синтетические функции. В то же время способность суспензии изолированных гепатоцитов выделять регуляторные пептиды, стимулирующие процессы регенерации в пораженной печени реципиента, пролонгирована до 0,5-8 часов (Шумаков В.И. и др. Лечение тяжелой печеночной недостаточности перфузией крови больного через взвесь криоконсервированных гепатоцитов. // Хирургия. - 1990. - №2. - C.113-116).

Известен другой способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались микрофрагменты ткани печени, что позволило пролонгировать метаболическую активность гепатоцитов, содержащихся в микрофрагментах до 24-34 и даже до 48 часов (Соловьев В.В., Онищенко Н.А., Акатов B.C., Лежнев Э.И. Функциональная активность гепатоцитов в фрагментах печени in vitro: зависимость от размеров фрагментов и длительности их культивирования. // Бюл. Экспер. Биол. и Мед., - 1997, - №10, - с.406-408). Увеличение сроков метаболической активности гепатоцитов в составе микрофрагментов происходит за счет сохранения в них межклеточных контактов и естественного межклеточного матрикса, а также из-за сохранения пространственной структуры ткани печени, в результате чего оптимизируются условия функционирования всех типов клеток, в том числе и гепатоцитов.

Также известен способ лечения печеночной недостаточности, предполагающий для пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов в перфузионных биореакторах использовать изолированные гепатоциты с микроносителями (используют, например, цитодекс-3 при соотношении 1,6 г микроносителя на 1×10⁹ клеток), которые предварительно покрывают коллагеном (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl.208. - p.111-117; Chen S., Eguchi S. Watanabe Hepatic support strategies// Transplant. Proc. - 1996. - 28, №4. - р.2036-2038).

В качестве прототипа выбран известный способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались изолированные гепатоциты для вспомогательной поддержки печени и, соответственно, восполнения дезинтоксикационной и биорегуляторной функции поврежденной печени (Van de Kerkhove M.P., Hoekstra R., Chamuleau R.A., van Gulik T.M. Clinical application of bioartificial liver support systems. // Ann. Surg. - 2004. - Vol.240. - P.216-230).

К недостаткам использования известных способов, в том числе и прототипа, предпологающих использование экстракорпорального биореактора с микрофрагментами ткани печени или изолированными гепатоцитами относятся:

- необходимость использования специальных измельчителей для получения фрагментов заданного размера, повышающих опасность инфицирования донорского материала;

- необходимость использования перфузионных систем и включения в перфузионный контур дополнительных технических узлов для оксигенации и детоксикации крови (плазмы), поступающих к микрофрагментам ткани печени, что повышает экономическую себестоимость метода;

- необходимость использования в биореакторах микрофрагментов в смеси с частицами пористого биосовместимого носителя для предотвращения слипания микрофрагментов и обеспечения эффективного массопереноса;

- использование частиц пористого носителя не создает условий для предотвращения отсроченной гибели гепатоцитов в микрофрагментах, т.к. при увеличении сроков культивирования микрофрагментов из-за низкой скорости пролиферации гепатоцитов начинает формироваться монослой из быстро прикрепляющихся и пролиферирующих стромальных клеток, окутывающих местные ткани печени и затрудняющих их функционирование;

- необходимость использования ксеногенного материала, что повышает угрозу переноса опасных инфекций и служит фактором избыточной активации иммунной системы реципиента с сокращением срока функционирования этого материала;

- раннее прекращение (через 1-2 дня) метаболических и регуляторных функций гепатоцитов;

- необходимость регулярно осуществлять сеансы подключения перфузионных систем «биоискусственная печень».

Известно устройство для лечения печеночной недостаточности методом экстракорпорального подключения изолированных гепатоцитов (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl.208, - p.111-117). Также известно устройство, предназначенное для лечения печеночной недостаточности, позволяющее увеличивать сроки жизнеспособности изолированных гепатоцитов (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).

В качестве прототипа предлагаемого трансплантата для лечения печеночной недостаточности выбран интракорпоральный трансплантат (биомодуль) «вспомогательная печень» (Uyama S., Kaufman P., Kneser U., Vacanti J., Rodriges X. Hepatocyte transplantation using biodegradable matrices in ascorbic acid-deficient rats: comparsion with heterotropically transplanted liver grafts // Transplantation. - 2001. - Vol.7. - P.1-7).

К недостаткам использования известных устройств, в том числе и прототипа, предпологающих использование биомодулей с изолированными гепатоцитами относятся:

- выраженная воспалительная реакция на трансплантат;

- гибель большого количества изолированных гепатоцитов;

- низкая плотность прикрепления клеток печени;

- дороговизна матрикса-носителя.

Задачей изобретения является разработка способа, повышающего эффективность коррекции и лечения печеночной недостаточности за счет пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов и выполнения ими функциональной и органоспецифической активности путем трансплантации долгосрочно функционирующего интракорпорального трансплантата типа «вспомогательная печень».

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретений, заключается в коррекции и лечении печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными гепатоцитами детоксикационной функции, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов брыжейки и сосудов, проросших в каркас, к иммобилизированным печеночным клеткам и клеткам костного мозга; а также в профилактике осложнений, связанных с тромбообразованием и клеточной инфильтрацией в месте трансплантации трансплантата с клеточным материалом.

Достоинствами предложенных способа и трансплантата для лечения печеночной недостаточности, позволяющих, по существу, создать интракорпоральную систему «вспомогательная печень» для длительного поддержания в функциональном состоянии изолированных гепатоцитов являются:

- отсутствие необходимости применения сложных перфузионных систем;

- создание с помощью 3-х мерного матрикса культуральных условий для пролиферации клеток и формирования «тканеподобной» структуры;

- создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости и прорастания сосудов через матрикс, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток;

- использование аутологичных клеток, которые снижают степень активации иммунной системы, позволяют этой системе оказывать в организме длительное биорегуляторное воздействие.

В предлагаемых изобретениях не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован клеточный материал взрослых доноров.

Сокультивирование клеток печени и костного мозга перед трансплантацией позволяет дополнительно повышать функциональную активность гепатоцитов за счет выделения факторов роста и цитокинов, выделяемых клетками костного мозга и создает условия для дифференцировки клеток костного мозга в эндотелиоциты для формирования сосудов и их прорастания в матрикс. Это способствует более быстрой интеграции трансплантата в систему кровообращения после трансплантации и поддержания метаболизма и жизнедеятельности клеток за счет доставки по вновь образованным и проросшим сосудам кислорода; создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток. Использование антикоагулянтов и антиагрегантов сразу после трансплантации тормозит клеточную реакцию на трансплантат как инородное тело и препятствует тромбообразованию в месте трансплантации.

Сущность изобретений заключается в следующем.

Для лечения печеночной недостаточности используют изолированные клетки печени. Причем предварительно осуществляют забор аутологичных прогениторных клеток костного мозга. Осуществляют культивирование их in vitro. Затем осуществляют забор аутологичных клеток печени. Выполняют посадку свежевыделенных клеток печени и культивированных клеток костного мозга на трехмерный биосовместимый биодеградируемый пористый матрикс. Размеры пор матрикса варьируют от 2 до 500 мкм. Суммарная пористость матрикса составляет 50-97%. Суммарная концентрация клеток печени и костного мозга составляет 2×10⁶ - 15×10⁶ клеток на 1 см³ матрикса. При этом соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4. Причем общий объем матрикса не менее 0,05 см³. Наименьший линейный размер матрикса должен быть не менее 0,2 мм. Проводят сокультивирование аутологичных клеток печени и костного мозга. Трансплантацию матрикса с клетками печени и костного мозга производят в брыжейку тонкой кишки.

Культивирование клеток костного мозга осуществляют в течение, например, 7 суток.

В частном случае после посадки клеток печени и костного мозга на матрикс перед трансплантацией осуществляют сокультивирование аутологичных клеток печени и клеток костного мозга, например, в течение 2-3 суток.

В частном случае сразу после трансплантации назначают антикоагулянты в профилактической дозе. Доза составляет: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты в профилактической дозе, напимер трентал из расчета 45 мг/м² поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.

Предлагаемый трансплантат для лечения печеночной недостаточности включает трехмерный биосовместимый биодеградируемый пористый матрикс и посаженные на него аутологичные клетки костного мозга после их культивирования in vitro и свежевыделенные аутологичные клетки печени. Общий объем матрикса не менее 0,05 см³, а наименьший линейный размер - не менее 0,2 мм. Размеры пор матрикса 2-500 мкм, суммарная пористость 50-97%. Концентрация клеток печени и костного мозга 2×10⁶-15×10⁶ клеток на 1 см³ матрикса и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4.

Предлагаемые способ и трансплантат позволяют пролонгировано корригировать острую или хроническую печеночную недостаточность за счет пролонгирования функционирования изолированных гепатоцитов. Трансплантация не аллогенных, а аутологичных клеток позволяет исключить осложнения, связанные с реакцией отторжения. Предлагаемая группа изобретений позволяет следующее.

1. Создавать условия для прикрепления изолированных клеток печени и клеток костного мозга к биосовместимому матриксу, активизирует их пролиферацию, которая поддерживается диффузией в матрикс питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови и плазмы, притекающей к матриксу из сосудов брыжейки.

2. Создать каркас, на основе биосовместимых биодеградируемых и пористых матриксов, имитирующий пространственную структуру для прикрепления клеток донорской печени и прогениторных клеток костного мозга, а также условия для прорастания в этот каркас сосудов, питающих прикрепленные клетки.

3. Создать условия, препятствующие клеточной инфильтрации трансплантата и поддерживающие его клетки в жизнеспособном состоянии за счет использования антикоагулянтов и антиагрегантов.

Способ осуществляют следующим образом и включает в себя несколько последовательных этапов:

1) Выделение аутологичных прогениторных клеток костного мозга.

Выделение прогениторных клеток костного мозга осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов. //Вестник трансплантации и иск. органов 2002, 4, с.3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций // Москва, Лавр. 2009, - с.61-67). За 4-7 дней до основного оперативного вмешательства под местным обезболиванием пунктируют подвздошную кость пациента и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хенкса, содержащим 200 мкг/мл гентамицина; 10,0 мкг/мл инсулина; 0,25 мкМ дексамезатона; 250 ед/мл гепарина. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH₄Cl; 7,5 мМ KHCO₃; 100 мкМ EDTA), в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата, в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный суспернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм ресуспендируют в ростовой среде.

2) Культивирование аутологичных прогениторных клеток костного мозга in vitro.

Культивирование прогениторных клеток костного мозга осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов. // Вестник трансплантации и иск. органов 2002, 4, с.3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций // Москва, Лавр. 2009, - с.77-100). Частично очищенные прогениторные клетки костного мозга высевают для культивирования на чашки Петри d=60 мм в количестве 1,5-2,0 млн. клеток/мл. Культивируют при 37°С в СО₂-инкубаторе, атмосфера 5% CO₂ и 95% влажности в течение 7 суток с однократной сменой среды на третьи сутки. Через неделю культура клеток костного мозга содержала до 10% прикрепившихся к пластику распластанных фибробластоподобных и моноцитарных клеток и до 90% свободно плавающих в суспензии, округлых не прикрепившихся клеток (гемопоэтические клетки). Неприкрепившиеся к пластику прогениторные клетки костного мозга отбирали и затем использовали для иммобилизации на пористый матрикс с клетками печени.

3) Выделение аутологичных клеток печени.

Производят резекцию 2-4×2-4×1-2 см ткани печени у пациентов с печеночной недостаточностью для получения клеток печени. Выделение аутологичных клеток печени осуществляют по традиционной методике (Fontaine M, Schloo В, Jenkins R, Uyama S, Hansen L, Vacanti J.P. Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs. // Pediatr. Surg. - 1995. - vol.30(1). - P.56-60; Hang H, Shi X, Gu G, Wu Y, Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int J Artif Organs. 2009 Oct; 32(10). - P.720-7; Lehec S.C, Hughes RD, Mitry R.R, Graver M.A, Verma A, Wade J.J, Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation. // Cell Transplant. 2009; 18(8). - P.941-947; Seglen O. Preparation of isolated rat liver cells. // Methods. Cell. Biol. 1976. - vol.13. - P.29-83).

Выделение аутологичных клеток печени производят из резецированного участка печени путем 3-кратной отмывки кусочка печени от крови и измельчения его на холоду (t=4°С) в чашке Петри, с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 2.38 г HEPES, pH 7,4, 37°С] в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени инкубируются 3 раза раствором коллагеназы [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 0.7 г CaCl₂, 2.38 г HEPES, 7.5 мг ингибитор трипсина и 500 мг коллагеназы Тип IV-S (>125 CDU/mg), pH 7,3; 37°С] в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносят на сито с ячейками 200 мкм и фильтруют промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию отдельных клеток и небольших агрегатов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в такой же свежей среде и опять центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Жизнеспособность клеток оценивают методом окрашивания трипановым синим. Добиваются получения количества клеток в пределах от 3,0×10⁸ до 4,0×10⁸ гепатоцитов на 12-15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия должна содержать: гепатоциты, непаренхиматозные клетки печени, которые определяют при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполняют. Взвесь клеток печени концентрируют в 1-2 мл физиологического раствора.

4) Посадка (иммобилизация) аутологичных клеток печени и аутологичных клеток костного мозга на носитель.

Посадку (иммобилизацию) клеточного материала осуществляют по традиционной методике (Mooney D.J., Sano K., Kaufmann Р.М., Majahod K., Schloo В., Vacanti J.P., Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted о biodegradable polymer sponges // J.Biomed. Mater. Res. - 1997. - Vol.5. - P.413-420).

Аутологичные клетки печени и аутологичные прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×10⁶ клеток печени/мл и 2,0-4,0×10⁶ прогениторных клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на матрикс в концентрации 2×10⁶-15×10⁶ на 1 см³, на предварительно пропитанный этой средой матрикс.

В качестве матрикса может быть использован, например, биоматериал, созданный на основе полиоксибутирата (3-оксибутирата) - ЭластоПОБ. Полиоксибутират - гомополимер, синтезируемый различными видами прокариотических клеток. Они являются субстратом эндогенного дыхания и поддерживают жизнеспособность клеток в неоптимальных условиях среды (Севастьянов В.И., Перова Н.В., Довжик И.А., Титушкин И.А., Немец Е.А., Беломестная З.М., Шишацкая Е.И., Волова Т.Г. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров // Перспективные материалы, 2001, №5. - С.46-55; Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Kalacheva G.S., Volova T.G., Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2003, V.14(10). - P.1029-1042; Volova Т., Shishatskaya E., Sevastianov V., Efremov S., Mogilnaya O., Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers, Biochem. Eng. J., 2003, №3736. - P.1-9).

ЭластоПОБ в настоящее время разрешен к медицинскому применению. Основным компонентом ЭластоПоБ является биодеградируемый бактериальный сополимер β-оксибутирата и β-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ) с включением оксивалерата 15÷30 мол.% (M_w=295-360 КДа, кристалличность 50-60%), полученный из Института биофизики СО РАН, г.Красноярск. В состав ЭластоПоБ входит также высокомолекулярный гидрофильный пластификатор (ВГП), повышающий гидрофильность и эластичность материала.

Физико-химические, механические и технологические свойства ЭластоПОБ делают этот биополимер весьма привлекательным для разработки временных каркасов для гибридных биоискусственных органов (Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А. Биодеградируемый биополимерный материал ЭластоПОБ для клеточной трансплантации //Перспективные материалы, 2004, №3. - С.35-41; Севастьянов В.И., Немец Е.А., Волкова Т.Г., Марковцова М.Г. Трехмерные пористые матриксы для трансплантации клеток на основе биодеградируемого бактериального сополимера «Биопластотан»// Перспективные материалы, 2007, №6. - С.5-10).

Используемые матриксы ЭластоПОБ имели следующие размеры и параметры: диаметр пористой губки - 10±2 мм; толщина - 1,2±0,5 мм; масса - 6,0-12,0 мг. Пористость - не менее 95±2%. Размер макропор - 300±100 мкм.

5) Сокультивирование аутологичных прогениторных клеток костного мозга и аутологичных клеток печени in VITRO.

В частном случае выполняли Сокультивирование аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга по общепринятой методике (Kaufmann P.M., Sano K., Uyama S., Breuer C.K., Organ G.M., Schloo B.L., Kluth D., Vacanti J.P. Evaluation of Methods of Hepatotrophic Stimulation in Rat Heterotopic Hepatocyte Transplantation Using Polymers // J. of Pediatric Surgeru. - 1999. - Vol.34. - P.1118-1123; Uyama S., Kaufmann P.M., Takeda Т., Vacanti J.P. Delivery of whole liver equivalent hepatocyte mass using polymer devices and hepatotrophic stimulation // Transplantation. - 1993. - Vol.55. - P.932-935).

Это позволяло повысить количество жизнеспособных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, способных выполнять специфические функции: дезинтоксикационную и синтетическую функциональную активность гепатоцитов, и создавало условия для дифференцировки прогениторных клеток костного мозга в эндотелиоциты для формирования сосудов и их прорастания в матрикс.

Матрикс с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-1, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] на 2-3 суток.

6) Трансплантация носителя, с иммобилизированными аутологичными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм.

Трансплантацию матриксов с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными прогениторными клетками костного мозга осуществляют пациентам с печеночной недостаточностью в брыжейку тонкой кишки на 3-4 сутки после резекции.

7) Использование антикоагулянтов и антиагрерантов.

После трансплантации матриксов с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными прогениторными клетками костного мозга пациентам назначают антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 5000 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например, трентал из расчета 45 мг/м² поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.

Предложенный трансплантат для лечения печеночной недостаточности состоит из трехмерного биосовместимого биодеградируемого пористого матрикса и посаженых на него аутологичных прогениторных клеток костного мозга и аутологичных клеток печени.

Для доказательства возможности достижения заявленных назначений и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример осуществления предлагаемого способа с использованием предлагаемого трансплантата в эксперименте.

Моделирование хронической печеночной недостаточности у животных (крысы) осуществляли по признанной и адекватной модели (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени // А.Фишер. - Будапешт, 1961, - 230 с.; Колпащикова И.Ф. Влияние трансплантации клеток тимуса, костного мозга и селезенки на восстановительные процессы в патологически измененной печени // Бюл. эксперим. биол. и мед., - 1979, №10. - С.477-480; Колпащикова И.Ф. Общие и местные изменения в организме при экспериментальном повреждении печени и ее регенерация // Автореф. докт. дисс. - 1982, Казань. - 41 с.) путем введения 60% раствора CCl₄, первое введение 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела. Курс введения 6 недель с частотой - 2 введения в неделю.

Моделирование острой печеночной недостаточности у животных (собаки) осуществляли путем резекции 45-50% ткани печени, также являющейся признанной и адекватной моделью острой печеночной недостаточности (Demetriou A., Reisher A., Sanchez J. Et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatomized rats // Hepatology. - 1988. - Vol.8. - P.1006-1009; Чикотеев С.П., Плеханов А.Н. Печеночная недостаточность // в кн. Печеночная недостаточность. Иркутск. - 2002. - 260 с.; Michalopoulos G.K. Liver regeneration: Molecular mechanisms of growth control // FASEB J. - 1990. - Vol.l04. - P.176; Bowling WM, Kennedy SC, Cat SR, Duncan JR, Gao C, Flye MW. Portal branch occlusion safely facilitates in vivo retroviral vector transduction of rat liver. // Hum. Gen. Ther / - 1996, - vol.7(17), - p.2113-2121).

1) Осуществляли по традиционной методике выделение аутологичных прогениторных клеток костного мозга.

Получали клеточный аспират из костномозгового канала болыпеберцовых костей (крысы) или плечевых костей (собаки) путем промывания полости фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ед/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе при комнатной температуре в течение 3 мин и снова центрифугировали 3-5 мин при 1500 об/мин. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий прогениторные клетки костного мозга, ресуспендировали в ростовой среде. Интерфазу с мононуклеарными клетками собирали с поверхности эритроидного осадка и ресуспендировали в лизирующем растворе, в соотношении 1:4, в течение 5-8 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляли. Добивались полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводили дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, в количестве 60-150×10⁶ клеток объединяли с осадком клеток, полученным из плазмы, и далее ресуспендировали в ростовой среде для стимуляции роста клеток.

2) Осуществляли по традиционной методике культивирование прогениторных клеток костного мозга.

Частично очищенные прогениторные клетки костного мозга высевали для культивирования в количестве 1,5-2,0 млн. клеток/мл. Культивировали при 37°С в СО₂-инкубаторе, атмосфере 5% СО₂ и 95% влажности в течение 7 суток с однократной сменой среды на третьи сутки.

3) Выделение аутологичных клеток печени осуществляли по традиционной методике.

Выделение аутологичных клеток печени из резецированного участка печени (4×4×2 см у собак и 1×1×0,5 см у крыс) производилось путем 3-кратной отмывки от крови и измельчения его на холоде (t=4°С), с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени были проинкубированы 3 раза раствором коллагеназы в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносился на сито с ячейками 200 мкм и фильтровался промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию клеток центрифугировали при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в такой же свежей среде и опять центрифугировали. Процедуру повторяли 3 раза. Жизнеспособность клеток, колебавшаяся в пределах от 83 до 95% оценивали методом окрашивания трипановым синим. Количество клеток колебалось в пределах от 3,0×10⁸ до 4,0×10⁸ гепатоцитов на 15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия содержала: гепатоциты ~95÷98%, и ~5÷2% непаренхиматозных клеток печени, которые были определены при световой микроскопии. Разделение парехиматрзных и непарехиматозных клеток не выполнялось. Взвесь клеток печени концентрировали в 1-2 мл физиологического раствора

4) Посадку (иммобилизацию) аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга на матрикс также осуществляли по традиционной методике.

Аутологичные клетки печени и прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде в концентрации 2,0-4,0×10⁶ клеток печени/мл и 2,0-4,0×10⁶ прогениторных клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на матрикс в концентрации 2×10⁶-15×10⁶ на 1 см³ на предварительно пропитанный этой средой матрикс.

5) В частном случае выполняли сокультивирование аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга по общепринятой методике.

Это позволяло повысить количество жизнеспособных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, способных выполнять специфические функции: дезинтоксикационную и синтетическую функциональную активность гепатоцитов, и создавать условия для дифференцировки прогениторных клеток костного мозга в эндотелиоциты для формирования сосудов и их прорастания в матрикс.

Матрикс с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде на 2-3 суток.

В качестве матрикса был использован, например, биоматериал, созданный на основе полиоксибутирата (3-оксибутирата) ЭластоПОБ. ЭластоПОБ имеет молекулярный вес 295-360 КДа, синтезирован институтом биофизики СО РАН г.Красноярск, и в настоящее время разрешен к медицинскому применению.

Используемые матриксы ЭластоПОБ имели следующие размеры и параметры: диаметр пористой губки - 10±2 мм; толщина - 1,2±0,5 мм; масса - 6,0-12,0 мг. Пористость - не менее 95±2%. Размер макропор - 300±100 мкм.

6) Трансплантацию матриксов с иммобилизированными аутологичными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм животным (собаки) осуществляли на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени.

Перед трансплантацией животных (собаки) наркотизировали: смесью препаратов осуществляли путем внутримышечного введения смеси препаратов: Калипсол (5% 10 мг/кг, Дроперидол (1,5 мг/кг), Атропин (0,1% - 0,02 мг/кг), Димедрол 1% - 0,5 мл. После чего, в операционной осуществляли вводный наркоз путем внутривенного введения 1% Пропофола из расчета 7 мг/кг. Операцию проводили под интубационным наркозом. Поддержание анестезии проводили 1% Пропофолом 0,5 мг/кг/ч и Калипсолом 2 мг/кг. У крыс осуществляли анестезиологическое пособие из расчета на 100 г массы тела, при этом вводили внутримышечно: Калипсол 10% - 2 мл, Ксилазин 2% - 1 мл, Атропин 0,2 мл.

Суммарный клеточный материал, содержащий аутологичные клетки печени и костного мозга в концентрации 2×10⁶-15×10⁶ на см³, иммобилизированные на матрикс ЭластоПОБ, трансплантировали в брыжейку тонкой кишки животных.

Брюшную полость ушивали послойно наглухо. Для профилактики инфекционных осложнений интраоперационно животным назначали внутривенно водили Офлоксацин - 40 мл; Метронидазол - 30 мл.; Дитилин 5% - 20 мг/кг/ч. Проводили контроль показателей биохимии, коагулограммы, общего анализа крови на 1, 3. 9, 14, 18 сутки после операции.

7) Использование антикоагулянтов и антиагрерантов.

В частном случае для профилактики клеточной инфильтрации трансплантата клетками крови сразу после трансплантации матриксов с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными прогениторными клетками костного мозга ежедневно назначали антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты в профилактической дозе, например: трентал из расчета 45 мг/м² поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.

Всего нами проведено 25 экспериментов, при этом коррекция острой печеночной недостаточности по предложенному способу была проведена в 5 экспериментах и хронической печеночной недостаточности - в 20 экспериментах.

На фиг.1 изображена динамика нарастания и уменьшения острой печеночной недостаточности в контроле, где: 1 - AST, 2 - ALT, 3 - GGT, 4 - ALP, 5 - LDH. Максимальное увеличение показателей, характеризующих печеночную недостаточность, выявлено на 1 сутки после моделирования печеночной недостаточности. Проведенные исследования показали, что после резекции 50% печени уровень ALT по сравнению с исходом увеличился в 6 раз, a AST в 15 раз, что указывает на значительные функциональные нарушения печеночных клеток. Уровень щелочной фосфатазы после резекции увеличился в 5 раз. После чего отмечается постепенное возвращение этих показателей к нормальным к 18 суткам после моделирования печеночной недостаточности.

На фиг.2 изображена динамика нарастания и уменьшения острой печеночной недостаточности в эксперименте после трансплантации матрикса с посаженными на него аутологичными прогениторными клетками костного мозга и аутологичными клетками печени по предложенному способу, где 6 - AST, 7 - ALT, 8 - GGT, 9 - ALP, 10 - LDH.

Из представленных данных следует, что до момента трансплантации аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс, динамика биохимических показателей, характеризующих печеночную недостаточность, была сходной с контрольной группой. Однако с момента трансплантации (3 сутки после моделирования печеночной недостаточности) аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс, отмечается более быстрое снижение биохимических показателей, характеризующих печеночную недостаточность. Содержание щелочной фосфатазы превышало исходный уровень всего в 1,5 раза и по сравнению с 1 сутками после резекции снизилось в 3,5 раза. Особенно ярко снижение уровня показателей печеночной недостаточности видно на 5 день после трансплантации аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс, эти показатели снизились практически в 2 раза по отношению к контролю. Причем эти показатели нормализовались к 14 суткам после моделирования острой печеночной недостаточности в исследуемой группе и только к 18 суткам после операции - в контрольной группе.

На фиг.3 представлены группы жизнеспособных аутологичных гепатоцитов спустя 90 дней после их трансплантации в организм экспериментального животного по предложенному способу. Окраска: гематоксилин - эозин. Увеличение микроскопа ×400 (где 11 - жизнеспособные гепатоциты).

На фиг.4 представлены данные гистологического исследования спустя 180 дней после трансплантации аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс. В гистологических препаратах животных, которые не получали антакоагулянты и антиагреганты, выявлена выраженная лимфоидная реакция (12), фиброзные изменения (13) и гигантские клетки инородных тел (14) (как воспалительная реакция на подложку). Окраска PAS. Увеличение ×400.

На фиг.5 у животных, которые получали антикоагулянты и антиагреганты, выявлена значительно меньшая клеточная реакция. В препарате встречаются группы жизнеспособных гепатоцитов (15) и единичные мононуклеарные клетки (16). Окраска PAS. Увеличение ×400.

На фиг.6 спустя 90 дней в препарате выявлен вновь образованный сосуд (17). Окраска PAS. Увеличение микроскопа ×400.

Во всех случаях был достигнут желаемый результат, а именно была получена и адекватно корригирована печеночная недостаточность. Способ позволяет улучшить результаты лечения печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными аутологичными гепатоцитами детоксикационной и биорегуляторной функций, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с аутологичными прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов брыжейки, проросших в каркас, к иммобилизованным печеночным клеткам и клеткам костного мозга; обеспечивает профилактику осложнений, связанных с использованием трансплантата с клетками. Кроме того, использование аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга позволяет избе