Обнаружение туберкулеза и заражения туберкулезными микобактериями с использованием нвна

Обнаружение туберкулеза и заражения туберкулезными микобактериями с использованием нвна

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам обнаружения заражения млекопитающих туберкулезными микобактериями (Mycobacterium tuberculosis) in vitro и к способам различения in vitro млекопитающих, инфицированных Mycobacterium tuberculosis, у которых заболевание явно выражено (активная форма), и инфицированных млекопитающих, которые не имеют симптомов туберкулеза (латентная форма), а также к способу различения in vitro млекопитающих с активной формой туберкулеза и млекопитающих, не инфицированных М. tuberculosis или имеющих латентную форму туберкулеза.

Настоящее изобретение также относится к наборам для обнаружения и распознавания инфицированных млекопитающих с выраженными симптомами туберкулеза по сравнению с инфицированными млекопитающими, у которых заболевание еще не развилось, и к набору для распознавания млекопитающих, имеющих активную форму туберкулеза, по сравнению с млекопитающими, не инфицированными М. tuberculosis или имеющими туберкулез в латентной форме.

Туберкулез (ТВ) представляет собой бактериальное заболевание, которое поражает главным образом легкие (туберкулез легких); также могут быть поражены другие части тела, в частности лимфатические узлы, плевра (плевральная полость), суставы, кости, мочеполовая система, оболочка мозга, брюшина, желудочно-кишечный тракт, центральная нервная система, надпочечные железы или околосердечная сумка (внелегочная форма туберкулеза).

Туберкулез передается воздушным путем, посредством контакта с бактериями, находящимися в слюне и легочной мокроте млекопитающего - носителя заболевания (например, при кашле или чихании), или путем контакта с поврежденными тканями. Симптомами туберкулеза являются лихорадка, ночное потоотделение, утомляемость, потеря веса, потеря аппетита и постоянный кашель.

В 2004 году туберкулез все еще представлял значительную проблему для здравоохранения, поскольку более двух миллионов летальных исходов в мире было результатом заболевания туберкулезом, и треть населения в мире заражена возбудителем туберкулеза, Mycobacterium tuberculosis, известным в повседневной жизни как бацилла Коха или KB (Koch's bacillus, KB). Таким образом, туберкулез является второй по значимости причиной смертности от инфекционных заболеваний, сразу после инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (1). По этой причине, наряду с Всемирной организацией здравоохранения, Европейское сообщество также считает исследования в этой области приоритетными.

Были определены три главные задачи:

а) предупреждение заболевания путем создания вакцины, которая обеспечит лучшую защиту, чем существующая в настоящее время вакцина, BCG (Bacillus of Calmette and Guerin, бацилла Кальмета-Герена);

б) улучшение средств быстрого диагностирования заболевания туберкулезом; и

в) обнаружение более быстрых способов лечения, которые облегчают назначение лекарств и, таким образом, позволяют избежать возникновения штаммов бактерий с множественной устойчивостью.

Неудовлетворительное обнаружение новых случаев заболевания туберкулезом считают главной причиной увеличения числа случаев заболевания туберкулезом в мире (2). Исследование под микроскопом и выращивание бактерий из мокроты признаны в качестве двух надежных путей диагностики легочного туберкулеза. Однако результаты выращивания культуры микобактерий могут быть интерпретированы только после 6-8 недель, и развивающиеся страны не всегда имеют доступ к инфраструктуре, которая требуется для такой методики, что существенно ограничивает полезность культивирования в качестве первостепенного диагностического теста (3). Обнаружение кислотоустойчивых бацилл в мокроте, таким образом, остается наиболее практичным тестом для быстрого диагностирования легочного туберкулеза, но идентификация, к сожалению, является положительной только в 50%-60% случаев легочного туберкулеза отчасти из-за того, что фактически необходимо 5000-10000 бацилл на мкл мокроты для того, чтобы тест дал положительный результат (3). Диагностирование легочного туберкулеза является еще более трудным у детей, которые, в силу своего возраста, редко отхаркивают мокроту и у которых обычно собирают желудочный сок. Однако прямое исследование таких проб является положительным менее чем у 20% детей, у которых доказано наличие туберкулеза, что гораздо ниже, чем результаты, полученные у взрослых (4). Наконец, диагностирование внелегочной формы туберкулеза, который встречается гораздо чаще у детей, чем у взрослых, до сих пор является трудной задачей. Оно часто базируется, главным образом, на анатомо-патологическом исследовании биопсий. Обычным гистологическим признаком наличия туберкулеза является присутствие гранулем совместно с казеозным некрозом. Гранулема образуется из гистоцитов, эпителиальных клеток и/или гигантских клеток типа клеток Лангерганса. Тем не менее, как образцы из лимфатических ганглий, так и легочные образцы при постановке диагноза могут быть интерпретированы, как соответствующие инфекционным (вызванным не туберкулезными микобактериями, грибковой природы, и т.д.) или не инфекционным заболеваниям (саркоидоз, гранулематоз Вегенера и т.д.) (5). Чтобы подтвердить туберкулез в качестве диагноза, должно быть проведено гистологическое исследование с помощью применения специальных красителей, в частности с помощью окрашивания по методу Циля-Нильсена, при котором используют спирто-кислотоустойчивые свойства туберкулезных микобактерий. Тем не менее, чтобы получить положительный результат при окрашивании по методу Циля-Нильсена, содержание микроорганизмов должно составлять 10⁶ на миллиметр ткани (6).

В конечном итоге, диагноз до сих пор часто основан на наборе клинических или радиологических данных и на результатах тестирования кожи на гиперчувствительность замедленного типа к туберкулину (очищенные производные протеина, (очищенное производное белка, purified protein derivative, PPD)). Однако указанный тест не позволяет легко различать лиц, зараженных Mycobacterium tuberculosis, и тех, которые вакцинированы BCG, а перекрестные реакции с микобактериями окружающей среды делают его специфичность недостаточной. Такой тест, который базируется на проявлении клеточного иммунитета, также имеет малую чувствительность у лиц с иммунодефицитом. В конечном итоге, хотя указанный тест позволяет идентифицировать лиц, инфицированных Mycobacterium tuberculosis среди не вакцинированного населения, он, к сожалению, не помогает дифференцировать лиц, имеющих скрытую форму туберкулеза (бессимптомную), от лиц с активной формой заболевания. Фактически только у 5%-10% лиц, инфицированных Mycobacterium tuberculosis, болезнь развивается, в то время как остальные, даже будучи инфицированными, защищены от заболевания (7). Таким образом, применение на практике указанного теста чрезвычайно ограничено.

Совсем недавно появились молекулярно-биологические методы обнаружения наличия Mycobacterium tuberculosis с использованием способа ПЦР (полимеразная цепная реакция). Такие способы являются чувствительными (95%), но в особенности это справедливо для образцов мокроты, для которых прямое исследование дает положительный результат. В отличие от других методик, данный способ имеет высокую специфичность (98%), которая позволяет отличить Mycobacterium tuberculosis от других микобактерий. Однако способ является дорогим, что ограничивает его применение.

Таким образом, разработка новых способов быстрого диагностирования туберкулеза является делом крайней необходимости. Один из возможных подходов состоит в использовании различий между иммунными реакциями, которые могут существовать между неинфицированными пациентами и инфицированными лицами в зависимости от того, имеют они или нет активную форму заболевания. Различные тесты, которые основаны на изучении индуцированной с помощью микобактериальных антигенов секреции IFN-γ в циркулирующих лимфоцитах, уже были описаны в литературе (8). Анализ секреции IFN-γ, индуцированной с помощью туберкулина, сложной смеси микобактериальных антигенов, тем не менее, имеет те же ограничения, что и при использовании для кожного теста. Фактически, будут реагировать все сенсибилизированные лица как имеющие, так и не имеющие заболевание и лица, сенсибилизированные к антигенам, присутствующим в некоторых атипичных микобактериях, или в BCG. Преимущество этого теста по сравнению с кожным тестированием заключается в том, что анализ реакции лимфоцитов параллельно с положительным контролем (фитогемагглютинина) позволяет обнаружить пациентов, которые не реагируют на PPD по причине острого иммунодефицита. Позднее были изолированы специфичные антигены для Mycobacterium tuberculosis, которые использовали при тестах по секреции IFN-γ in vitro, и специфичность указанного тестирования была, очевидно, гораздо лучшей. По существу, можно использовать антигены ESAT-6 и CFPIO, однако следует указать, что дифференциация, получаемая с помощью этих антигенов, между больными или здоровыми, но инфицированными пациентами все еще далека от совершенства (9).

Исследование иммунных реакций у человека в отношении "связывающего гепарин гемагглютина" (heparin binding haemagglutin, HBHA) показывает превосходные возможности различения больных, и здоровых, и инфицированных индивидуумов. HBHA представляет собой адгезивную молекулу, которая экспрессируется на поверхности бактерий и входит в состав микобактериального комплекса, но не на поверхности непатогенных бактерий, в частности М. smegmatis (10). Этот белок секретирует Mycobacterium tuberculosis, и он отвечает за распространение инфекции (11). HBHA имеет метилированную С-концевую область, которая экспонирована на поверхности клетки, в то время как неметилированная N-концевая область заякорена в клеточной стенке микобактерии (12). Метилирование важно не только для стимулирования иммунных реакций у человека, но также для стимулирования защитной иммунной реакции у мышей (13). Было показано, что индуцированная секреция IFN-γ в циркулирующих лимфоцитах путем стимуляции HBHA in vitro отличается в зависимости от того, имели ли лица, инфицированные туберкулезными микобактериями, выраженную форму заболевания, или нет (14). В то время как IFN-γ выделяется периферическими лимфоцитами у большинства здоровых пациентов в ответ на HBHA, только небольшое количество туберкулезных пациентов реагируют на этот антиген путем выделения IFN-γ. Однако различия между этими двумя группами лиц на основе этих предварительных результатов оказались недостаточными для проведения диагностического теста.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение способов обнаружения у млекопитающих инфекции Mycobacterium tuberculosis in vitro.

Задачей настоящего изобретения также является обеспечение способов различения in vitro млекопитающих, инфицированных туберкулезными микобактериями, у которых заболевание выражено, и инфицированных млекопитающих, у которых туберкулез не развился, способа идентификации in vitro пациентов с латентной формой ТВ среди здорового населения и способа различения in vitro млекопитающих с активной формой туберкулеза, в отличие от млекопитающих, не инфицированных Mycobacterium tuberculosis или имеющих латентную форму туберкулеза.

Кроме этого, задачей настоящего изобретения является обеспечение наборов, которые включают все компоненты, необходимые для определения инфекции, вызванной Mycobacterium tuberculosis, и с помощью которых можно отличить инфицированных пациентов, у которых заболевание выражено (активная форма туберкулеза), и инфицированных пациентов, у которых заболевание протекает без симптомов (латентная форма туберкулеза), и набор для различения млекопитающих с активной формой туберкулеза, и млекопитающих, не инфицированных Mycobacterium tuberculosis или имеющих латентную форму туберкулеза.

Настоящее изобретение также относится к применению НВНА в его нативной или рекомбинантной форме в тесте для определения инфекции Mycobacterium tuberculosis и для различения пациентов, которые имеют латентную форму туберкулеза и пациентов, у которых присутствуют все симптомы туберкулеза и развилось заболевание.

Настоящее изобретение направлено на решение этих и других задачи, как станет понятно из последующего краткого описания и подробного описания с предпочтительными примерами реализации настоящего изобретения, а также из формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение описывает способ обнаружения и различения in vitro млекопитающего, которое имеет латентную форму туберкулеза, и млекопитающего с активной формой туберкулеза, при этом указанный способ включает: а) получение биологического образца от указанного млекопитающего; б) измерение количества антител (IgG), направленных против двух различных форм белка НВНА, которые присутствуют в указанном биологическом образце; и в) сравнение титров антител, полученных для двух указанных форм белка НВНА, при этом относительные количества антител против указанных двух различных форм у млекопитающего, которое имеет латентную форму туберкулеза, отличаются от указанного относительного количества у млекопитающего, которое имеет активную форму туберкулеза.

Настоящее изобретение также охватывает набор для обнаружения и различения млекопитающего с латентной формой туберкулеза и млекопитающего с активной формой туберкулеза, причем указанный набор содержит

две различные формы НВНА, выбранные из группы, включающей: а) нативный НВНА и рекомбинантный НВНА, или б) rНВНАΔС - фрагмент и метилированный С-концевой фрагмент НВНА;

реагенты, требуемые для создания среды для осуществления иммунологической реакции между содержащимися в биологическом образце антителами от упомянутого млекопитающего и указанными различными формами НВНА, и

реагенты, позволяющие обнаружить иммунологические комплексы, образующиеся в ходе указанной иммунологической реакции.

Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения и различения in vitro млекопитающего с латентной формой туберкулеза и млекопитающего с активной формой туберкулеза, или идентификации млекопитающего, которое имеет латентную форму туберкулеза среди здоровой популяции, при этом указанный способ включает:

а) получение биологического образца от указанного млекопитающего;

б) приведение указанного биологического образца независимым образом в контакт с нативной формой НВНА и ESAT-6;

в) измерение величины НВНА-специфической секреции IFN-γ и ESAT-6 - специфической секреции IFN-γ; и

г) расчет отношения между величиной НВНА-специфической секреции IFN-γ и величиной ESAT-6 - специфической секреции IFN-γ, при котором указанное отношение, полученное для млекопитающего с латентной формой туберкулеза, больше, чем указанное отношение, полученное для млекопитающего с активной формой туберкулеза, или полученное для млекопитающего, не инфицированного Mycobacterium tuberculosis.

Настоящее изобретение также относится к набору для обнаружения и различения млекопитающего, которое имеет латентную форму туберкулеза, и млекопитающего с активной формой туберкулеза, или для идентификации млекопитающего с латентной формой туберкулеза среди здоровой популяции, причем указанный набор содержит

нативную форму НВНА и ESAT-6,

реагенты, требуемые для создания среды для осуществления независимым образом взаимодействия клеток биологического образца от упомянутого млекопитающего с нативным НВНА и ESAT-6, и

реагенты для обнаружения секреции IFN-γ, следующей за указанным взаимодействием.

Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения и различения in vitro млекопитающего с активной формой туберкулеза и млекопитающего, не инфицированного Mycobacterium tuberculosis, или млекопитающего, которое имеет скрытую (латентную) форму туберкулеза; при этом указанный способ включает:

а) получение биологического образца из очага локальной инфекции указанного млекопитающего;

б) приведение в контакт упомянутого биологического образца с нативной или рекомбинантной формой НВНА; и

в) измерение влияния указанного контакта на НВНА-специфическую секрецию IFN-γ, при котором влияние на НВНА-специфическую секрецию IFN-γ больше у млекопитающих с активной формой туберкулеза по сравнению с млекопитающим, которое не инфицировано Mycobacterium tuberculosis, или млекопитающим, которое имеет латентную форму туберкулеза.

В настоящем изобретении также описан набор для обнаружения и различения млекопитающего с активной формой туберкулеза и млекопитающего, не инфицированного Mycobacterium tuberculosis или имеющего латентную форму туберкулеза, причем указанный набор содержит

нативную или рекомбинантную форму НВНА,

реагенты, требуемые для создания подходящей среды для осуществления взаимодействия клеток биологического образца от указанного млекопитающего с НВНА, и

реагенты, которые позволяют обнаружить IFN-γ после указанного взаимодействия.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1 показано содержание (титр) НВНА-специфического IgG у пациентов, больных туберкулезом (ТВ), и у лиц с латентной формой туберкулеза (PI). Прямоугольники показывают 25-й и 75-й процентили. Вертикальные линии показывают максимальные значения. Между указанными двумя популяциями не наблюдается существенных различий (р>0.05).

На Фигурах 2(А,Б) показаны для сравнения титр nНВНА-специфического IgG и rНВНА-специфического IgG у пациентов, больных туберкулезом (ТВ), и у лиц со скрытой (латентной) формой туберкулеза (PI).

Фигура 2А иллюстрирует, что у пациентов со скрытой формой туберкулеза IgG распознает нативную метилированную форму НВНА лучше, чем рекомбинантную форму (rНВНА) (р=0,0015), в то время как у пациентов, больных туберкулезом (Фигура 2Б), это различие незначительно (р>0.05).

Фигуры 3(А,Б) показывают титр rНВНАΔС-специфического IgG в сравнении с титром IgG, специфичного к С-концевому фрагменту НВНА (С-пептиду у пациентов, больных туберкулезом (ТВ), и у пациентов с латентной формой туберкулеза (PI)).

На Фигуре 3А показано, что туберкулезные пациенты имеют IgG, который предпочтительно распознает усеченную рекомбинантную форму (rНВНАΔС), в то время как IgG пациентов с латентной формой туберкулеза практически не распознает эту форму (р=0.0052). В противоположность этому, на Фигуре 3Б, IgG у туберкулезных больных не распознает С-пептидный фрагмент в отличие от пациентов с латентной формой туберкулеза (р=0.0478).

На Фигуре 4 показана секреция IFN-γ в ответ на nНВНА у контрольных пациентов (ctrl; n=12), у пациентов с непродолжительной латентной формой туберкулеза (<5 лет) (PI; n=38) и у туберкулезных больных (ТВ; n=46). Значения медиан соответственно составляют 10 пг/мл, 2040 пг/мл и 16 пг/мл.** р<0.001.

На Фигуре 5 показана секреция IFN-γ в ответ на ESAT-6 у пациентов с латентной формой туберкулеза (PI) и туберкулезных пациентов (ТВ). У пациентов с латентной формой туберкулеза уровень специфической ESAT-6-индуцированной секреции IFN-γ существенно ниже, чем у туберкулезных пациентов. Значения медиан составляют 42.50 пг/мл IFN-γ для ESAT-6 у РI-пациентов и 4072 пг/мл IFN-γ у ТВ-пациентов (р=0.02).

На Фигуре 6 представлены значения отношения nHBHA/ESAT-6 у больных туберкулезом пациентов и у пациентов с латентной формой туберкулеза. Значения медиан соответственно составляют 0.1 пг/мл и 146.2 пг/мл. Это отношение значительно отличается у пациентов с латентной формой туберкулеза (р=0.001) и представляет хороший критерий различения инфицированных пациентов с развившейся болезнью и инфицированных, но не больных пациентов (без наличия симптомов).

На Фигуре 7 показано влияние блокирующих антител против трансформирующего фактора роста бета-1, -2, -3 (transforming growth factor beta, TGFβ), на секрецию IFN-γ в ответ на nНВНА мононуклеарами периферической крови (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) у больных туберкулезом пациентов. IFN-γ анализировали в супернатанте культуральной среды. Парный тест (Вилкоксон - р=0.0161; n=15 пар).

На Фигуре 8 показано сравнение между секрецией IFN-γ в ответ на nНВНА и на PPD мононуклеарами плевральной жидкости, отобранной у пациентов с плевральным выпотом туберкулезного или иного происхождения. IFN-γ анализировали в супернатанте среды для культивирования. Горизонтальные линии показывают средние значения.

Фигура 9 иллюстрирует то, что количество CD³⁺CD⁴⁺ Т лимфоцитов из PBMC (PBMC nНВНА) по сравнению с количеством плевральных CD³⁺CD⁴⁺ Т лимфоцитов (лимфо-плевральный nНВНА) и которые содержат внутрицитоплазмический IFN-γ, как следствие действия nНВНА, выраженное в процентах от клеток, вырабатывающих IFN-γ, после стимуляции НВНА в течение 16 часов, меньше, чем процент клеток, вырабатывающих IFN-γ без стимуляции НВНА у больных туберкулезом пациентов (n=7). Значения соответственно равны 0.04% и 1.23% (р=0.0156; Вилкоксон).

На Фигуре 10 представлены относительные количества CD³⁺CD⁴⁺ Т лимфоцитов, которые содержат внутрицитоплазмический IFN-γ после воздействия nНВНА в случае плеврального туберкулеза (n=7; медиана = 1.23%) и в случае плевральных выпотов нетуберкулезного происхождения (n=2; медиана = 0.18%).

На Фигурах 11(А,Б) показаны относительные количества CD³⁺CD⁴⁺ (Фигура 11А) и CD³⁺CD⁸⁺ (Фигура 11Б) Т лимфоцитов, содержащих внутрицитоплазматический IFN-γ в ответ на стимуляцию с помощью nНВНА.

На Фигуре показаны количества альвеолярных лимфатических клеток (альвеолы) из жидкости бронхо-альвеолярного лаважа или мононуклеаров периферической крови (кровь). Жидкость бронхо-альвеолярного лаважа получали или от пациентов с легочным туберкулезом (ТВ) или от контрольных пациентов с легочным поражением нетуберкулезного происхождения.

На Фигуре 12 показаны кривые ROC, которые позволяют различать пациентов с латентной формой ТВ и лиц из контрольной группы от nНВНА-специфической секрецией IFN-γ - (А), различать пациентов с латентной формой ТВ и активной формой ТВ от nНВНА-специфической секреции IFN-γ (Б) и различать латентную форму ТВ и активную форму ТВ от PPD-специфической секреции IFN-γ (В).

В отношении чертежей, описанных выше:

NS означает, что различия незначительны,

* означает, что различия значительны в диапазоне 0.01<р<0.05, и

** означает, что различия весьма значительны с р<0.01.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ СПОСОБОВ РЕАЛИЗАЦИИ

Используемый в контексте настоящего изобретения термин "млекопитающее" обозначает любых теплокровных животных, имеющих волосяной покров или покрытых шерстью, которые выкармливают грудью своих детенышей и вынашивают живых детенышей. Термин "млекопитающее" БЕЗ ОГРАНИЧЕНИЯ включает человека, слонов, свиней, собак, кошек, крупный рогатый скот, оленей, обезьян и т.д.

Хотя Mycobacterium tuberculosis инфицируют главным образом организм человека, другие млекопитающие могут быть также поражены этим бактериальным заболеванием. Случаи заражения туберкулезом млекопитающего, отличного от человека, известны под названием "обратный зооноз", т.к. Mycobacterium tuberculosis может передаваться от человека к животному.

Аббревиатура "НВНА" означает "heparin binding haemagglutinin ahesin, адгезин гемагглютинина, связывающий гепарин" и представляет собой поверхностный белок, участвующий в процессе адгезии с эпителиальными клетками (номера в базе Genbank AF074390 и ААС26052.1). Идентификация НВНА - протеина в его нативной форме - была описана Menzozzi et al. (J Exp Med 184; 993-1001 (1996)). НВНА представляет собой 199 аминокислотный белок, С-концевая часть которого обогащена лизином и содержит участок связывания гепарина. Этот белок требуется при внелегочной диссеминации Mycobacterium tuberculosis (Pethe et al., Nature 412: 190-194 (2001)).

Рекомбинантная форма НВНА (rНВНА) описана во французской патентной заявке FR-A-01/14953, в которой сообщается, что в отличие от нативного НВНА - белка (nНВНА), рекомбинантный белок НВНА не метилирован по остаткам лизина в С-концевой части.

Фрагмент rНВНАΔС описан у Pethe et al. (2000, Journal of Biological Chemistry 275 (19): 14273-14280). Этот фрагмент получают из рекомбинантной формы НВНА, для чего удаляют аминокислоты 161-199. Метилированный С-концевой фрагмент содержит аминокислоты с 161 по 199 в следующей последовательности:

ККААР АККААР АККААР AKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK (SEQ Е) NO: 1.)

Содержание всех указанных выше источников полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

В соответствии с контекстом настоящего изобретения, аббревиатура "РВМС" означает "мононуклеары периферической крови". РВМС, описанные в настоящем изобретении, можно получить любым способом, известным из литературы; в соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения, РВМС получают с помощью градиента плотности из проб венозной крови с использованием раствора, который содержит примерно 9.1% (м/об.) диатриазоата натрия и примерно 5.7% полисахарида. Указанный раствор имеет градиент плотности примерно 1.077±0.001 г/мл и осмотическое давление 280±15 мОсм. Этот раствор имеет торговое наименование Lymphoprep™.

Термины "латентный (скрытый) туберкулез" или "латентная форма (инфекции) Mycobacterium tuberculosis" или "латентная форма туберкулеза" используют в настоящей заявке взаимозаменяемым образом, и они означают, что млекопитающее инфицировано бактериями комплекса Mycobacterium tuberculosis, но не имеет симптомов болезни, т.е. у него не развиваются симптомы туберкулеза. Кроме того, указанное инфицированное млекопитающее не может передавать туберкулез другим млекопитающим, так как в мокроте не присутствуют инфекционные туберкулезные бактерии. Другими словами, млекопитающее инфицировано, но заболевание у него не развивается.

Различные формы туберкулеза классифицируют следующим образом:

ТВО: отсутствует контакт с туберкулезным агентом; отсутствует инфицирование;

ТВI: контакт с Mycobacterium tuberculosis, степень инфицирования неизвестна;

ТВ2: инфицирование туберкулезным агентом, отсутствуют симптомы развития заболевания (положительная реакция на туберкулин при кожном тестировании: положительный PPD);

ТВ3: активная форма туберкулеза, полностью диагностируемая;

ТВ4: клинически неактивная форма туберкулеза, соответствующим образом пролеченная или в стадии ремиссии; и

ТВ5: предположение на туберкулез, в ходе диагноза ("исключить" ТВ).

Выражение "здоровая популяция", в соответствии с контекстом настоящего изобретения, относится к лицам, у которых нет симптомов развития туберкулеза, вне зависимости от наличия инфекции, т.е. не инфицированных (ТВ0) или инфицированных, но здоровых (латентный туберкулез; ТВ2).

Способы и наборы, описанные в контексте настоящего изобретения, помогают различать форму ТВ3 и формы ТВ2; форму ТВ2 и формы ТВ0; и форму ТВ3 и формы ТВ0 в указанной выше классификации.

Аббревиатура PPD означает " очищенное производное туберкулина, tuberculin protein-purified derivative". Туберкулез обычно диагностируют с помощью теста, который включает внутрикожное введение PPD. Результат этого теста рассматривают как положительный на туберкулез, если реакция кожи в месте воздействия PPD превышает определенный размер, например 10 мм или более.

Термин "биологический образец", как определено в настоящем изобретении, охватывает образцы из дыхательных путей и из других локализаций. "Образцы из дыхательных путей" включают бронхиальные выделения, бронхо-альвеолярные лаважи (broncho-alveolar lavages, BAL), лаваж желудка и мокроту. Примеры образцов не из дыхательных путей, которые могут быть использованы в способах реализации настоящего изобретения, включают образцы выпотов, в частности, плевральной, абдоминальной и суставной жидкостей, цереброспинальной жидкости, спинно-мозговой жидкости, синовиальной жидкости, брюшинной (перитонеальной) жидкости, перикардиальной жидкости и других жидкостей организма; биопсии лимфатических узлов, трансбронхиальных, плевральных и печеночных биопсий, медуллярных и поясничных пункций, образы мочи или крови (РВМС или мононуклеары периферической крови), гнойные выделений и т.д.

Термин "из очага инфекции" включает любой биологический образец, отобранный из места, пораженного туберкулезной инфекцией, и охватывает все упомянутые выше и другие биологические образцы.

Способы согласно настоящему изобретению позволяют, с одной стороны, обнаружить in vitro иммунную реакцию у зараженного млекопитающего на белок НВНА Mycobacterium tuberculosis, что является признаком инфицирования указанным патогенным агентом, а с другой стороны, различать in vitro, возможно дополнительно к существующим способам диагностики, скрытую форму и активную форму туберкулеза, другими словами, соответственно не инфекционную и инфекционную форму заболевания.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения и различения in vitro млекопитающего, которое имеет латентную форму туберкулеза, и млекопитающего с активной формой туберкулеза, при этом указанный способ включает:

а) получение биологического образца от указанного млекопитающего;

б) измерение количества антител (IgG), направленных против двух различных форм белка НВНА, которые присутствуют в указанном биологическом образце; и

в) сравнение титров антител, полученных для двух форм белка НВНА, при этом относительные количества антител, полученных против указанных двух различных форм у млекопитающего с латентной формой туберкулеза отличаются от указанного относительного количества у млекопитающего с активной формой туберкулеза.

На основании биологического образца от млекопитающего и с использованием характеристик иммунных реакций, направленных против белка НВНА туберкулезных микобактерий, которые являются специфическими для различных форм туберкулеза (активной в сравнении с латентной), указанный способ позволяет распознавать инфицированных млекопитающих, которые больны, и тех, которые не являются больными. Таким образом, млекопитающие, которые имеют латентную форму туберкулеза, и млекопитающие с активной формой туберкулеза имеют иммунные реакции, в частности гуморальные иммунные реакции, которые различны в отношении белка НВНА.

Антитела, в частности, иммуноглобулины G (IgG), которые происходят от млекопитающих с латентной формой туберкулеза и от млекопитающих с активной формой туберкулеза, распознают различные участки белка НВНА. Таким образом, можно корректировать структуру белка НВНА с получением отдельных форм НВНА и распознавать различные формы туберкулеза. Термин "отдельная форма НВНА" означает любое изменение (модификацию) в структуре белка НВНА в отношении количества (удаление или добавление) и/или природы его аминокислотных остатков (замещение аминокислот, которые имеют одинаковый или различный размер, заряд, стерическое несоответствие), и/или любую посттранскрипционную модификацию, в частности ацетилирование, амидирование, биотинилирование, карбоксилирование, гидроксилирование, метилирование, фосфорилирование, или сульфатирование, или добавление остатков липидов (изопренилирование, пальмитинирование и миристинирование), глицидов (гликозилирование) или полипептидов (убиквитинирование). В контексте настоящего изобретения, две формы называют отличными (отдельными), когда их антитела от млекопитающих, которые имеют латентную форму и антитела от млекопитающих с активной формой туберкулеза, распознают указанные две формы различным образом.

Титрование, т.е. определение количества антител (серологическое тестирование), распознающих каждую форму НВНА, выполняют независимым образом с применением любой методики, которая известна специалистам в данной области, в частности, прямым или непрямым способом ELISA (твердофазный иммунно-ферментный анализ) или с помощью радиоиммунологического анализа (RIA), в которых антитела, которые содержаться в биологическом образце, приводят в контакт с отдельными формами НВНА. "Независимым образом" означает, что часть образца приводят во взаимодействие с одной из форм белка НВНА, а другую часть образца приводят в контакт со второй формой белка НВНА. Контактирование между антителами, присутствующими в образце, и формами НВНА, которое позволяет им взаимодействовать, и обнаружение указанного взаимодействия осуществляют при соответствующих условиях, известных специалистам в данной области. Так, в качестве примера, можно изменить следующее: методику нанесения антигена (НВНА) на подложку, разведение биологического образца, концентрации отдельных форм НВНА, температуру и время контактирования и, если потребуется, происхождение и концентрацию вторичных антител, также как и параметры, позволяющие обнаруживать взаимодействие, в частности, уменьшение фонового шума, выбор способа мечения (радиоактивная метка, флуорохромы), или время накопления детектируемого сигнала.

В одном из примеров протокола ELISA отдельные формы НВНА разводят в подходящем буфере (нанесение) в концентрации в пределах от 1 до 10 мкг/мл и выдерживают (50-200 мкл) в лунках микропланшетов в течение 1-6 часов при комнатной температуре (room temperature, RT) или в течение ночи при 4°С. Обычно используемые буферные растворы представляют собой раствор карбоната натрия - 50 мМ, рН 6.9; 20 мМ трис-HCL рН 8.5 или 10 мМ PBS, рН 7.2-7.4. Планшет затем промывают раствором для отмывки (200-300 мкл), содержащим 0.1 М PBS или TBS, рН 7.4, с добавлением детергента, такого как Triton или Tween 20 (конечная концентрация 0.01%-0.05%). Затем наносят насыщающий (блокирующий) раствор (200-300 мкл), такой как PBS, содержащий сухое обезжиренное молоко, казеин или желатин, чтобы блокировать неспецифическое взаимодействие, в течение 30-60 минут при 37°С или при комнатной температуре, затем избыток удаляют с помощью многократных промываний. Растворенный (1/10-1/1000) биологический образец (100-200 мкл) выдерживают в течение от 30 минут до 2 часов при 37°С или при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С, с последующим многократным отмыванием. Вторичные антитела (примерно 100 мкл), растворенные в блокирующем растворе, затем добавляют на время от 30 минут до 2 часов при комнатной температуре или при 37°С. Избыток удаляют посредством многократных промываний. Если необходимо, субстрат (100 мкл) добавляют на 1-5 минут в темноте при комнатной температуре, с последующим нанесением stop-раствора.

Результаты титрования позволяют сравнивать два значения, полученные для двух отдельных форм для одного и того же млекопитающего. Такое сравнение, выполненное одновременно для одного или более млекопитающих, которые имеют латентную форму туберкулеза, и для одного или более млекопитающих с активной формой туберкулеза, дает существенно различные результаты из-за специфического характера иммунной реакции, которая происходит у инфицированных млекопитающих.

Как было показано ранее во французском патенте (FR-A-01/14953), нативная форма НВНА (nНВНА) метилирована по лизиновым остаткам С-концевой области белка. В противоположность этому, рекомбинантный белок НВНА (rНВНА) имеет другую степень метилирования, так как он не подвергается таким посттрансляционным модификациям.

Применение нативных или рекомбинантных форм таким образом показало, что биологические образцы от млекопитающих с активной формой туберкулеза содержат соизмеримые количества антител, направленных против нативной и рекомбинантной форм, что показывает, что у таких млекопитающих антитела распознают один и тот же участок белка (N-концевую область). В противоположность, в биологических образцах от млекопитающих, которые имеют латентную форму туберкулеза, имеют титр антител, направленных против нативной формы, выше, чем титр антител, направленных против рекомбинантной формы, что показывает, что у этих млекопитающих антитела предпочтительным образом распознают метилированную нативную форму. Таким образом, эти результаты позволяют распознать латентную и активную формы туберкулеза путем сравнения количеств (титров) антител, направленных против нативной и рекомбинантной форм НВНА.

Две другие индивидуальные формы НВНА, используемые в контексте настоящего изобретения - это фрагмент rНВНАΔС, который представляет собой N-концевую область белка (аминокислоты 1-160), и метилированный С-концевой фрагмент. Сравнение титров антител, полученных из биологических образцов, показало, что у млекопитающих с латентной формой туберкулеза наблюдается преобладание антител, распознающих метилированный С-концевой фрагмент, в то время как у млекопитающих с активной формой туберкулеза преобладают антитела, распознающие rНВНАΔС-фрагмент.

Такой способ сравнения относительных количеств (титров) антител можно применить к любому биологическому образцу, содержащему IgG. Еще в одном аспекте настоящего изобретения, указанный способ осуществляют с образцами крови.

Настоящее изобретение также обеспечивает набор для обнаружения и различения млекопитающего, которое имеет латентную форму туберкулеза, и млекопитающего с акти