Способ скрининга для отбора растений, обнаруживающих пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением

Способ скрининга для отбора растений, обнаруживающих пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу скрининга популяции растений или частей растений на присутствие в ней особей, обнаруживающих пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением, по сравнению с контрольным растением или частью растения.

Уровень техники

Из-за увеличивающегося спроса обработка свежего продукта, в частности салата, значительно увеличилась за последние годы. Сбор и обработка салата вовлекают обширное срезание листьев, которое вызывает сильную реакцию на повреждение. Эта реакция на повреждение приводит к быстрому ухудшению обработанного продукта. Это ухудшение проявляется в нарушении окраски из-за ферментативного потемнения или порозовения на и вокруг поврежденной поверхности, дыхания и высушивания из-за испарения. В особенности ферментативному потемнению или порозовению придают существенное значение при прямом или косвенном определении общего качества свежесобранных, упакованных листовых овощей, таких как салат и радиккио.

Более того, вследствие такого повреждения, может значительно увеличиться количество микроорганизмов, которые могут поставить под угрозу безопасность продукта. Высокоскоропортящаяся природа обработанного салата приводит к сильному ухудшению цвета, неприятному аромату и ухудшению строения ткани в восприятии потребителем, которые препятствуют более быстрому росту, чем настоящий, так называемого рынка удобства.

Другие овощи, такие как картофель, грибы, сельдерей, артишок и баклажан, а также фрукты и цветы могут быть подвергнуты нежелательному нарушению окраски. Например, фрукты, такие как банан, яблоко, груша, авокадо, манго, персик и абрикос и т.д., быстро темнеют, будучи нарезанными или очищенными. При предложении этих фруктов в обработанном виде, таком как нарезанные ломтики, нарезанные кубики, очищенные или во фруктовых салатах, должны быть приняты определенные меры.

Нарезанные цветочные стебли, например, из герберы или хризантем могут также быть склонны к нарушению окраски, которое нежелательно с коммерческой точки зрения, поскольку потребители считают нарушения окраски непривлекательными, таким образом, снижая конкурентоспособность продукта.

Чтобы ингибировать процесс ухудшения в овощах, таких как салат, было разработано много химических или физических послеуборочных обработок урожая, которые могут быть использованы для замедления ухудшения обработанного салата.

Среди них упаковка свежесрезанного салата в модифицированной газовой среде, использование съедобных покрытий, обработка тепловым шоком и добавление химических веществ, которые ингибируют ферментативное потемнение. Когда свежесрезанный салат упакован в атмосфере пониженного кислорода при низких температурах, ферментативное потемнение может быть существенно снижено. Однако такая модифицированная среда с низким содержанием кислорода приводит к анаэробному дыханию, которое создает неприятный привкус и неприятный аромат продукта, который воспринимается как очень непривлекательный.

Съедобные покрытия являются тонкими слоями материалов, которые действуют как физический барьер изоляции и которые эффективно защищают продукт от различных видов ухудшения, таких как испарение и потемнение. Эти покрытия могут, например, быть сделаны из смол, полисахаридов или белка.

Было дополнительно продемонстрировано, что потемнение свежесрезанного салата может быть предотвращено путем применения кратковременного теплового шока в течение 90 секунд при 45°C, сразу же после обработки. Возможно, тепловой шок переводит биосинтез белка от ферментов, вовлеченных в процесс повреждения, к белкам теплового шока, таким образом, снижая ферментативную способность потемнения. В качестве альтернативы, влияние обработки тепловым шоком на потемнение может быть объяснено термочувствительностью ферментов, вовлеченных в процесс нарушения окраски.

Химическими веществами, которые могут быть использованы, могут быть, например, восстановители, такие как витамин C, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, комплексообразователи, такие как циклодекстрин и ингибиторы ферментов, такие как L-цистеин. Применение химических веществ в свежих продуктах, очевидно, вовлекает вопрос безвредности пищевых продуктов и требует разрешения контролирующего органа. Могут быть использованы комбинации послеуборочных технологий, описанных выше, и, в конечном счете, используемая процедура является компромиссом между технологической эффективностью, стоимостью и безвредностью продуктов.

Независимо от используемой технологии улучшение послеуборочного качества обработанного салата окажется затратным, и поэтому существует очевидная потребность в области техники в разработке альтернатив, которые устранят или снизят потребность в применении физических или химических послеуборочных технологий.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка способа скрининга для отбора растений, которые обнаруживают пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением, для получения растений и происходящего из них потомства, устойчивых к послеуборочным нарушениям в результате обработки, таким как ферментативное потемнение или порозовение. Нарушение окраски при повреждении может также быть видимым в частях растений, таких как стебли, семена, плоды, листья, цветы, клубни, побеги и т.д. Таким образом, дополнительной целью изобретения является разработка способа скрининга для отбора растений, обнаруживающих пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением, в их частях растения.

Изобретение, таким образом, относится к способу скрининга популяции растений или частей растений на присутствие в ней особей, обнаруживающих пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением, по сравнению с контрольным растением или частью растения, который включает:

a) получение популяции растений или частей растений из популяции;

b) в случае необходимости, создание поврежденной поверхности на растениях или частях растений;

c) инкубацию поврежденных поверхностей, созданных на них, для появления нарушения окраски в них и на них;

d) наблюдение нарушения окраски в или на растениях или частях растений;

e) сравнение наблюдаемого нарушения окраски с нарушением окраски, наблюдаемым на или в контрольном растении или части растения для идентификации растений или частей растений, обнаруживающих отсутствие нарушения окраски или нарушение окраски, сниженное по сравнению с контрольным растением или частью растения.

Способ согласно настоящему изобретению имеет два главных варианта осуществления. В первом варианте осуществления нарушение окраски является результатом превращения эндогенного субстрата. Такое нарушение окраски возникнет спонтанно при инкубации растения или части растения в определенной среде в течение определенного количества времени. Нарушение окраски в этом случае вызвано повреждением. Изобретение, в частности, относится к естественно возникающим реакциям ферментативного порозовения и потемнения. Способ скрининга по изобретению предназначен для идентификации растений, которые не обнаруживают эту реакцию или обнаруживают пониженную реакцию по сравнению с контролем.

Во втором варианте осуществления нарушение цвета вызвано превращением добавленного экзогенного субстрата, который может быть превращен в окрашенный субстрат, становящийся видимым при возникновении реакции в растении. Такая цветная реакция может быть или может не быть вызванной повреждением. Это происходит, например, также в оболочках ненарушенных семян. Способ скрининга по изобретению предназначен для идентификации растения, не обнаруживающего эту реакцию или обнаруживающего пониженную реакцию по сравнению с контролем.

Последний вариант осуществления относится, более конкретно, к способу скрининга популяции растений или частей растений на присутствие в ней особей, обнаруживающих пониженное нарушение окраски по сравнению с контрольным растением или частью растения, который включает:

a) получение популяции растений или частей растений из популяции;

b) инкубацию растений или частей растений с субстратом, который может быть превращен в окрашенный пигмент, для появления нарушения окраски в них или на них;

c) наблюдение нарушения окраски в или на растениях или частях растений;

d) сравнение наблюдаемого нарушения окраски с нарушением окраски, наблюдаемым в контрольном растении или части растения для идентификации растений или частей растений, обнаруживающих отсутствие нарушения окраски или нарушение окраски, пониженное по сравнению с контрольным растением или частью растения.

Способ по изобретению может быть использован для любого растения, которое может подвергаться нарушению окраски, но он, в частности, является полезным для продуктов, в частности овощей или фруктов, или для цветов. Способ среди прочего является подходящим для листовых овощей, таких как салат, радиккио или эндивий, для клубнеплодов, таких как картофель или батат, для корней, таких как сельдерей, для побегов, таких как витлуф, или для грибов. Способ, кроме того, может быть использован для фруктов, таких как яблоко, банан, авокадо, персик, груша, абрикос, манго, баклажан, и для цветов или цветочных стеблей, таких как стебли гербер, цветы хризантем, нижние части артишока и т.д.

Способ скрининга по изобретению предназначен для идентификации растений, обладающих пониженным нарушением окраски поверхности, вызываемым повреждением, в одной или более своих частей или тканей. Поэтому для скрининга очень полезно использовать часть или ткань, склонную к нарушению окраски. В салате это может быть лист или его часть, такая как вырезанная часть, в банане могут быть соответственно применены кусочки очищенного фрукта, и в цветках части стебля являются очень удобным испытательным образцом.

Однако было обнаружено, что нарушение окраски можно также анализировать на неповрежденных тканях. В Примерах показано, что также неповрежденные оболочки семян и кончики корней способны вызывать цветную реакцию в присутствии добавленного экзогенного субстрата, который может быть превращен в окрашенный пигмент без повреждения. Снижение или отсутствие этой цветной реакции может быть применено в скрининге растений, имеющих пониженное нарушение окраски.

В конкретном частном варианте осуществления способ, в частности, полезен для отбора растений, принадлежащих к семейству Asteraceae, в частности растений рода Lactuca и, более конкретно, к видам Lactuca sativa или растениям, принадлежащим к роду Cichorium и, в частности, к видам Cichorium intybus и Cichorium endivia, которые обнаруживают отсутствие или пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением.

Популяция растения, скринируемая способом по изобретению, может быть любой популяцией растения, но предпочтительно изменчивой популяцией растения, содержащей много различных участников для увеличения возможности обнаружения растения, обнаруживающего пониженное нарушение окраски, вызываемое повреждением. Такая изменчивая популяция может быть создана посредством мутагенной обработки с использованием, например, химических веществ и/или облучения и затем называется в настоящем описании популяцией мутантного растения. Альтернативными популяциями являются коллекции зародышевой плазмы, которые являются коллекциями растений, обнаруживающих естественную вариацию. Также может быть использована популяция трансгенных растений.

Способ по изобретению соответствующим образом выполняют с частями растений, имеющих поврежденную поверхность. Очень полезными испытательными образцами являются диски, вырезанные из листа, так называемые листовые диски. В качестве альтернативы может быть применена ткань центральной жилки жилистых листовых овощей. Соответственно, диски вырезают из жилок. Во фруктах могут быть оценены поверхности среза половин фруктов или в качестве альтернативы ломтики или кубики. Для цветов слои стебля являются очень полезным испытательным образцом.

Инкубацию проводят соответственно в водной среде. Способ по изобретению может быть очень хорошо осуществлен с листовыми дисками, инкубируемыми на или между смоченными фильтровальными бумагами. Тогда на бумаге очень хорошо видна цветная реакция вокруг краев повреждения. В случае растений родов Lactuca и Cichorium нарушение окраски является реакцией порозовения.

В качестве альтернативы, водная среда включает воду или раствор. В конкретном способе осуществления, который будет дополнительно проиллюстрирован ниже, раствор содержит субстрат, такой как L-3,4-дигидроксифенилаланин. Это соединение преобразовано для получения черного пигмента меланина посредством фермента полифенолоксидазы. Альтернативные соединения, которые могут быть применены в этом отношении, включают, но не ограничены ими, хлорогеновую кислоту, изохлорогеновую кислоту, L-тирозин и катехол.

Изобретение может дополнительно быть выполнено с потомством родительского растения, обнаруживающего отсутствие или пониженное нарушение окраски листьев, вызываемое повреждением, чтобы продемонстрировать, что потомство все еще обладает таким же отсутствием или пониженным нарушением окраски листьев, вызываемым повреждением, как найдено в родительском растении.

Изобретение может также быть выполнено на частях растений. Части растений, такие как головки салата или эндивия или листья, обычно являются частями, имеющими поверхность среза, которая может быть подвергнута нарушению окраски. Другими частями являются плоды, побеги, корни, семена, клубни, цветки, стебли и т.д.

В дополнительном варианте осуществления изобретения семена или проросшие семена могут быть применены в качестве испытательного образца, на котором осуществляют способ скрининга в присутствии добавленного экзогенного субстрата. В случае проросших семян молодые кончики корня вовлечены в цветную реакцию.

Изобретение является коммерчески очень интересным для идентификации мутантных растений, которые могут быть применены на рынке обработанного продукта. Как объяснено выше, нарушение окраски продукта, в частности свежих фруктов и овощей, считается нежелательным, поскольку продукт с нарушенной окраской бракуется потребителем.

Подробное описание изобретения

Когда салат собран и обработан срезанием, образуется много листовых поверхностей повреждения, которые приводят к существенной реакции растения или частей растения, проявляющейся в изменении окраски на темную или розовую на или рядом с поверхностью повреждения. Порозовение можно также наблюдать на участках, отдаленных от поверхности повреждения, у центральной жилки листа, так же как на торце. Иногда порозовение можно также наблюдать на стадиях непосредственно перед сбором урожая, которое рассматривают как следствие абиотического стресса или перезрелости урожая.

Другие растения, в частности другие овощи, фрукты и цветы, также могут быть склонными к нарушению окраски. Способ изобретения, таким образом, является также очень удобным отбором для идентификации других растений, в частности других овощей, или фруктов, или цветов, обнаруживающих пониженное нарушение окраски, вызываемое повреждением.

На различные виды нарушения окраски влияет ферментативная активность, которая сильно возрастает вследствие повреждения и которая производит несколько видов полифенолов и продуктов реакции, получаемых из них.

Важной ферментативной активностью, вовлеченной в реакцию потемнения, является PPO. Активность PPO в отношении ферментативного потемнения не ограничена салатом, но была описана для многих других видов растений, подверженных послеуборочному ухудшению как в яблоке, банане и картофеле. Фактически, PPO широко признан как один из самых важных ферментов, вовлеченных в послеуборочное ухудшение многих обрабатываемых свежих фруктов и овощей.

По этой причине PPO был целью многих технологий, которые стремятся снизить или предотвратить его активность, чтобы увеличить послеуборочное качество продовольственных продуктов. PPO катализирует реакцию, в которой полифенолы, находящиеся в ткани растения, окисляются для начала образования o-хинонов. Впоследствии ферментативные и неферментативные реакции приводят к образованию коричневых или черных пигментов.

Во многих видах растений PPO кодируется небольшим семейством генов, индивидуальные участники которого могут иметь различные временные и пространственные паттерны экспрессии, указывающие на функциональное расхождение. Например, показано, что салат содержит различные изоформы PPO в фотосинтезирующей и сосудистой ткани листа.

Естественный субстрат PPO может отличаться между различными видами. Таблица 1 перечисляет субстраты PPO для различных овощей и фруктов, которые подвергнуты нарушению окраски при повреждении. Эти и другие субстраты могут быть использованы в способе скрининга, основанном на экзогенном субстрате, по изобретению.

Таблица 1
Источник	Фенольный субстрат
Яблоко	хлорогеновая кислота (плоть), катехол, катехин (кожица), кофейная кислота, флавонолгликозиды, 3,4-дигидроксифенилаланин (DOPA), 3,4-дигидроксибензойная кислота, п-крезол, 4-метилкатехол, лейкоцианидин, п-кумаровая кислота
Абрикос	изохлорогеновая кислота, кофейная кислота, 4-метилкатехол, хлорогеновая кислота, катехин, эпикатехин, пирогаллол, катехол, флавонолы, производные п-кумаровой кислоты
Авокадо	4-метилкатехол, допамин, пирогаллол, катехол, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, DOPA
Банан	3,4-дигидроксифенилэтиламин (допамин), лейкодельфинидин, лейкоцианидин
Баклажан	хлорогеновая кислота, кофейная кислота, кумаровая кислота, производные коричной кислоты
Салат	тирозин, кофейная кислота, производные хлорогеновой кислоты
Манго	допамин-HCl, 4-метилкатехол, кофейная кислота, катехол, катехин, хлорогеновая кислота, тирозин, DOPA, п-крезол
Гриб	тирозин, катехол, DOPA, допамин, адреналин, норадреналин
Персик	хлорогеновая кислота, пирогаллол, 4-метилкатехол, катехол, кофеиновая кислота, галльская кислота, катехин, допамин
Груша	хлорогеновая кислота, катехол, катехин, кофейная кислота, DOPA, 3,4-дигидроксибензойная кислота, п-крезол
Картошка	хлорогеновая кислота, кофейная кислота, катехол, DOPA, п-крезол, п-гидроксифенил, пропионовая кислота, п-гидроксифенил пировиноградная кислота, м-крезол
Батат	хлорогеновая кислота, кофейная кислота, кофеиламид

Во многих растениях уровень фермента PPO не является специально вызываемым при повреждении тканей растения, но он находится в хлоропласте в неактивном виде. При повреждении PPO активируется, что проявляется вследствие того, что фенольный субстрат, присутствующий в вакуолях, приводится в контакт с PPO из-за разрушения ткани.

В салате образование полифенолов, являющихся субстратом PPO, вызывается при повреждении. Поэтому потенциал потемнения ткани салата, по-видимому, ограничен не количеством PPO в ткани листа, а скорее скоростью биосинтеза полифенола при повреждении.

В этом отношении ситуация может отличаться между сельскохозяйственными культурами. Например, в яблоке количество полифенолов достаточно для вызова реакции потемнения плодов в течение одного часа после повреждения, тогда как в салате реакция потемнения может занять несколько дней вследствие того, что в салате пул полифенолов в значительной степени должен быть синтезирован de novo при повреждении.

Синтез полифенолов происходит через хорошо изученный биохимический путь, названный фенилпропаноидным путем. Первая осуществляемая стадия этого пути катализируется ферментом фенилаланин аммоний-лиазой (PAL, Hahlbrock, K and Scheel, D (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 40, 347-369). PAL превращает аминокислоту фенилаланин, синтезируемую через шикиматный путь, в коричную кислоту.

В салате повреждение листьев приводит к сильной индукции экспрессии гена PAL и активности PAL. Образование полифенолов коррелирует с этой ферментативной активностью, что предполагает, что активность PAL, вызываемая повреждением салата, является важным фактором, ответственным за потемнение (Campos, R. Et al. (2004) Physiologica Plantarum 121, 429-438 и ссылки в ней). Однако в настоящее время неясно, какие другие факторы определяют итоговый результат реакции нарушения окраски, вызываемой повреждением. Например, было предложено, что активность пероксидаз (POD) также является важной в установлении итогового уровня нарушения окраски при повреждении (Fukumoto, L. R. Et al. (2002) J. Agric. Food Chem. 540, 4503-4511; Martin-Diana A. et al (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1677-1685).

Поскольку активность фермента зависит от доступности внутреннего пероксида водорода, вклад POD в нарушение окраски может быть ограничен.

Дополнительно очевидно, что повреждение, так или иначе, воспринимается растением, и впоследствии сигнал вызывается через каскад, который в настоящее время плохо изучен для салата. Кажется очевидным, что эти активности будут, прежде всего, нацелены на заживление раны и защиту против болезнетворных микроорганизмов. Поэтому вероятно, что многие генетические факторы вовлечены в образование реакции нарушения окраски поврежденной ткани салата и каждый из них является потенциальной целью для генетической модификации, чтобы снизить или устранить нарушение окраски, вызываемое повреждением.

Большинство из этих генетических факторов в настоящее время неизвестно, и для тех, о которых известно, что вовлечены, неясно до какой степени эти факторы играют специфическую роль в реакции нарушения окраски или возможно имеют более общую функцию в отношении физиологии повреждения растения.

Например, хотя вызываемая повреждением активность PAL рассматривается как определяющая уровень потемнения салата, продукты фенилпропаноидного пути, как известно, вовлечены, среди прочего, в биосинтез клеточной стенки или также защитную реакцию. Поэтому снижение вызываемой повреждением активности PAL для снижения потенциала потемнения может поставить под угрозу другие функции помимо вызываемого повреждением потемнения, которые могут быть менее желательными в отношении других аспектов культивирования салата.

Аналогично, подразумевалось, что активность PPO вовлечена в защитную реакцию, и поэтому снижение потенциала потемнения путем снижения уровня PPO может увеличить восприимчивость к болезнетворным микроорганизмам (Thipyapong, P. et al (2004) Planta 220, 105-117). Поэтому авторами было обосновано, что более беспристрастный подход может быть более успешным в этом отношении. Такой подход включает следующие стадии.

1. Создание изменчивой популяции растений, в частности мутантной популяции. Такая популяция мутанта может быть создана путем обработки семян или тканей растений мутагенными агентами, такими как сульфонат этилметана (ems) или рентгеновским излучением.

2. Проведение эффективного фенотипического скрининга, в котором отбор основан на нарушении окраски растения, в частности нарушения окраски растения, вызываемого реакцией на повреждение, которая опосредована через PAL и/или PPO.

3. Описание мутантов, с модифицированной реакцией на повреждение в отношении потенциала послеуборочного нарушения окраски и отсутствия плейотропных эффектов модификации, которые ставят под угрозу рост и обработку растения согласно традиционной практике.

Изобретение, таким образом, относится к способу скрининга для идентификации, отбора и получения растения, обнаруживающего пониженное нарушение окраски, вызываемое повреждением и послеуборочными нарушениями в результате обработки, такое как ферментативное потемнение или порозовение. В способе скрининга можно наблюдать нарушение окраски на поврежденной поверхности, но также было обнаружено, что неповрежденные ткани также обнаруживают цветную реакцию при добавлении субстрата.

Популяция мутантного растения для применения в способе по изобретению может, например, быть получена следующим образом:

a) обработка M0 семян модифицируемого вида растения мутагенным средством для получения М1 семян;

b) выращивание растений из полученных, таким образом, М1 семян для получения М1 растений;

c) в случае необходимости повторение стадий b) и c) n раз для получения Ml+n семян;

d) проращивание полученных, таким образом, Ml+n семян, выращивая растения от тех семян.

Согласно изобретению эти растения впоследствии оценивают на их реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением. Отбирают растения, которые не обнаруживают или обнаруживают пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением. Затем потомство отобранных растений выращивают и оценивают реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением.

Для создания генетической изменчивости может быть полезным мутагенез. Специалисту в области техники известны несколько химических веществ или физических обработок, которые могут быть применены, чтобы индуцировать генетические мутации в видах растений. Например, можно обработать семена салата в растворе, содержащем различные концентрации мутагена, такого как ems. Ems алкилирует прежде всего G-остатки нити ДНК, которые во время репликации ДНК приводят к спариванию с T вместо C. Поэтому пары оснований GC переходят в пары оснований AT с частотой, которая определяется эффективной дозой ems и активностью системы репарации ошибочно спаренных оснований растения.

Эффективная доза ems зависит от используемой концентрации, размера семени и других физических свойств и времени инкубации семян в растворе ems. Семена, обработанные мутагенным агентом, типично называют М1 семенами. Вследствие обработки ткани М1 семян содержат случайные точечные мутации в геномах своих клеток и тех, которые находятся в подпопуляции клеток, которые образуют зародышевую ткань (зародышевые клетки), которые будут переданы следующему поколению, которое называют M2. Мутации или их комбинации, которые являются гаплонедостаточными, приводя к бесплодию, или те, которые вызывают смертность эмбрионов, не будут переданы поколению M2.

Подобную процедуру, как описано выше для применения ems, используют также для других мутагенных агентов. Подходящие мутагенные агенты хорошо известны в области техники. Особенно полезными являются алкилирующие мутагенные агенты, такие как диэтиловый сульфат (des), этиленимин (ei), пропансультон, N-метил-N-нитрозоуретан (mnu), N-нитрозо-N-метилмочевина (NMU), N-этил-N-нитрозомочевина (enu), азид натрия.

В качестве альтернативы, мутации вводят посредством облучения, которое, например, отбирают из рентгеновского излучения, быстрых нейтронов, УФ излучения.

В другом варианте осуществления изобретения мутации вводят посредством генной инженерии, например посредством использования химерных олигонуклеотидов, гомологичных рекомбинаций, направленного воздействия на гены, введения модифицированных генов-мишеней, которые конкурируют с эндогенным продуктом, инактивации посредством РНК-интерференции и т.д.

M2 популяция мутагенной обработки может быть использована в процедурах скрининга, нацеленных на реакцию на повреждение, которая опосредована через PAL и PPO. Специалисту в области техники будет очевидно, что любая популяция растений, которая несет генетическую изменчивость, может быть взята в качестве исходного материала для такого фенотипического скрининга, такие как коллекции зародышевой плазмы, которые являются коллекциями растений, обнаруживающих естественную изменчивость, или популяциями трансгенных растений.

Получение М1 и M1+n семян подходящим образом проводят посредством самоопыления.

Для выполнения фенотипического отбора по изобретению должна образовываться поврежденная поверхность по мере протекания ферментативной реакции нарушения окраски, вызываемой при повреждении. Такое повреждение может быть получено путем срезания, вырезания, разрезания, истирания, сплющивания, перелома, очищения, раздавливания, прессования, размазывания, измельчения, введения жидкости, осмотического шока, отделения, кошения, дробления, стирания и разрывания.

После повреждения или когда повреждение не требуется, фенотипический признак должен стать проявлением, которое является диагностическим для пути, приводящего к нарушению окраски ткани и которое может быть очень эффективно применено при скрининге мутантной популяции.

Неожиданно было обнаружено, что такие фенотипические признаки могут быть получены путем взятия частей растений и инкубации их при очень специфических условиях, которые способствуют появлению различных видов нарушения окраски поврежденной поверхности. Впоследствии такие испытания могут быть использованы для больших количеств мутантных растений для того, чтобы отобрать те растения, которые обнаруживают пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением.

Один вариант осуществления этого изобретения основан на удивительном открытии, что, когда диски из листьев, таких как листья салата, взяты и инкубированы между смоченными фильтровальными бумагами при 5°C, приблизительно через 4 дня становится видимым образование розового окрашивающего вещества по краям листовых дисков. Подходящая фильтровальная бумага является фильтровальной бумагой типа 1450 CV, Ref.no. 10 313 281 от Schleier & Schuell, Microscience GmbH, Dassel, Германия. При дальнейшей инкубации сигнал усиливается, и приблизительно через одну неделю была достигнута максимальная интенсивность. Образование розового окрашивающего вещества проявляется особенно на поврежденных поверхностях.

Нарушение окраски может быть измерено путем оценки по визуальной шкале от 0, что означает отсутствие потемнения или порозовения, до 10, что означает потемнение и порозовение как у стандартного сорта скринируемого растения (например, L. Sativa для скрининга салата). В примерах в отношении салата L. Sativa сорт “Troubadour” использован в качестве стандарта для 10.

По желанию могут быть использованы фотографии для сравнения, чтобы ценить промежуточные классы между 0 и 10. В дополнение, могут быть сделаны цифровые фотографии фильтровальной бумаги с розовым или коричневым окрашивающим веществом, с последующим подсчетом количества пикселей с интенсивным розовым или коричневым цветом на одно положение листового диска. С использованием одного из этих измерений может быть выполнены простые статистические анализы, такие как t-критерий, известный специалисту в области техники, для определения, является ли растение или группа растений значительно менее розовеющими или темнеющими, чем стандарт. Используемый уровень значимости одностороннего критерия равен 0.001.

Для мутантов статистическое сравнение может быть проведено между оценками порозовения исходного сорта, который является самым лучшим доступным стандартом, и оценками порозовения индивидуальных мутантов и/или их потомства.

Для обнаружения признака по изобретению в существующих растениях могут быть применены репрезентативные образцы сортов, линий разведения и/или зарегистрированных образцов банка генов. Статистическое сравнение может затем быть проведено между оценками порозовения индивидуального исследуемого зарегистрированного образца и остальной частью популяции. При статистическом анализе особей на значительно меньшее порозовение могут быть необходимы критерии множественного сравнения для сохранения корректного общего уровня значимости, например критерий множественного сравнения Даннета с одним стандартом (Dunnett CW, J. Amer. Statict. Assoc. 50: 1096-1121 (1955)).

Дополнительно было показано, что эта реакция может быть получена с использованием многих различных видов листовой ткани различных стадий развития. Например, в ткани центральной жилки также можно вызвать эту реакцию в результате повреждения. При использовании для различных видов салата, таких как кочанный, айсберг, кос, батавия или дуболистный, не были обнаружены индивидуальные зарегистрированные образцы, которые бы показали значительно меньшее порозовение, чем остальная часть исследованной популяции. Поэтому пришли к заключению, что в пределах культурных видов салата нет никакой или только очень ограниченная генетическая изменчивость по нарушению окраски в виде порозовения, вызываемому повреждением.

Было дополнительно продемонстрировано согласно изобретению, что специфический ингибитор PPO, L-цистеин, при применении во время реакции, сильно подавлял образование розового окрашивающего вещества. В дополнение, было обнаружено, что образование розового окрашивающего вещества было ингибировано коричным альдегидом, который является ингибитором активности PAL и потемнения свежесрезанного салата (Fujita, N. Et al. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70, 672-676). Эти результаты показывают, что реакция нарушения окраски салата в виде порозовения является PAL и PPO зависимой.

Известно, что ферментативное потемнение свежесрезанного салата очень эффективно предотвращается применением краткосрочного теплового шока. Наблюдаемый эффект может быть объяснен предположением перенаправления биосинтеза белка с фенилпропаноидного пути на белки теплового шока, снижающего, таким образом, метаболический поток в сторону образования полифенолов.

В качестве альтернативы, эффект может быть объяснен предположением того, что ферменты, вовлеченные в окисление полифенолов, такие как PPO и POD, инактивируются посредством теплового шока. При применении теплового шока к салату, который впоследствии оценивали на реакцию порозовения, было показано, что эта реакция, такая как ферментативное потемнение, была эффективно ингибирована. Это демонстрирует, что реакция порозовения салата, являющаяся частью этого изобретения, физиологически очень схожа с известной ферментативной реакцией потемнения.

Это открытие было дополнительно доказано применением L-цистеина в качестве восстановителя. Помимо того что L-цистеин является ингибитором PPO, также известно, что он реагирует с окрашенными o-хинонами и превращает их обратно в бесцветные дифенолы в химической реакции восстановления. Когда розовое окрашивающее вещество, образованное листовыми дисками салата, обрабатывали L-цистеином, было продемонстрировано, что розовое соединение было превращено в бесцветное соединение. Поэтому кажется вероятным, что розовое окрашивающее вещество является o-хиноном, образованным посредством PPO.

Это было подтверждено открытием того, что восстановители, такие как аскорбиновая кислота или глютатион, также превращают розовое окрашивающее вещество в бесцветное соединение.

В дополнение, обработка L-цистеином растений, взятых в поле, обнаруживающих порозовение, также устраняет нарушение окраски в виде порозовения. Это демонстрирует, что реакция порозовения листового диска представляет происходящее в природе явление порозовения, которое иногда можно видеть на растениях, растущих в полевых условиях.

Дополнительный вариант осуществления этого изобретения основан на следующем эксперименте. Части листа головки салата получают путем отрезания и инкубируют при 16°C в воздушной атмосфере. В качестве реакции поврежденная поверхность становится темной через приблизительно 4 дня. Потемнение можно отчетливо наблюдать в особенности на поврежденной поверхности центральной жилки. Более того, реакцию потемнения можно также наблюдать на уровне всего растения в результате повреждения листьев посредством срезания или истирания.

Все эти реакции потемнения могут быть полностью ингибированы L-цистеином, ингибитором PPO, который демонстрирует, что эти фенотипы проявляются через активность PPO и поэтому могут считаться диагностическими для послеуборочного потемнения, наблюдаемого во время обработки и упаковки салата.

Эти реакции потемнения, вызываемые повреждением, могут быть вызваны эффективным образом, что может быть применено в способе фенотипического скрининга для идентификации мутантного растения с пониженным потенциалом потемнения, вызываемого повреждением.

Дополнительный вариант осущест