Peg-илированный мутированный токсин clostridium botulinum

Peg-илированный мутированный токсин clostridium botulinum

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к модифицированным ботулиническим токсинам (BoNT), которые обладают повышенной стабильностью и, таким образом, продленной продолжительностью терапевтического действия по сравнению с соответствующими природными ботулиническими токсинами. Кроме того, данное изобретение относится к лекарственным препаратам, содержащим эти модифицированные ботулинические токсины. Наконец, данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют эти модифицированные ботулинические токсины.

Предпосылки изобретения

Clostridium botulinum является анаэробно развивающейся спорообразующей бактерией, которая вырабатывает высокотоксичный белок. Этот так называемый ботулинический токсин является причиной ботулизма, пищевого отравления, которое без применения интенсивных мер лечения может привести к смерти пациента. Различаются семь серотипов (тип A-G, BoNT/A кратковременного действия, BoNT/B и т.д.), которые имеют аналогичные последовательности аминокислот, но вызывают различные реакции антител. Токсины (упоминаемые здесь также как нейротоксины или ботулинические токсины) состоят из двух функциональных цепочек - легкой (~50 кДа) и тяжелой (~100 кДа), которые создаются путем протеолитического расщепления одноцепочного белка-предшественника. Другие штаммы не обладают соответствующей протеазой, следовательно, расщепление цепочек имеют место в желудочно-кишечном тракте пациента (например, с помощью трипсина). В двухцепочной форме подгруппы (то есть тяжелая и легкая цепочки) взаимно соединяются дисульфидными мостиками (например, здесь добавочно существует внутримолекулярный дисульфидный мостик в BoNT/A, то есть между двумя цистеиновыми группами тяжелой цепочки).

В кислотных условиях in vivo чистые нейротоксины не существуют в свободном виде, но образуют комплексы с другими клостридиальными белками, так называемые токсиновые комплексы (Clostridium botulinum). В эти комплексы включаются различные белки, в частности, обладающие гемаглютинирующими свойствами. Состав комплекса отличается от серотипа к серотипу. Объединение в комплекс защищает нейротоксин в желудочно-кишечном проходе. Эти другие клостридиальные белки (комплексирующие и комплексные белки соответственно), возможно, также играют определенную роль при поглощении нейротоксина. Таким образом, объединение в комплекс делает нейротоксин орально биологически доступным и тем самым провоцирует пищевое отравление. Конечным местоположением токсинов является концевая пластинка двигательного нерва на мышце, там, где последняя возбуждается нервом. Для возбуждения мышцы мотонейрон выделяет ацетилхолин. Это выделение ингибируется ботулиническим токсином. Эффект ингибирования составляют 3 последовательных этапа: связывание, транслокация, протеолиз. Тяжелая цепочка ботулинического токсина с высокой специфичностью связывается с мотонейроном и впоследствии поглощается в нервной клетке с помощью эндоцитоза. Перед (upstream of) доменом связывания, который располагается на С-окончании тяжелой цепочки, в N-концевой части тяжелой цепочки имеется домен транслокации, который переносит или, скорее, облегчает транслокацию легкой цепочки в цитозоль с помощью пока еще неизвестного механизма. В цитозоле легкая цепочка становится активной, как протеаза, расщепляя высокоспецифичные так называемые SNARE-белки. Протеолитичная специфичность отдельных типов ботулинического токсина показана в таблице 1. Эти SNARE-белки являются ответственными за слияние секреторных пузырьков, нагруженных ацетилхолином, протеолитическое расщепление одного из этих SNARE-белков ингибирует образование сливающегося комплекса и, таким образом, дополнительно высвобождает ацетилхолин. Пораженная мышца далее не возбуждается. Парализуются ранее гиперактивные мышцы.

Таблица 1
Тип ботулинического токсина	SNARE-белок. Субстрат активности протеазы	Участок расщепления в SNARE-последовательности для крысы
Тип А	SNAP 25	EANQ197 RATK
Тип В	VAMP 2	GASO76 FETS
Тип С	Синтаксин SNAP 25	DTKK254 AVKY ANQR198 ATK
Тип D	VAMP 2	RDQK61 LSED
Тип Е	SNAP 25	QIDR180 IMEK
Тип F	VAMP 2	ERDQ60 KLSE
Тип G	VAMP 2	ETSA83 AKLK

Этот механизм действия имеет преимущество при лечении множества нарушений работы и спазм мышц, для которых характерно неконтролируемое высвобождение ацетилхолина (например, тонический блефароспазм, кривошея, мышечная спастичность). Для лечения дистонии в гиперактивную мышцу инъецируется крайне низкое количество нейротоксина (в диапазоне от pg до ng). Нейротоксин диффундирует в концевую пластинку двигательного нерва на мышце и достигает цитозоля нейрона, ингибируя выделение ацетилхолина в этом месте. Мышца парализуется через 1-2 дня.

Как следствие судорог мышц, то есть также за счет неконтролируемого выделения ацетилхолина формируются разнообразные лицевые складки. В связи с этим ботулинические токсины находят косметическое применение: морщины могут быть удалены с помощью инъекции очень малых количеств ботулинического токсина.

В настоящее время санкционированы для применения в качестве лекарств четыре препарата, содержащие ботулинические токсины: Botox^® ("Allergan"), Xeomin^® ("Merz"), Dysport^® ("Ipsen") и NeuroBloc^® ("Solstice Neurosciences"). Botox^®, Xeomin^® и Dysport^® представляют из себя лиофилизированный ботулинический токсин типа А (как комплекс, нейротоксин и комплекс соответственно), причем Botox^® и Xeomin^® в ампулах со 100 единицами на инъекцию каждый, a Dysport^® с 500 единицами. NeuroBloc^® содержит ботулинический токсин типа В (как комплекс) с 5000 и 10000 единиц соответственно в жидком виде.

За исключением NeuroBloc препараты пригодны в качестве лиофилизатов, которые реструктурируются с помощью физиологического раствора и инъецируются в соответствующие мышцы в определенных дозах в зависимости от приготовления и показаний. Обработанная мышца должна быть парализована в течение 48 часов. Эффект сохраняется в течение 3 месяцев, после чего должна быть сделана добавочная инъекция, если мышца должна оставаться парализованной дальше, то есть дистония должна быть излечена. До сих пор недвусмысленно не объяснено, какие процессы контролируют понижение эффекта. Пока легкая цепочка активна как протеаза, соответствующий SNAPE-белок расщепляется (например, SNAP 25 с помощью легкой цепочки нейротоксина типа А). Соответственно слияние секреторных пузырьков с клеточной оболочкой и выделение вследствие этого ацетилхолина будет при этих условиях подавляться, причем мышца остается парализованной. Если бы было возможно сохранять в клетке активность протеазы легкой цепочки в течение длительного времени, то продолжительность действия соответствующего лекарства также увеличилась бы.

В отличие от многих низкомолекулярных активных веществ активные белковые вещества характеризуются значительно более низкой стабильностью. Период полувыведения некоторых активных белковых веществ, циркулирующих в крови, составляет только несколько минут, так что (терапевтическая) продолжительность их действия сильно ограничена, и инъекции должны повторяться через короткие интервалы времени. Период полувыведения может быть увеличен, если принять успешные меры защиты белка от процессов деградации и элиминации. Один теоретически возможный способ существует, главным образом, для эукариотных белков и заключается он в более высоком гликолизировании (более высоких долях углевода) и в приспособлении углеводных структур к структурам человеческих гликопротеинов. Другим путем, проверенным для ряда апробированных активных веществ, является соединение белка с полиэтиленгликолем (PEG). PEG может быть ковалентно связан с остатками различных аминокислот, например, с лизином (аминофункция) или цистеином (SH-функция). PEG увеличивает молекулярную массу белка без создания иммуногенных структур, которые стимулируют генерацию антител в активном веществе. Наоборот: PEG-илирование уменьшает иммуногенность активного вещества. Белок элиминирует медленнее благодаря увеличению молекулярной массы, и достигается значительное увеличение периода полувыведения. Для поддержания определенного необходимого уровня сыворотки лекарство должно вводиться менее часто.

PEG-илированные активные белковые вещества уже применялись в некоторых апробированных лекарствах (см.таблицу 2). Применение некоторых белков (например, интерферона α 2a: Mr=19,3 кДа) в первоначальной форме, то есть без модифицирования), показало, что белки очень быстро элиминируют из сыворотки. PEG-илирование обеспечило возрастание молекулярной массы и тем самым значительно продлило период полувыведения из сыворотки. Таким образом, например, полувыведение из сыворотки для интерферона α 2a составило 9 часов; PEG-илирование с помощью цепочки PEG 40 кДа существенно увеличивает молекулярную массу и расширяет период полувыведения от 9 до 72 часов.

Таблица 2
Торговое наименование	Исходное соединение	Связывание с PEG
Pegasys	интерферон α 2a	Разветвленный PEG-N-гидроксисукцинимид; связь с 4 остатками лизина
Neulasma	G-CSF	PEG-альдегид; связь с N-концевым ментионином
Peglutron	Интерферон α 2b	Сукцинимидилкарбонат-PEG; связь с остатками гистидина и лизина
Somavest	антагонист гормона роста	4-6 PEG; связь с остатками лизина и N-концом
Oncaspar	Аспарагиназа	PEG, активированный N-гидроксисукцинимидом

Однако связь с помощью одной или нескольких цепочек PEG подвержена ограничениям:

1. Предпочтительно, цепочка PEG понижает биологическую активность модифицированного белка (по сравнению с немодифицированным природным белком), но отнюдь не в малой степени (в соответствии с данным изобретением понятно, что слегка пониженная биологическая активность модифицированного белка соответствует, по крайней мере, 20%, предпочтительно 30-40% или 50-70% или даже 75-95% биологической активности немодифицированного природного белка). Пониженная активность приемлема во многих случаях: например, антивирусная активность PEG-илированного интерферона составляет 25-30% не подвергавшегося PEG-илированию интерферона α 2b. PEG-илированный интерферон α 2а даже обладает только 1-7% активностью не подвергавшейся PEG-илированию формы.

2. Когда большое количество используемых в терапии белков проявляют свою активность через посредство связи со специфическим рецептором, PED-илирование предпочтительно не влияет или влияет только в незначительной степени на взаимодействие с рецептором (например, взаимодействие может подвергаться влиянию непосредственно путем стерического затруднения на домене связывания или путем изменения пространственного строения белка, что оказывает воздействие на домен связывания, а следовательно, и на связывание).

3. Когда фармакологическое действие терапевтического белка (также) опосредствуется ферментативной активностью (например, с помощью аспарагиназы), ферментативная активность в результате PEG-илирования предпочтительно не понижается или понижается только слегка.

Предпочтительно PEG-илирование ботулинического токсина отвечает этим трем критериям. В то же время модификация ботулинического токсина с помощью PEG не оказывает влияния (а) ни на домен связывания тяжелой цепочки, (b) ни на ферментативную активность легкой цепочки, то есть PEG-цепочка предпочтительно не ингибирует взаимодействие каталитического домена легкой цепочки с субстратом (SNARE-белок). В отличие от других протеаз, которые расщепляют короткоцепочные пептиды, ботулинические токсины требуют пептидов с более длинными цепочками в качестве субстратов. Например, пептид, который служит в качестве субстрата для ботулинического токсина типа В предпочтительно имеет последовательность из 40 остатков аминокислот SNARE-белка VAMP 2. Пептиды с более короткими SNARE-последовательностями также будут расщепляться, но со значительно меньшей эффективностью. Домен расщепления легкой цепочки ботулинического токсина, который имеет длину, сравнимую с последовательностью распознавания около 40 остатков аминокислот, обычно не подвергается влиянию со стороны PEG-цепочки. Кроме того, предполагалось, что помимо домена расщепления, ответственного за прямой контакт субстрата (SNARE-белка и пептида с SNARE-последовательностью около 40 остатков аминокислот) с легкой цепочкой, для оптимальной активности ботулинического токсина необходимы дополнительные контактные участки с последовательностями легкой цепочки, расположенные на расстоянии от каталитического домена. Было продемонстрировано, что пять дополнительных контактных участков для их субстрата SNAP 25 локализуются на легкой цепочке ботулинического токсина типа А: 4 экзоучастка α (AS 102-113, 310-321, 335-348, 351-358) и один экзоучасток β (AS 242-259). Предпочтительно, чтобы контакт с PEG с помощью конъюгации легкой цепочки отсутствовал или был только незначительным препятствием. Кроме того, часть С-конца тяжелой цепочки, домен транслокации, должна быть операбельной, то есть она должна гарантировать, что легкая цепочка переносится из эндосомы в цитозоль. Этот процесс переноса, который абсолютно необходим для действия системы, может также быть ингибирован с помощью стерического затруднения PEG-илированной легкой цепочки, особенно когда домен транслокации, возможно, образует пору в оболочке эндосомы, через которую "громоздкая" PEG-илированная легкая цепочка не может быть пропущена.

Связывание PEG с ботулиническим токсином описывается в патентной заявке США 2002/0197278. Связывание служит для уменьшения антигенности и иммуногенности, а также для увеличения молекулярной массы, что приводит к уменьшению диффузии. Для выбора соответствующих участков (антигенных детерминант) и остатков аминокислот для PEG-илирования следует обратиться к статье Bavari и др. (Vaccine 16; 1850-1856, 1998). В этой статье представлены последовательности тяжелой цепочки ботулинического токсина, которые вызывают нейтрализацию антител. В вышеуказанной патентной заявке утверждается только, что (1) PEG-илирование должно быть выполнено вблизи одного участка или вблизи к участкам, которые функционируют как важные антигенные детерминанты (эпитопы), но которые удалены от каталитического домена (то есть удалены от легкой цепочки), и что (2) PEG может быть присоединен к свободным карбокси или аминогруппам оконечности или к аминогруппам боковых цепочек лизина. (3) В качестве дополнительной альтернативы введения PEG в токсин предлагается использовать SH-группы природного происхождения или специально вводимые остатки цистеина; однако, статья выступает против этой альтернативы (3), когда дисульфидные мостики между тяжелой и легкой цепочками ботулинического токсина играют какую-либо роль в пространственной конфигурации молекулы. Отсутствуют примеры, описывающие структуру PEG-илированного нейротоксина или указывающие, к каким остаткам аминокислот прикреплялись молекулы PEG определенной длины.

В дополнительной патентной заявке (WO02/40506), относящейся к изменению стабильности, введение, модификация или удаление участков для гликозилирования in vivo, фосфорилирования in vivo и, главным образом, миристоилирования in vivo в ботулиническом токсине предлагается для того, чтобы увеличить либо уменьшить стабильность ботулинического токсина. Все ряды участков потенциальной модификации располагаются на значительном расстоянии от N- и С-концов легкой цепочки нейротоксина. В полипептидную цепочку могут быть введены дополнительные последовательности, причем карбогидратные цепочки или фосфатные и миристоильные фрагменты соединяются с легкой цепочкой с помощью клеточных энзимов. Однако отсутствует информация, касающаяся соответственно модифицированных нейротоксинов или их приготовления.

В дополнительной патентной заявке США 2003/0027752 в нейротоксин или в легкую цепочку для повышения стабильности легкой цепочки в пределах нейроцита вводится пептидная группа с так называемым "лейциновым мотивом" (например, XEXXXLL). Конфигурация легкой цепочки с таким мотивом гарантирует, что она локализуется по соседству с ее субстратом на оболочке. Кроме того, так называемый "мотив на основе тирозина" (YXXHy, где Y - тирозин, Ну - гидрофобная аминокислота) после введения в легкую цепочку должен повысить ее стойкость. Наконец, в этой патентной заявке предлагается модифицированный ботулинический токсин типа А, в котором легкая цепочка мутирует (от аланина до лейцина в позициях 427 и 428).

Принимая во внимание вышеизложенные предшествующие знания, изобретатели поставили цель обеспечить дополнительный вид стабилизации любого типа ботулинического токсина, предпочтительный, однако, для типов А, В и Cl. В соответствии с этой целью необходимо было обеспечить стабильные варианты/аналоги природных ботулинических токсинов, которые по сравнению с соответствующими немодифицированными ботулиническими токсинами имели бы повышенную стабильность in vivo. Это означает, во-первых, что биологическая активность (в соответствии с данным изобретением биологическая активность определяется как полная активность, включающая энзиматическую/каталитическую активность легкой цепочки, а также необходимое связывание нейротоксина с клеткой мишенью и транслокацию легкой цепочки в клетку-мишень) варианта/аналога ботулинического токсина должна предельно минимально (в соответствии с приведенным описанием), а предпочтительно вовсе не повышаться, а, во-вторых, несмотря на ее модификацию, легкая цепочка должна смещаться на место ее действия - в цитозоль мотонейрона.

В отличие от уже упомянутой заявки США 20020197278 в основе настоящей заявки не лежит блокирование антигенных детерминант с целью понижения антигенности токсинов или ограничение их диффузии прочь от места введения.

Авторы настоящей заявки неожиданно установили, что легкие цепочки ботулинических токсинов могут быть специфически PEG-илированы на их N-концах путем введения, по меньшей мере, одного цистеинового остатка без одновременного уменьшения или даже ингибирования биологической активности (в соответствии с описанием, приведенным выше) ботулинических токсинов. Такой PEG-илированный ботулинический токсин отличается неожиданно более высокой стабильностью in vivo (значительным увеличением периода полувыведения и вместе с тем возрастанием (фармакологической) продолжительности действия).

(Терапевтическая) продолжительность действия природных ботулинических токсинов на пациента зависит от серотипа. Ботулинический токсин типа А отличается наибольшей продолжительностью действия - около 3 месяцев. Продолжительность действия ботулинического токсина типа С подобна продолжительности типа А, тогда как ботулинический токсин типа В имеет более короткую продолжительность действия. Действие ботулинических токсинов типа Е и F продолжается около 2 недель в каждом случае. Малая продолжительность действия этих двух типов препятствует их клиническому применению для лечения дистонии. Данное изобретение позволяет (1) клиническое применение всех ботулинических токсинов, даже токсинов, имеющих до настоящего времени кратковременную активность, и (2) более успешную терапию с помощью уже применяемых типов токсинов А и В, когда нет необходимости вводить их каждые три месяца, но следует вводить их, например, только каждые шесть месяцев.

Описание чертежа и последовательностей

Фиг.1: Список олигонуклеотидов (SEQ ID №№1-14), которые применялись при клонировании рекомбинантных токсинов и фрагментов токсинов. Подчеркнуты последовательности распознавания для рестрикции эндонуклеаз. Длинные последовательности с SEQ ID №№16 и 15 показывают примеры рекомбинантного (мутированного) ботулинического нейротоксина типа А с прикрепленным к гистидиновому кончику (состоящему из 10 остатков гистидина) N-оконечности цистеиновым остатком или ДНК, которая кодирует его. Остаток пролина на N-оконечности природных токсинов (позиция 1), который моноцистронно (monocystronically) экспрессируется и транслируется, заменялся остатком аналина, чтобы создать участок расщепления в участке мультиклонирования (MCS) вектора. Вектор содержит кодирующую последовательность для His-кончика именно вблизи 5' этого MCS. Вдобавок последовательность, которая распознается клетками E.coli, уже введена вместо природной петли между легкой и тяжелой цепочкой, вследствие чего природный предпептид (N - легкая цепочка - петля - тяжелая цепочка - С) уже расщепляется в активном двухцепочном нейротоксине без добавления экзогенных протеаз и получается сам по себе во время рекомбинантного производства нейротоксина.

Фиг.2: Анализ PEG-илирования и контрольные партии C-H₁₀BoNT/A (пример 5) в SDS полиакриламидных гелях при несмягченных условиях. Дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: контрольная партия; дорожка 3: партия PEG-илирования.

Описание изобретения

Для разрешения поставленной задачи (см. выше) изобретатели разработали модифицированные ботулинические токсины. Следовательно, один из аспектов данного изобретения относится к модифицированному ботулиническому токсину, содержащему природную тяжелую цепочку и модифицированную легкую цепочку, причем модификация легкой цепочки состоит в (1) удлинении цепочки на ее N-конце, которое имеет следующую структуру в направлении от N- к С-концу: -(C)_n-(tag)_m-(X)₁-, где

С - остаток цистеина,

tag - любой кончик, например, Strep-кончик или His-кончик,

Х - остаток любой встречающейся в природе аминокислоты,

n - целое число от 1 до 50,

m - 0 или 1 и

I - 0 или целое число от 1 до 50,

и (2) по крайней мере, один цистеиновый остаток в удлинении цепочки связан, по крайней мере, с одной цепочкой PEG. Такой модифицированный ботулинический токсин также упоминался выше, как PEG-илированный мутированный ботулинический токсин или нейротоксин.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления принимаются следующие условия:

n=1, 2 или 3, m=0 или 1, I=0 или I≠0,

n=1, m=1, I=0; n=2, m=1, I=0; n=3, m=1, I=0;

n=1, m=0, I=0; n=2, m=0, I=0; n=3, m=0, I=0;

n=1, m=1, I≠0; n=2, m=1, I≠0; n=3, m=1, I≠0;

n=1, m=0, I≠0; n=2, m=0, I≠0; n=3, m=0 I≠0;

где молекула токсина соединяется с одной, двумя или тремя молекулами PEG в зависимости от того, равняется ли n 1, 2 или 3.

Таким образом, предпочтительно эти модифицированные ботулинические токсины (особенно типы А, В и С1) попадают в пределы группы вышеуказанных модифицированных ботулинических токсинов, предлагаемых в данном изобретении. Их легкие цепочки модифицируются таким образом, что содержат удлинение цепочки, в котором удлиненная цепочка имеет одну из нижеперечисленных последовательностей:

-(C)₁-(tag)₁-(X)₀-, -(C)₂-(tag)₁-(X)₀-, -(C)₃-(tag)₁-(X)₀-, -(C)₄(tag)₁-(X)₀-, -(C)₅-(tag)₁(X)₀-,

-(C)₁-(tag)₁-(X)₁-, -(C)₂-(tag)₁-(X)₁-, -(C)₃-(tag)₁-(X)₁-, -(C)₄(tag)₁-(X)₁-, -(C)₅-(tag)₁(X)₁-,

-(C)₁-(tag)₁-(X)₂-, -(C)₂-(tag)₁-(X)₂-, -(C)₃-(tag)₁-(X)₂-, -(C)₄(tag)₁-(X)₂-, -(C)₅-(tag)₁(X)₂-,

-(C)₁-(tag)₁-(X)₃-, -(C)₂-(tag)₁-(X)₃-, -(С)₃-(tag)₁-(Х)₃-, -(C)₄(tag)₁-(X)₃-, -(C)₅-(tag)₁(X)₃-,

-(C)₁-(tag)₁-(X)₄-, -(C)₂-(tag)₁-(X)₄-, -(C)₃-(tag)₁-(X)₄-, -(C)₄(tag)₁-(X)₄-, -(C)₅-(tag)₁(X)₄-, и т.д.

где в любом из перечисленных 25 предпочтительных вариантов осуществления m может также быть 0 вместо 1, и/или в каждом случае все цистеиновые остатки, встречающиеся в удлинении легкой цепочки, также являются PEG-илированными.

Конечно, I может также быть любым целым числом от 11 до 50 или больше 50, наиболее предпочтительно больше 100 или больше 250. Однако чем больше I, тем длиннее становится легкая цепочка без энзиматической/каталитической активности или (полной) биологической активности, согласуясь (being compromised) с вышеприведенным определением только с помощью специфического верхнего предела длины легкой цепочки. Однако по соображениям целесообразности верхний предел для I должен составлять 10-20, так что предпочтительные значения для I находятся в диапазоне 1-10, если только I не равно 0, что особенно предпочтительно.

Соответствующие рассуждения также применимы к n, для которого по данному изобретению верхний предел составляет 50 по практическим и экономическим соображениям. Предпочтительно n должно находиться в диапазоне 1-10, более предпочтительно 1-5, для того чтобы не вводить слишком много молекул PEG (когда все вводимые цистеиновые остатки предпочтительно являются PED-илированными) и не лишать результирующий PEG-илированный мутированный ботулин/нейротоксин его биологической активности в соответствии с вышеприведенным описанием. Это легко может произойти, если вводится слишком много цистеиновых и PEG-групп или они вводятся на неправильные позиции, когда легкая цепочка, несмотря на связывание токсина с клеткой-мишенью, не подвергается перемещению в клетку-мишень.

Структура ботулинического токсина типа А описана Lacy и Stevens 1998 (Nat. Struct. Biol. 5, 898-902), структура ботулинического токсина типа В - Swaninathan и Eswaramoorthy (Nat. Struct. Biol.7, 693-699 (2000)). Следовательно, структура легких цепочек также известна и можно определить, какая область тяжелой и легкой цепочки находится на поверхности белка и, таким образом, может быть пригодна для связывания с PEG. Часто выбираемая процедура связывания соответственно активированного PEG (например, PEG-сукцинимидилпропионат) с ε-аминогруппой остатков лизина не кажется изобретателям перспективной. Активированный PEG может реагировать с большим количеством остатков лизина - даже в области связывания тяжелой цепочки - и это приводит в эксперименте к резкому инактивированию.

Вместо этого изобретатели идентифицировали аминокислотные остатки легкой цепочки, которые изначально пригодны для замещения, по меньшей мере, одной цистеиновой группой и впоследствии могут быть PEG-илированы, по меньшей мере, на одной вводимой цистеиновой группе. Эти модифицированные ботулинические токсины ниже будут охарактеризованы более подробно; они также представляют собой предпочтительный вариант осуществления данного изобретения и имеют в качестве конъюгатов с PEG удовлетворительную биологическую (включая энзиматическую/каталитическую) активность (которая по определению соответствует 20%, предпочтительно 30-40%, 50-70% или даже 75-95% биологической активности немодифицированного белка) с одновременно повышенной стабильностью (по сравнению с соответствующими природными нейрототксинами) и ниже будут также упомянуты как PEG-илированные мутированные ботулины или нейротоксины в соответствии с данным изобретением.

Эти последние модифицированные ботулинические токсины по данному изобретению также являются конъюгатами мутированных ботулинических токсинов с PEG. Эти модифицированные ботулинические токсины также связываются с PEG с помощью отдельно вводимых цистеиновых остатков. С этой целью, по крайней мере, один, но при желании также 2, 3, 4, 5, 10 или даже все 20 из первоначальных 20 аминокислотных остатков N-конца легкой цепочки соответствующего ботулинического токсина в каждом случае замещаются цистеиновым остатком. Эти модифицированные ботулинические токсины также содержат природную тяжелую цепочку и модифицированную легкую цепочку, причем модификация легкой цепочки такова, что, по меньшей мере, один (и до 20 максимально) природный аминокислотный остаток на N-конце мутирует в цистеиновый остаток. Если при этом они еще содержат дополнительное удлинение N-конца, то последовательность легкой цепочки образует следующую структуру в направлении от N-конца к С-концу: -(tag)_m-(X)₁-BoNT(X1-20C), в которой

С - остаток цистеина,

tag - любой кончик, например, Strep-кончик или His-кончик,

Х - остаток любой встречающейся в природе аминокислоты,

m - 0 или 1 и

I - 0 или целое число от 1 до 50.

По меньшей мере, один из максимально 20 остатков цистеина на N-конце связывается с одной цепочкой PEG.

Следовательно, здесь имеют место результирующие мутанты для BoNT/A, которые характеризуются, по крайней мере, одним - но не более чем двадцатью - следующими замещениями аминокислотных остатков, так что PEG-илирование может происходить на вводимых цистеиновых группах. P1C, F2C, V3C, N4C, K5C, Q6C, F7C, N8C, Y9C, K10C, D11C, Р12С, V13C, N14C, G15C, V16C, D17C, I18C, А19С, Y20C.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления принимаются следующие условия:

m=1, I=0, только один из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещается цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остаток в позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10;

m=0, I=0, только один из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещается цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остаток в позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10;

m=1, I≠0, только один из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещается цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остаток в позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10;

m=0, I≠0, только один из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещается цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остаток в позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10;

m=1, I=0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 3, 1 и 4, 2 и 4, 1 и 5, 2 и 5, 3 и 5, 1 и 6, 2 и 6, 3 и 6 или 4 и 6;

m=0, I=0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 3, 1 и 4, 2 и 4, 1 и 5, 2 и 5, 3 и 5, 1 и 6, 2 и 6, 3 и 6 или 4 и 6;

m=1, I≠0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 3, 1 и 4, 2 и 4, 1 и 5, 2 и 5, 3 и 5, 1 и 6, 2 и 6, 3 и 6 или 4 и 6;

m=0, I≠0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 3, 1 и 4, 2 и 4, 1 и 5, 2 и 5, 3 и 5, 1 и 6, 2 и 6, 3 и 6 или 4 и 6;

m=1, I=0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 2, 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5 или 5 и 6;

m=0, I=0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 2, 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5 или 5 и 6;

m=1, I≠0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 2, 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5 или 5 и 6;

m=0, I≠0, только два из 20 аминокислотных остатков на N-конце замещаются цистеиновой группой, наиболее предпочтительно - только остатки в позициях 1 и 2, 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5 или 5 и 6,

где молекула токсина соединяется с одной или двумя молекулами PEG в зависимости от того, замещены ли на N-конце только один или два аминокислотных остатка (одной) цистеиновой группой (группами).

Таким образом, предпочтительно эти ботулинические токсины (особенно типы А, В и С1) попадают в пределы группы вышеуказанных модифицированных ботулинических токсинов, причем их легкие цепочки модифицируются таким образом, что содержат удлинение цепочки на ее N-конце, а этот N-конец удлиненной цепочки имеет одну из нижеперечисленных последовательностей:

-(tag)₁-(X)₀-BoNT(P1C), -(tag)₁-(X)₀-BoNT(F2C), -(tag)₁-(X)₀-BoNT(V3C), -(tag)₁-(X)₀-BoNT(N4C), -(tag)₁-(X)₀-BoNT(K5C),

-(tag)₁-(X)₁-BoNT(P1C), -(tag)₁-(X)₁-BoNT(F2C), -(tag)₁-(X)₁-BoNT(V3C), -(tag)₁-(X)₁-BoNT(N4C), -(tag)₁-(X)₁-BoNT(K5C),

-(tag)₁-(X)₂-BoNT(P1C), -(tag)₁-(X)₂-BoNT(F2C), -(tag)₁-(X)₂-BoNT(V3C), -(tag)₁-(X)₂-BoNT(N4C), -(tag)₁-(X)₂-BoNT(K5C),

-(tag)₁-(X)₃-BoNT(P1C), -(tag)₁-(X)₃-BoNT(F2C), -(tag)₁-(X)₃-BoNT(V3C), -(tag)₁-(X)₃-BoNT(N4C), -(tag)₁-(X)₃-BoNT(K5C),

-(tag)₁-(X)₄-BoNT(P1C), -(tag)₁-(X)₄-BoNT(F2C), -(tag)₁-(X)₄-BoNT(V3C), -(tag)₁-(X)₄-BoNT(N4C), -(tag)₁-(X)₄-BoNT(K5C) и т.д.,

где в любом из перечисленных 25 предпочтительных вариантов осуществления m может также быть 0 вместо 1, и/или в каждом случае все цистеиновые остатки, введенные в N-конец, также являются PEG-илированными.

Конечно, I может также быть любым целым числом от 11 до 50 или больше 50, наиболее предпочтительно больше 100 или больше 250. Однако чем больше I, тем длиннее становится легкая цепочка без энзиматической/каталитической активности или (общей) биологической активности нейротоксина, согласуясь с вышеприведенным определением с помощью специфического верхнего предела длины легкой цепочки. Однако по соображениям целесообразности верхний предел I составляет 10-20, так что предпочтительные значения I находятся в диапазоне 1-10, если I не равняется 0, что особенно предпочтительно.

Пока не предложено что-либо иное, модифицированным ботулиническим токсинам дается следующее объяснение независимо оттого, с каким вариантом мы имеем дело: с цистеиновыми группами, вводимыми в удлинение N-конца легкой цепочки, или с цистеиновыми группами, вводимыми в N-конец легкой цепочки.

Предпочтительно модифицированный ботулинический токсин является модифицированным ботулиническим токсином, извлеченным из BoNT/A, BoNT/B или BoNT/Cl, но он также может быть ботулиническим токсином типов D, Е, F или G. Предпочтительно также, чтобы, с одной стороны, все искусственно введенные цистеиновые группы (вводится предпочтительно 1-10 цистеиновых групп) содержали, по крайней мере, одну цепочку PEG, но, с другой стороны, в природе не встречается PEG-илированных цистеиновых групп тяжелых и легких цепочек ботулинического токсина.

Специалистам в данной области не требуется разъяснять, что релевантность tag (m=1) заключается в более легкой очистке выработанного с помощью рекомбинации (например, в E.coli) модифицированного ботулинического токсина по данному изобретению. Таким образом, кончик (tag) не используется для повышения стабильности нейротоксина или его биологической активности, но позволяет упрощенное и едва ли не количественное (quantitative) выделение модифицированного ботулинического токсина из бактериальной культуры.

Что касается вопроса о соответствующем выборе n (в случае варианта с цистеиновой группой (группами), вводимой в удлинение N-конца легкой цепочки) или количества и позиций аминокислотных остатков, подлежащих замещению цистеиновыми группами (в случае варианта с цистеиновой группой (группами), вводимой в N-конец легкой цепочки), то считается, что предпочтительно только следующее: сколько цистеиновых групп вводится, столько PEG-групп должно быть выведено (то же самое применимо к случаю, когда I≠0 и, по крайней мере, один аминокислотный остаток Х является цистеиновой группой). Все эти вводимые цистеиновые группы могут предпочтительно быть PEG-илированы и притом полностью с наружной стороны, и это является неожиданной находкой изобретателей, даже одна из цистеиновых групп, попавшаяся естественным образом в ботулиническом токсине, подлежащем PEG-илированию, на тяжелой или на легкой цепочке (не говоря о каждом внутри- и межмолекулярном дисульфидном мостике, ботулинический токсин типа А, например, обнаруживает три дополнительные цистеиновые группы в тяжелой цепочке (C₇₉₁, C₉₆₇, C₁₀₆₀), а также две дополнительные цистеиновые группы в легкой цепочке (C₁₃₄ и C₁₆₅)). Таким способом может быть получен консистентный продукт в виде PEG-илированного мутировавшего ботулинического токсина. Кроме того, благоразумно будет устранить многие лишние или введенные на неправильные позиции группы цистеина или PEG по дополнительным соображениям. Это нужно, поскольку (I) токсин, возможно, станет слишком объемистым для того, чтобы связываться с клеткой-мишенью и/или (II) легкая цепочка, возможно, несмотря на связывание токсина с клеткой-мишенью, совершит недостаточную транслокацию в клетку-мишень. Другими словами, введение только одной цистеиновой группы в том или ином варианте и ее PEG-илирование определенно способствуют достижению цели изобретения и, следовательно, являются особо предпочтительными.

Соответственно PEG-илированные мутированные ботулины/нейротоксины, предлагаемые в данном изобретении, подобны соответственным природным ботулинам/нейротоксинам, биологически и энзиматически (то есть каталитически) активны или проявляют в смысле определения, данного выше, не более чем незначительно пониженную биологическую и энзиматичес