Фармацевтические композиции с устойчивостью к растворимому сеа

Фармацевтические композиции с устойчивостью к растворимому сеа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Более чем три десятилетия прошло с тех пор, как Gold и Freedman впервые описали опухолевый карциномоэмбриональный антиген (CEA) в экстрактах ткани при раке толстого кишечника человека (Gold and Freedman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481).

При этом обнаружили 28 других генов/псевдогенов, относящихся к семейству генов CEA. В попытке упростить номенклатуру, используемую для членов семейства генов CEA, семейство недавно переименовали в «родственные CEA молекулы клеточной адгезии» (CEACAM), и номенклатуру для его членов унифицировали (Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249). Например, согласно этой номенклатуре CEA человека (CD66e) назван CEACAM5.

Семейство генов CEA человека кластеризовано на хромосоме 19q13.2 (Olsen et al. Genomics 23 (1994); 659-668). Его 29 генов и псевдогенов можно разделить на три подгруппы, т.е. подгруппу CEA, содержащую семь экспрессирующихся генов, подгруппу специфичного для беременности гликопротеина (PSG), содержащую одиннадцать экспрессирующихся генов, и третью подгруппу, содержащую только псевдогены (Hammarström, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249). Анализ аминокислотных последовательностей CEA и других членов семейства выявил, что они принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов (Ig) (Williams and Barclay, Annul. Rev. Immunol. 6 (1988), 381-405). Все члены подгруппы CEA присоединены к поверхностной мембране клетки: биллиарный гликопротеин (CEACAM1; BGP1; TM-CEA; CD66a), член семейства генов CEA 1 (CEACAM3; CGM1; CD66d) и член семейства генов CEA 7 (CEACAM4; CGM7) обладают гидрофобными трансмембранными доменами, тогда как карциномоэмбриональный антиген (родственная карциномоэмбриональному антигену молекула клеточной адгезии 5; CEACAM5; CEA; CD66e), неспецифический перекрестно-реагирующий антиген (CEACAM6; NCA; NCA-50/90; CD66c), член семейства генов CEA 2 (CEACAM7; CGM2) и член семейства генов CEA 6 (CEACAM8; CGM6; CD66b) связаны с плазматической мембраной посредством липидных групп гликозилфосфатидилинозитола (GPI). Белки CEA являются высоко гликозилированными с молекулярной массой вплоть до приблизительно 300 кДа, в зависимости от числа доменов Ig.

Что касается биологической активности белков CEA, исследования in vitro линий клеток опухоли позволили предположить, что несколько подсемейств CEA, включая биллиарный гликопротеин, CEA и неспецифический перекрестно-реагирующий антиген, могут действовать как гомофильные и гетеротипические молекулы клеточной адгезии при экспрессии на поверхности опухолевой клетки (Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992), 881-887; Zhou et al., Cancer Res. 53 (1993), 3817-3822). Более недавно обсуждали возможную роль CEA и неспецифического перекрестно-реагирующего антигена во врожденной иммунной защите, защищающей толстую кишку от микробного заражения (Hammarström and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001), p. 119-125). В частности, предположили, что эти белки связывают и удерживают микроорганизмы, предупреждая достижение ими эпителиальных клеток микроворсинок и проникновение в них.

Выдвинули гипотезу, что CEA представляет собой онкофетальный антиген, экспрессирующийся в течение эмбрионального периода, отсутствующий у здорового взрослого и реэкспрессирующийся при раке. Однако CEA экспрессируется также в нормальной ткани взрослых. Например, биллиарный гликопротеин, CEA, неспецифический перекрестно-реагирующий антиген и член семейства генов CEA 2 экспрессируются в нормальной толстой кишке человека, в частности, в зрелых столбчатых эпителиальных клетках, обращенных в просвет кишки, и в высоко дифференцированных клетках в устье крипт (Fröngsmyr et al., Cancer Res. 55 (1995), 2963-2967; Frängsmyr et al., Tumor Biol. 20 (1999), 277-292). Более конкретно, эти белки локализованы на гликокаликсе щеточной каймы зрелых колоноцитов, выстилающих свободную поверхность просвета. Биллиарный гликопротеин, CEA и неспецифический перекрестно-реагирующий антиген экспрессируются также в ряде опухолей эпителиального происхождения (Hammarström, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399).

Уже в поздние 1970 и ранние 1980 CEA стал преимущественным антигеном-мишенью для радиоиммунолокализации колоректальных и других эпителиальных опухолей. Это обусловлено фактом, что CEA сверхэкспрессирован в 95% гастроинтестинальных опухолей и опухолей поджелудочной железы, так же как в большинстве мелкоклеточных и немелкоклеточных карцином легкого. Он экспрессирован также в карциноме молочной железы и плоскоклеточной карциноме головы и шеи (Primus et al., Cancer 42 (1978), 1540-1545). Фактически CEA является одним из наиболее широко используемых клинических маркеров опухоли. Его используют как сывороточный опухолевый маркер для колоректального и некоторых других видов рака из-за его стабильности, его достаточно рестрицированной экспрессии в нормальной ткани взрослых и его высокой экспрессии в опухолях эпителиального происхождения. Основная часть CEA у здорового индивидуума продуцируется в толстой кишке. Там он высвобождается с апикальной поверхности зрелых столбчатых клеток в просвет кишки и исчезает с фекалиями. Таким образом, в норме можно наблюдать только очень низкие уровни в крови здоровых индивидуумов. Например, уровни CEA в крови здоровых индивидуумов составляют менее чем 2 мкг/л. В отличие от этого, уровни CEA в сыворотке пациентов с колоректальными и другими карциномами увеличены, находясь в диапазоне вплоть до более чем 2000 мкг/л (Thomson et al., PNAS 64 (1969), 161-167). В частности, прогрессирующие, злокачественные или находящиеся на поздних стадиях эпителиальные опухоли часто сопровождаются высокими концентрациями в сыворотке растворимого CEA (Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986), 66-73). Известно, что компоненты плазматической мембраны, включая CEA, непрерывно отслаиваются от поверхности в виде полученных из мембраны везикул (Taylor and Black, J. Natl. Cancer Inst. 74 (1985), 859-866; Sack et al., J Clin Invest. 82 (1988), 586-93), которые в результате дренирования лимфатических и кровеносных сосудов могут оказаться в крови. С увеличением размера опухоли больше CEA будет накапливаться в крови. Основным применением определений CEA в сыворотке в качестве опухолевого маркера является послеоперационное наблюдение рака толстого кишечника. Увеличенные уровни CEA являлись первым показателем рецидивирующего заболевания у 81% (Minton et al., Cancer 55 (1985), 1284-1290) и 89% (Wanebo et al., Surg. Gynecol. Obstet. 169 (1989), 479-487) пациентов, соответственно. Уровни CEA в сыворотке можно также использовать как прогностический показатель (Mulcahy and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999), 168-172).

Из-за его сверхэкспрессии при многих видах эпителиального рака CEA используют не только как опухолевый маркер, но также как мишень для противоопухолевой терапии. Например, гастроинтестинальные виды рака отвечают за большую часть эпителиальных опухолей человека, предположительно с 21700 новых случаев рака желудка и 135400 новых случаев колоректального рака в Соединенных Штатах в 2001 году (Greenlee; CA Cancer J Clin 51 (2001), 15-36). Колоректальный рак является третьим из наиболее распространенных злокачественных опухолей и третьей из лидирующих причин смерти от рака как у мужчин, так и у женщин (Ries; Cancer 88 (2000), 2398-2424). В попытке найти новые лекарственные средства против этих опухолей, моноклональные антитела против CEA исследовали в качестве возможных лекарственных средств для CEA-положительных видов рака (Murakami et al., Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35).

Одним примером способа, при котором пациентов с низкой опухолевой нагрузкой (соответствующей низким уровням CEA в сыворотке) успешно лечили, является исследование, проведенное Behr et al. По этому способу меченный ¹³¹I вариант лабетузумаба (лабетузумаб представляет собой гуманизированную форму моноклонального антитела против CEA MN-14; Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, (2002), 1559-64) анализировали в фазе II испытания, в котором зарегестрировали 30 пациентов с CRC с небольшим объемом метастазирующего заболевания, устойчивого к химиотерапии 5-фторурацилом и фолиновой кислотой, или при адъювантной терапии после метастазирования в печень. Вводили однократную инъекцию меченного ¹³¹I лабетузумаба. Из 19 оцениваемых пациентов 3 обладали частичными ремиссиями и для восьми наблюдали незначительные ответы продолжительностью вплоть до 15 месяцев. При адъювантной терапии у 7 из 9 пациентов заболевание не рецидивировало до 3 лет, тогда как частота рецидивов в контрольной группе составляла 67% в тот же период времени. Уровни CEA в сыворотке пациентов лежали в диапазоне 3,9-45 нг/мл (Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, 2002). В другом исследовании, характеризующемся пациентами с низкими уровнями CEA в сыворотке (<5нг/мл), показали, что радиоиммунотерапия CEA ¹³¹I-лабетузумабом (в приводившейся выше цитате) улучшала выживаемость после резекции по жизненным показаниям метастазов колоректального рака в печени. 23 пациентам вводили дозу 40-60 мКи/м^{2 131}I-лабетузумаба. Пятилетняя выживаемость составляла 51,3% для обработанной и 7,4% для контрольной группы, соответственно (Liersch et al., JCO, 2005, ASCO Proc, Vol. 23, No 16S: 3627).

Тем не менее, терапевтические способы, применяемые при высоких концентрациях CEA в сыворотке, часто приводят к низким противоопухолевым ответам или отсутствию противоопухолевых ответов. Например, в клиническом исследовании, проводимом для оценки гуманизированного моноклонального антитела против CEA в клинике, CDR-привитый вариант MN-14 (hMN-14; Sharkey, Cancer Res. 55 (23 Suppl) (1995) 5935s-5945s.) метили ¹³¹I. 19 пациентам с запущенными CEA-продуцирующими опухолями вводили меченное ¹³¹I hMN-14. Биораспределение, нацеливание на опухоли и фармакокинетическое поведение hMN-14 являлись сходными с наблюдаемыми для мышиного MN-14. Однако у пациентов с повышенным уровнем CEA (> 200 нг/мл) в плазме более чем 30% меченого антитела связывались в течение 1 час после инъекции. У некоторых из этих пациентов увеличенное связывание приводило к увеличенному метаболизму антитела с более быстрым клиренсом из крови, чем наблюдали у пациентов с более низким уровнем CEA в плазме (Sharkey, в приводившейся выше цитате). В другом испытании фазы I, проводимом Yu et al., меченое ¹³¹I высокоаффинное мышиное моноклональные антитело (mAb) против CEA, COL-1 (Muraro, Cancer Res. 45 (1985), 5769-80) исследовали для пациентов с гастроинтестинальными злокачественными опухолями. В частности, анализировали влияние уровня CEA в сыворотке и объема опухоли на фармакокинетику. С этой целью 18 пациентам с запущенными гастроинтестинальными злокачественными опухолями вводили 20 мг COL-1, меченного ¹³¹I, в дозах от 10 мКи/м² до 75 мКи/м². Уровень CEA в сыворотке лежал в диапазоне от 6 до 2739 нг/мл (среднее +/- SD, 500 +/- 639). Положительными являлись 82% пораженных опухолями органов и 58% всех очагов. Однако опять наблюдали, что повышенный уровень CEA в сыворотке (> 500 нг/мл) и объем опухоли напрямую коррелируют с клиренсом радиоактивности в сыворотке. Авторы заключили, что у пациентов с сильно увеличенными уровнями циркулирующего CEA в сыворотке и/или увеличенным объемом опухоли клиренс меченного ¹³¹I COL-1 из кровотока происходит более быстро (Yu et al., J. Cli. Oncol. 14 (1996), 1798-1809). Сходные результаты получили в исследовании Hajjar et al. с использованием меченного иодом-131 гуманизированного моноклонального антитела против CEA MN-14 для пациентов с метастазирующим гастроинтестинальным и колоректальным раком. В фазе I этого испытания 21 пациента либо после предварительного внешнего направленного облучения, либо после стандартной химиотерапии лечили антителом. 7 из 21 пациентов обладали человеческими антителами против антител человека (HAHA), однако без неблагоприятных эффектов. Не наблюдали противоопухолевых ответов. Снова обнаружили, что увеличенные уровни CEA в плазме увеличивают клиренс антитела из крови и целого организма (Hajjar et al., Clin Colorectal Cancer, 2 (2002), 31-42), что, по меньшей мере частично, может предоставлять объяснение отсутствия противоопухолевого ответа, наблюдаемого в этом исследовании. Феномен быстрого клиренса терапевтического антитела из крови и организма можно объяснить увеличенным формированием иммунных комплексов, которые необходимо быстро удалить из организма, чтобы предотвратить повреждение органа. Невозможно было обнаружить терапевтический эффект у пациентов с опухолями, зарегистрированных в этих исследованиях, наиболее вероятно, из-за быстрого клиренса моноклональных антител.

Чтобы обойти проблемы, вызванные формированием иммунных комплексов и быстрым клиренсом терапевтических моноклональных антител, которые, наиболее вероятно, обусловлены Fc-частью антител, распознаваемых Fc-рецепторами иммунных клеток, получили и анализировали в клинике производные антител (например, конструкции scFv) или фрагменты антител (например, Fab и Fab₂ фрагменты) без Fc-части. Большинство этих исследований направлены на получение изображения и детекцию/локализацию опухоли (см., например, Chester et al., Cancer Chemother Pharmacol, 46 (2000) Suppl: S8-12; Mayer et al., Clin Cancer Res, 6: (2000) 1711-1719; Begent et al., Nat Med, 2 (1996): 979-984). Только в немногих исследованиях исследовали терапевтическую эффективность таких производных/фрагментов антитела в клинике. Например, для клинического способа Francis et al. (Francis, Br. J. Cancer 87(6) (2002), 600-607) исследовали противоопухолевую активность конструкции scFv-карбоксипептидаза. В фазе I этого испытания направляемую антителом терапию с использованием фермента и пролекарственного соединения (ADEPT) использовали для пациентов с запущенной колоректальной карциномой или другими продуцирующими CEA опухолями. С этой целью использовали A5CP, состоящий из F(ab)₂-фрагмента моноклонального антитела против CEA (A5B7), связанного с бактериальным ферментом карбоксипептидазой (CPG2) в качестве направляемого средства антитело-фермент и ZD2767P, пролекарство бис-иодфенол-иприт. В результате в исследовании не наблюдали клинических или радиологических ответов. Уровни CEA в сыворотке до лечения составляли вплоть до 1000 нг/мл. Эти высокие концентрации CEA в сыворотке пациентов с опухолями после лечения могут, по меньшей мере частично, отвечать за отсутствие противоопухолевого ответа, наблюдаемое в этом исследовании.

Принимая во внимание указанные выше проблемы, предоставление средств и способов для эффективной терапии для прогрессирующих, злокачественных или находящихся на поздней стадии эпителиальных опухолей является очень желательным.

Соответственно, один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, где указанная фармацевтическая композиция содержит биспецифическое одноцепочечное антитело, обладающее

(a) первым связывающим доменом, специфически связывающим CD3 человека, и

(b) вторым связывающим доменом, специфически связывающим CEA человека,

где указанный второй связывающий домен содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность «DX₁X₂X₃X₄FYFDY» (SEQ ID NO:65), где «X₁», «X₂», «X₃» или «X₄» представляет собой любой аминокислотный остаток, и аминокислотный остаток «D» соответствует положению 95 по Kabat CDR-H3 моноклонального антитела мыши A5B7, и аминокислотные остатки «FYFDY» соответствуют положениям по Kabat 100, 100a, 100b, 101 и 102, соответственно, CDR-H3 моноклонального антитела мыши A5B7. В одном варианте осуществления «X₁» представляет собой «R» (аргинин), «F» (фенилаланин), «M» (метионин), «E» (глутаминовую кислоту) или «T» (треонин); «X₂» представляет собой «G» (глицин), «Y» (тирозин), «A» (аланин), «D» (аспарагиновую кислоту) или «S» (серин); «X₃» представляет собой «L» (лейцин), «F» (фенилаланин), «M» (метионин), «E» (глутаминовую кислоту) или «T» (треонин); и «X₄» представляет собой «R» (аргинин), «Y» (тирозин), «A» (аланин), «D» (аспарагиновую кислоту) или «S» (серин).

В одном варианте осуществления фармацевтической композиции по изобретению указанный второй связывающий домен, специфический для CEA человека, из биспецифического одноцепочечного антитела, определенного здесь, содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность «DRGLRFYFDY» (SEQ ID NO:66), соответствующую положениям 95-102 по Kabat CDR-H3 моноклонального антитела мыши A5B7.

Настоящее изобретение относится к средствам и способам, в частности, подходящим для лечения пациентов с эпителиальной опухолью с высокими концентрациями растворимого CEA в плазме. Такие высокие концентрации растворимого CEA обнаружены в сыворотке/плазме пациентов с эпителиальной опухолью с прогрессирующими опухолями, рецидивирующими, метастазирующими опухолями, опухолями на поздних стадиях и для пациентов с большим объемом/массой опухоли. Обнаружено, что биспецифические одноцепочечные антитела со связывающим CEA доменом, содержащим аминокислотную последовательность «DRGLRFYFDY» (SEQ ID NO:66), связываются не только с CEA-положительными клетками-мишенями, но также с растворимым CEA; см. пример 3 и фигуру 2 настоящего изобретения; и EP B1 491031. Указанная аминокислотная последовательность «DRGLRFYFDY» соответствует положениям по Kabat 95-102 (SEQ ID NO:66) CDR-H3 моноклонального антитела мыши A5B7 (Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82). Неожиданно, несмотря на связывание с растворимым CEA, указанные биспецифические одноцепочечные антитела убивают несущие CEA опухолевые клетки, даже в присутствии высоких концентраций растворимого CEA (тестировали вплоть до 1 мкг/мл растворимого CEA). Иными словами, растворимый CEA не ингибирует цитотоксическую активность указанных биспецифических конструкций против CEA-положительных опухолевых клеток.

Как показано в следующих ниже примерах 5 и 8 (в сочетании с фигурами 5, 6, 8, 10, 19, 20, 22 и 27), биспецифические одноцепочечные антитела со связывающим CEA доменом, содержащим аминокислотную последовательность «DRGLRFYFDY», опосредуют цитотоксичность против CEA-положительных опухолевых клеток в присутствии даже высоких концентраций растворимого CEA. Например, на фигуре 10 показан анализ цитотоксичности CEA-реактивных биспецифических одноцепочечных конструкций, перенаправляемых на клетки Kato III (линия CEA-положительных клеток карциномы желудка человека) в присутствии увеличивающихся количеств растворимого антигена CEA. Стимулированные CD8-положительные цитотоксические T-клетки человека (CTL) использовали в качестве эффекторных клеток. Цитотоксичность, опосредуемая CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, является устойчивой к растворимому CEA. В отличие от этого, опосредованную CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL цитотоксическую активность ингибируют увеличивающиеся количества растворимого CEA. CEAI представляет собой вариабельную область, полученную из mAb мыши A5B7, в то время как CEAII VHVL получена из mAb T84.66.

Важно, что обнаружили, что аминокислотная последовательность «DRGLRFYFDY» является существенной, чтобы опосредовать устойчивость к растворимому CEA, при использовании в связывающем CEA домене человека (т.е. человеческом связывающем домене, специфически связывающемся с CEA человека) из биспецифических одноцепочечных антител анти-CEA x анти-CD3; см., например, фигуры 19, 20, 22 и 27. В дальнейшем биспецифические одноцепочечные антитела, как определено здесь, таким образом, обозначают как устойчивые к растворимому антигену CEA. Термин «устойчивый к растворимому антигену CEA», «устойчивый к растворимому CEA» или родственные термины, как применяют здесь, относятся к факту, что на цитотоксичность против CEA-положительной мишени или опухолевых клеток, опосредованную указанными биспецифическими одноцепочечными антителами, не влияют увеличивающиеся концентрации растворимого CEA. В частности, цитотоксическую активность не ингибируют даже высокие концентрации растворимого CEA (тестировали вплоть до 1 мкг/мл). Как указано выше, уровни CEA в крови здоровых индивидуумов составляют менее чем 2 нг/мл. Высокие концентрации растворимого CEA в сыворотке/плазме пациентов с опухолью являются характерными для прогрессирующих, рецидивирующих, метастатических опухолей или опухолей на поздней стадии и для пациентов с высокой опухолевой нагрузкой. Таким образом, настоящее изобретение относится к средствам и способам, в частности, подходящим для лечения пациентов с эпителиальной опухолью с такими высокими концентрациями растворимого CEA в плазме. Термин «высокие концентрации растворимого CEA», как применяют здесь, обозначает концентрацию растворимого CEA в сыворотке/плазме выше, чем 10, 20, 50, 70, 80, 90 или 100 нг/мл. Эту концентрацию CEA в сыворотке/плазме можно определить, среди прочего, посредством ELISA. Предпочтительно, указанная концентрация растворимого CEA в сыворотке/плазме превышает 100 нг/мл, как определено, например, посредством ELISA.

Получение указанных биспецифических одноцепочечных антител с устойчивостью к растворимому антигену CEA не являлось тривиальной задачей, как очевидно из нижеследующих примеров. Например, биспецифические одноцепочечные антитела со связывающим CEA доменом, полученным из моноклонального антитела (mAb), известного как связывающееся со связанным с мембраной CEA, но не с растворимым CEA, т.е. mAb PR1A3 (Durbin, Proc Natl Acad Sci USA, 91 (1994), 4313-7), не смогли получить: При использовании в формате биспецифического одноцепочечного антитела нельзя было достичь экспрессии/секреции биспецифической одноцепочечной конструкции анти-CD3 x анти-CEA. При использовании для получения гуманизированного варианта PR1A3 (Durbin, в приводившейся выше цитате) конструкция биспецифического одноцепочечного антитела экспрессировалась и секретировалась из клетки-хозяина. Однако не смогли получить связывания связывающего домена анти-CEA со связанным с мембраной CEA.

Когда получили биспецифические одноцепочечные антитела, полученные из хорошо описанных моноклональных антител T84.66 (Neumaier, M. et al., Cancer Res 50 (1990), 2128-34) или MFE-23 (Boehm, M. K. Biochem J 2 (2000), 519-28), эти биспецифические антитела являлись высокочувствительными к растворимому антигену CEA, т.е. их цитотоксическая активность против CEA-положительной мишени или опухолевых клеток являлась блокированной в присутствии растворимого антигена CEA. Поскольку обнаружили, что указанные конструкции связываются с растворимым CEA, заключили, что растворимый антиген CEA предупреждает связывание антитела со связанным с мембраной CEA, таким образом, блокируя опосредованную антителом цитотоксическую активность. Например, на фигуре 7 показан анализ цитотоксичности CEA-реактивной биспецифической одноцепочечной конструкции, перенаправленной на клетки CHO, трансфицированные CEA, в присутствии растворимого CEA человека. Стимулированные CD8-положительные цитотоксические T-клетки (CTL) человека использовали в качестве эффекторных клеток. Цитотоксическую активность CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL явно ингибируют увеличивающиеся количества растворимого CEA. CEAII VHVL получен из mAb T84.66; SEQ ID NO.77 представляет собой домен анти-CD3 VH-VL.

Устойчивость к растворимому антигену CEA можно обнаружить только для биспецифических одноцепочечных антител, связывающий CEA домен которых содержит аминокислотную последовательность «DRGLRFYFDY» CDR-H3 моноклонального антитела мыши A5B7 (Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82). Как и для полученных из MFE-23 и T84.66 биспецифических одноцепочечных конструкций, полученные из A5B7 биспецифические одноцепочечные антитела связываются с растворимым CEA. В свете результатов, полученных для полученных из MFE-23 и T84.66 биспецифических одноцепочечных конструкций, нельзя ожидать, что растворимый CEA не влияет на цитотоксическую активность полученных из A5B7 конструкций одноцепочечного биспецифического антитела.

Как указано выше, многим терапевтическим способам, направленным против несущих CEA эпителиальных опухолей у человека, серьезно препятствует присутствие высоких уровней растворимого антигена CEA в плазме пациентов с раком. Например, увеличение формирования иммунных комплексов и клиренса терапевтических моноклональных антител против CEA в присутствии высоких концентраций CEA в плазме наблюдали в нескольких клинических исследованиях. Кроме того, растворимый антиген CEA - часто присутствующий в высоких концентрациях в сыворотке пациентов с раком с прогрессирующими опухолями, рецидивирующим раком, метастазирующими опухолями, с большим объемом/массой опухоли, или опухолями на поздних стадиях - блокирует лекарственные средства, направленные против CEA-положительных опухолевых клеток, таким образом, предупреждая распознавание и разрушение опухолевой клетки. Таким образом, фактическое количество лекарственного средства, которое достигает опухоли, снижено, что приводит к уменьшенной, низкой или даже отсутствующей противоопухолевой активности. Это ограничение до настоящего времени ограничивает применение, например, основанных на антителах способах у пациентов с очень низкими количествами растворимого антигена CEA, с малой вероятностью предупреждающими взаимодействие лекарственное средство-опухолевая клетка.

По настоящему изобретению обнаружили, что возможно получить биспецифическое одноцепочечное антитело-лекарственное средство со специфичностью для CD3 человека и CEA человека, где цитотоксическая активность, направленная против опухолевых клеток, является устойчивой даже к высоким концентрациям растворимого антигена CEA (тестировали вплоть до 1 мкг/мл растворимого CEA). Это открытие является полностью неожиданным с точки зрения факта, что биспецифические одноцепочечные антитела по изобретению связываются с растворимым антигеном СЕА (см. пример 3 и фигуру 2 по настоящему изобретению; см. также ЕР В1 491031). Тем не менее, биспецифические одноцепочечные антитела, как определено здесь, являются полностью устойчивыми к присутствию даже высоких уровней растворимого СЕА по их цитотоксической активности по отношению к опухолевым клеткам. Таким образом, настоящее изобретение относится к средствам и способам, в частности, подходящим для лечения пациентов с опухолью с высокими концентрациями растворимого СЕА в плазме, как наблюдали, например, в течение прогрессии опухоли, для рецидивирующего рака, для метастазов, для пациентов с большим объемом/массой опухоли или для опухолей на поздней стадии.

Согласно этому изобретению термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции для введения пациенту-человеку. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит подходящие составы носителей, стабилизаторов и/или эксципиентов. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит композицию для парентерального, чрескожного, внутрипросветного, интраартериального, интратекального и/или интраназального введения или для прямой инъекции в ткань. В частности, предусматривают, что указанную композицию вводят пациенту посредством инфузии или инъекции. Введение подходящих композиций можно выполнять различными способами, например, посредством внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области и включают в себя фосфатно-солевые буферные растворы, воду, различные типы увлажняющих веществ, стерильные растворы, липосомы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, можно составлять посредством хорошо известных общепринятых способов. Эти композиции можно вводить субъекту в подходящей дозе, которую можно определить, например, посредством исследований увеличения дозы посредством введения увеличивающихся доз биспецифического одноцепочечного антитела, обладающего устойчивостью к растворимому антигену CEA в сыворотке, описанного здесь. Как указано выше, биспецифическое одноцепочечное антитело, описанное здесь, с устойчивостью к растворимому антигену CEA в сыворотке, можно преимущественно использовать для лечения пациентов с раком с высокими концентрациями CEA в сыворотке, таких как пациенты с прогрессирующими опухолями, рецидивирующим раком, метастазирующими опухолями, с большим объемом/массой опухоли или с опухолями на поздних стадиях. Эти композиции можно также вводить в сочетании с другими белковыми и небелковыми лекарственными средствами, например, в форме совместной терапии. Эти лекарственные средства можно вводить одновременно с композицией, содержащей биспецифическое одноцепочечное антитело, как определено здесь, или отдельно до или после введения указанного биспецифического антитела в заранее определенных интервалах и дозах. Режим дозирования будет определен лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в области медицины, дозы для каждого пациента зависят от множества факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, подлежащее введению, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные водные или неводные растворы и суспензии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла и подходящие для инъекции органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают в себя воду, водные растворы или суспензии, включая физиологический раствор и буферную среду. Парентеральные носители включают в себя раствор хлорида натрия, раствор декстрозы Рингера, декстрозу и хлорид натрия, или раствор Рингера с лактатом. Внутривенные носители включают в себя жидкие и питательные освежающие добавки, электролитные освежающие добавки (такие как основанные на растворе декстрозы Рингера) и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, например, такие как противомикробные средства, антиокислители, хелатирующие средства, инертные газы и т.п. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может содержать белковые носители, например, подобные сывороточному альбумину или иммуноглобулину, предпочтительно, человеческого происхождения. Предусматривают, что совместная терапия включает в себя, в дополнение к биспецифическому одноцепочечному антителу, как определено здесь, дополнительные биологически активные средства, в зависимости от предназначенного применения композиции. Такие средства могут представлять собой лекарственные средства, действующие на желудочно-кишечную систему, лекарственные средства, действующие как антинеопластические средства, химиотерапевтические средства, цитостатики, лекарственные средства, предупреждающие гиперурикемию, лекарственные средства, ингибирующие иммунные реакции (например, кортикостероиды), лекарственные средства, модулирующие воспалительный ответ, лекарственные средства, действующие на систему кровообращения, и/или такие средства, как цитокины, известные в данной области.

Предпочтительно, биспецифическое одноцепочечное антитело, как определено здесь, составляют в буфере, стабилизаторе и поверхностно-активном веществе. Буфер может представлять собой фосфатный, цитратный, сукцинатный или ацетатный буфер. Стабилизатор может представлять собой аминокислоту(аминокислоты) и/или сахар. Поверхностно-активные вещества могут представлять собой детергенты, PEG или т.п. Более предпочтительно, биспецифическое одноцепочечное антитело, как определено здесь, составляют в цитрате, лизине, трегалозе и Tween 80. В качестве разбавителя для фармацевтической композиции по изобретению предпочтительным является изотонический физиологический раствор и Tween 80.

Как применяют здесь, «биспецифическое одноцепочечное антитело» обозначает одну полипептидную цепь, содержащую два связывающих домена. Каждый «связывающий домен», как применяют здесь, содержит одну вариабельную область из тяжелой цепи антитела («VH-область»), где VH-область первого связывающего домена специфически связывается с указанной первой молекулой, т.е. молекулой CD3 человека, и VH-область второго связывающего домена специфически связывается с CEA человека, как более подробно определено ниже. Два связывающих домена, необязательно, связаны один с другим коротким полипептидным спейсером, как правило, содержащим порядка 5 аминокислот. Каждый связывающий домен может дополнительно содержать одну вариабельную область из легкой цепи антитела («VL-область»), где VH-область и VL-область внутри каждого из первого и второго связывающих доменов связаны один с другим посредством полипептидного линкера, например линкера типа, описанного и заявленного в EP B1 623679, но в любом случае достаточно длинного, чтобы позволить VH-области и VL-области первого связывающего домена и VH-области и VL-области второго связывающего домена спариваться друг с другом, так что вместе они способны специфически связываться с соответствующей первой и второй молекулами. Расположение V-областей первого или второго связывающего домена может представлять собой VH-VL или VL-VH. Предпочтительно, расположение для первого связывающего домена, специфически связывающегося с CD3 человека, представляет собой VH-VL, как показано в следующих ниже примерах. Предусматривают, что первый связывающий домен может являться локализованным с N-конца или с C-конца от второго связывающего домена. Таким образом, расположение связывающих доменов биспецифических одноцепочечных антител, определенных здесь, может представлять собой VH_CEA-VL_CEA-VH_CD3-VL_CD3, VL_CEA-VH_CEA-VH_CD3-VL_CD3, VH_CD3-VL_CD3-VH_CEA-VL_CEA или VH_CD3-VL_CD3-VL_CEA-VH_CEA. Предпочтительно, указанный первый связывающий домен, специфический для CD3, локализован с C-конца от второго связывающего домена. Более предпочтительно, связывающие домены биспецифических одноцепочечных антител, определенных здесь, расположены в порядке VH_CEA-VL_CEA-VH_CD3-VL_CD3 или VL_CEA-VH_CEA-VH_CD3-VL_CD3. Даже более предпочтительно, порядок представляет собой VL_CEA-VH_CEA-VH_CD3-VL_CD3. Наиболее предпочтительной является конструкция биспецифического одноцепочечного антитела A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO:77 VHVL, как определено в SEQ ID NO:34. Предусматривают, что указанные первый и/или второй связывающие домены биспецифического одноцепочечного антитела, определенного здесь, могут происходить не от человека (т.е. являться полученными из не относящихся к человеку последовательностей). Например, указанные первый и/или второй связывающие домены могут являться полученными из моноклональных антител мыши. Однако биспецифические одноцепочечные антитела, полученные из антител мыши, могут являться распознаваемыми как чужеродные при введении пациентам-людям. Таким образом, указанные первый и/или второй связывающие домены биспецифических одноцепочечных антител, определенных здесь, предпочтительно человеческого происхождения (т.е. получены из человеческих последовательностей). Такие человеческие связывающие домены, специфически связывающиеся с CEA или CD3, можно идентифицировать, например, посредством способов на основе фагового дисплея. Предусматривают также, что, например, VH-область первого (или второго) связывающего домена представляет собой VH-область человека, в то время как соответствующая VL-область первого (или второго) связывающего домена может происходить не от человека. Такие связывающие домены можно также обозначать как химерные связывающие домены. Или один из указанных связывающих доменов может происходить не от человека, тогда как другой - человеческого происхождения, что приводит к химерному биспецифическому одноцепочечному антителу. Указанный первый и/или второй связывающие домены можно далее модифицировать, чтобы уменьшить иммуногенность биспецифического одноцепочечного антитела, описанного здесь, при введении пациентам-людям. Например, по меньшей мере один из указанных первого или второго связывающих доменов биспецифических одноцепочечных антител, определенных здесь, может являться гуманизированным, CDR-привитым, химерным и/или деиммунизированным, или человеческим, как более подробно описано ниже. Предусматривают также, что полипептидный линкер, связывающий VH- и VL-область внутри первого и/или второго связывающего домена, является деиммунизированным. Предпочтительно, полипептидный линкер, связывающий VH- и VL-область внутри деиммунизированного первого связывающего домена (специфического для CD3), представляет собой деиммунизированный полипептидный линкер, обладающий последовательностью «GEGTSTGS(G₂S)₂GGAD» (SEQ ID NO:141). Более того, предусматривают, что один или оба из указанных связывающих доменов биспецифических одноцепочечных антител, определенных здесь, несут так называемые «метки», которые можно использовать, например, для экспрессии, очистки, детекции или обогащения белка, такие как Flag-метки, c-myc-метки, GST-метки или His-метки. Например, для Flag-метки наиболее общеупотребительным сейчас гидрофильным октапептидом является DYKDDDDK (Chubet and Brizzard, Biotechniques 20 (1996): 136-141), хотя недавние исследования позволили предположить, что более короткий пептид, DYKD, может узнавать почти с такой же аффинностью моноклональное антитело M1 (Knappik A, Pluckthun A; Biotechniques 17 (1994):754-761). Flag-метки, c-myc-метки, GST-метки, His-метки или т.п. можно помещать