Генетические конструкции для антивич-терапии

Генетические конструкции для антивич-терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицинской и молекулярной генетике, а именно к генетическим конструкциям, экспрессирующим РНК-последовательности и/или гены, кодирующие белки, обладающие антивирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека, и может быть использовано в научных исследованиях.

Уровень техники

ВИЧ-инфекция остается огромной проблемой для здравоохранения и общества в целом. Число ВИЧ-инфицированных продолжает неуклонно расти. Современная высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) позволяет эффективно сдерживать прогрессирование заболевания и значительно повышает уровень жизни ВИЧ-инфицированного пациента. Однако ВААРТ является дорогостоящим пожизненным лечением и приводит к накоплению побочных эффектов, связанных с токсичностью используемых химических препаратов. Кроме того, проблемой ВААРТ является возникновение лекарственно устойчивых мутантных штаммов, что приводит к необходимости в постоянной разработке и использовании все большего количества новых химических препаратов.

Генная терапия ВИЧ подразумевает введение в клетки генов, подавляющих развитие инфекции. На данный момент на клеточных культурах опробовано множество генетических конструкций, в той или иной мере усиливающих устойчивость клеток к ВИЧ. Усовершенствование клинических методов изоляции и трансплантации клеток позволяет рассматривать генотерапию как перспективное направление антиВИЧ-терапии.

Заявка WO/2007/104633 A1 20.09.2007 раскрывает самоинактивирующиеся рекомбинантные лентивирусные векторы для ингибирования репликации ВИЧ, включающие 5'LTR и 3'LTR, отличающиеся тем, что включают ген бета-интерферона.

Заявка WO 0137881 (А2) 31.05.2001 относится к лечению ВИЧ-инфекции с помощью генной терапии путем экспрессии в клетке заякоренных на мембране пептидов gp41. Для этого впервые доступны векторы, кодирующие слитый белок, который содержит производимый от gp41 ВИЧ-пептид и карбоксиконцевой, сцепленный через гибкий линкер трансмембранный якорь.

Патент RU 2324738C2 10.01.2008 описывает три генетические конструкции на основе векторной плазмиды pEGFP-N1, продуцирующие siPHK-ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа. Изобретение может использоваться в разработке более эффективных антиВИЧ-препаратов на основе интерферирующих РНК (siPHK), продуцируемых в клетках с помощью введенных векторных экспрессирующих конструкций.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств нового поколения, предназначенных для лечения ВИЧ-инфекции. Технический результат - создание предложенных конструкций и реализация ими указанного назначения. Предложенное изобретение направлено на создание более эффективных антиВИЧ-препаратов на основе РНК и белков, продуцируемых в клетках, с помощью введенных генетических конструкций, предложенных по изобретению. В настоящем изобретении также продемонстрировано, что комбинирование двух и более антивирусных агентов, перечисленных ниже, в одной генетической конструкции обеспечивает синергетический эффект.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении "молекула нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" означают полимерную форму нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотиды, либо рибонуклеотиды, либо их аналоги. Полинуклеотиды могут иметь трехмерную структуру и могут осуществлять любую функцию. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются ген, генный фрагмент, экзоны, интроны, открытая рамка считывания, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, космиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, нуклеиновокислотные зонды и праймеры.

Полинуклеотид обычно состоит из специфической последовательности из четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т) (а в случае если указанным полинуклеотидом является РНК, то вместо тимина (Т) присутствует урацил (U)). Таким образом, термин "полинуклеотидная последовательность" означает буквенное представление полинуклеотидной молекулы. Это буквенное представление может быть введено в базу данных компьютера, имеющего центральный процессор, и используется в биоинформатике, например в функциональной геномике и в поиске гомологии.

Термин "конструкция" означает любую молекулу, способную переносить последовательности нуклеиновой кислоты (например, невирусные векторы, частицы-носители, липосомы и вирусные векторы) в клетки-мишени. Термин "плазмидная конструкция" означает внехромосомный генетический элемент, способный к саморепликации в клетке-хозяине. Обычно термины "вектор", "конструкция", "экспрессирующий вектор" и "вектор для переноса генов" означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную регулировать экспрессию нужного гена и переносить генные последовательности в клетки-мишени. Таким образом, этот термин включает в себя клонирующие и экспрессирующие носители, а также вирусные векторы.

Вектор может содержать либо ДНК, либо РНК. Например, для получения вектора может быть использован либо ДНК-, либо РНК-вирус. На основе геномной РНК вируса может быть получена копия кДНК. И наоборот, фрагмент кДНК (или вирусной геномной ДНК) может быть транскрибирован in vitro с образованием РНК. Эти методики хорошо известны специалистам.

Термин "кодирующая последовательность" или последовательность, которая "кодирует" выбранный полипептид, означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo при ее нахождении под контролем соответствующих регуляторных последовательностей (или "регуляторных элементов"). Границы кодирующей последовательности определены старт-кодоном у 5' (амино)-конца и кодоном терминации трансляции у 3' (карбокси)-конца. Кодирующей последовательностью может быть, не ограничиваясь ими, кДНК, происходящая от вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномные ДНК-последовательности, происходящие от вирусной или прокариотической ДНК, и даже синтезированные ДНК-последовательности. Последовательность терминации транскрипции может быть локализована со стороны 3'-конца по отношению к кодирующей последовательности. Транскрипция и трансляция кодирующих последовательностей обычно регулируются "регуляторными элементами", включая, но не ограничиваясь ими, промоторы транскрипции, энхансерные элементы транскрипции, последовательности Шайна-Дальгарно, сигналы терминации транскрипции, последовательности полиаденилирования (локализованные со стороны 3'-конца по отношению к кодону терминации трансляции), последовательности для оптимизации инициации трансляции (локализованные со стороны 5'-конца по отношению к кодирующей последовательности) и последовательности терминации трансляции. Термин "элемент регуляции экспрессии генов" означает нуклеотидную последовательность, содержащую, как минимум, промотор. Такой элемент может, кроме того, содержать другие последовательности, необходимые для экспрессии кодирующих последовательностей, функционально присоединенных к промотору, или влияющие на такую экспрессию. Компоненты этих элементов необязательно должны быть смежными, то есть они могут быть разделены промежуточными последовательностями. Компоненты этих элементов могут влиять на экспрессию кодирующих последовательностей на уровне транскрипции, стабильности РНК, процессинга и/или трансляции РНК. Обычно такой элемент не содержит кодирующих последовательностей, с которыми они функционально связаны. В некоторых случаях элемент регуляции экспрессии гена может содержать природный ген либо, в основном, состоять из такого гена, кроме кодирующей последовательности данного гена.

Векторы для генной терапии ВИЧ

Главным требованием генной терапии является устойчивая экспрессия терапевтических генов, не вызывающая негативных клинических эффектов. Крайне желательно иметь вектор (последовательность, обеспечивающую встраивание ДНК последовательностей в геном клетки человека) с высоким титром, который способен стабильно интегрировать в клетки-мишени (включая делящиеся и неделящиеся клетки) и который не является патогенным и не вызывает иммунной реакции.

Ретровирусные векторные системы

Одной из первых систем для генотерапии был ретровирусный вектор, сконструированный на основе вируса мышиного лейкоза Moloney (MoMLV). Этот вектор обладает способностью инфицировать делящиеся клетки. ДНК-провирус MoMLV способен интегрироваться в геном делящихся клеток и передаваться по наследству вместе с клеточным геномом. В целом, клинические испытания с помощью векторных систем на основе вируса MoMLV составляют более 23% от клинических испытаний всех систем генотерапии различных заболеваний человека.

Векторы на основе спумовируса (foamy virus)

В настоящее время для генной терапии разработаны векторы на основе спумавируса. Спумавирусы - не патогенные, интегрирующие ретровирусы, обладающие свойствами, отличающими их от лентивирусов и гамма-ретровирусов. Такие векторы позволяют упаковывать и переносить большие фрагменты ДНК и эффективно трансдуцируют гемапоэтические клетки. Кроме того, преимуществом данного вектора для генной терапии ВИЧ-инфекции является низкая гомология нуклеотидной последовательности с вирусом иммунодефицита человека, благодаря которой резко понижается риск мобилизации вектора, обеспечивая безопасность терапии. Способность эффективно переносить антиВИЧ-трансгены, которые не могут быть перенесены с помощью векторов на основе ВИЧ-1, является ключевым преимуществом этого вектора. Показано, что на титр вектора на основе спумавируса не влияют кассеты трансгенов, которые значительно уменьшают титр лентивирусного вектора. Сайты интеграции данного вектора значительно отличаются от сайтов интеграции лентивирусов и гамма-ретровирусов, что может уменьшить риск возникновения лейкемии при использовании в генной терапии.

Невирусные системы доставки генов - вектор на основе транспозонов

Невирусные системы доставки генов (с помощью ДНК плазмид) являются наиболее простыми и безопасными, однако эффективность таких способов долгое время оставалась очень низкой. На данный момент существуют несколько экспрессионных векторов на основе транспозонов, некоторые из которых обладают эффективностью переноса ДНК, сравнимой с ретровирусными системами. Примером такого вектора может служить транспозонная система Спящей красавицы (Sleeping Beauty). Эта система состоит из искусственного транспозона и соответствующей транспозазы, фермента, который обладает функцией разрезания и встраивания фрагментов ДНК. Процесс переноса гена состоит из двух ступеней: на первой транспозаза распознает короткие инвертированные или прямые повторы в составе транспозона, а на второй вырезает и встраивает транспозон в геномную ДНК, в области ТА-повторов. В системе транспозонов Спящей красавицы могут быть использованы две независимые плазмиды, кодирующие транспозон и транспозазу, или оба компонента могут быть объединены на одной плазмиде. Усовершенствование фермента транспозазы привело к увеличению эффективности доставки генов с помощью этой системы. Показана возможность переноса генов в различные клетки млекопитающих, включая эмбриональные клетки мышей. Использование векторов транспозон/транспозаза представляет собой альтернативный способ доставки трансгена для генной терапии ВИЧ.

Лентивирусные векторы

На сегодняшний день лентивирусные векторы на основе ВИЧ-1 наиболее часто используются в генной терапии и молекулярно-биологических исследованиях, так как строение генома этого вируса детально изучено, что значительно облегчает проведение генно-инженерных манипуляций. Однако также сконструированы векторы на основе других лентивирусов: ВИЧ-2, ВИО (вирус иммунодефицита обезьян, SIV), вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), лентивирус артрита-энцефалита коз (CAEV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV), вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус болезни Джембрана (JDV). Такие векторы потенциально могут обладать определенными преимуществами, такими как повышенная безопасность, так как они не могут инфицировать человека, а значит, понижается вероятность возникновения репликационно-компетентных вирусных частиц. Кроме того, многие антиВИЧ-агенты действующие против вируса на этапе упаковки, значительно снижают титр вирусных частиц при использовании векторов на основе ВИЧ-1, но не влияют на титр вирусных частиц на основе других лентивирусов.

Вирусы подсемейства лентивирусов обладают уникальной способностью стабильно переносить генетический материал в неделящиеся клетки. В отличие от MuLV и других γ-ретровирусов лентивирусные векторы обычно встраиваются после точки начала транскрипции и, таким образом, не могут активировать онкогены. Широкомасштабный скрининг сайтов интеграции лентивирусов показал отсутствие злокачественных перерождений клеток. Разработка новых векторов на основе лентивирусов (в частности, ВИЧ) открывает широкие возможности в генной терапии ВИЧ. К РНК-вирусам подсемейства Lentivirus относят вирусы иммунодефицита человека типов 1 и 2 (т.е. ВИЧ-1 или ВИЧ-2, при этом ВИЧ-1 раньше называли с лимфаденопатией вирусом 3 (HTLV-III) и вирусы, ассоциированные с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) (ARV)), или другие вирусы, близкие ВИЧ-1 или ВИЧ-2, которые были идентифицированы и ассоциированы со СПИДом или СПИД-подобным заболеванием. Кроме того, к РНК-вирусам подсемейства Lentivirus относят вирус Висны/Маэди (например, инфицирующий овец), вирус иммунодефицита кошек (FIV), бычий лентивирус, вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV) и вирус артрита-энцефалита коз (CAEV).

Требования к вирусному вектору включают наличие промоторных элементов, размер генома, позволяющий упаковывать инородный генетический материал, и отсутствие вирулентных детерминант. Для уменьшения патогенности при производстве рекомбинантных вирусных векторов поступление структурных генов (кодирующих белки, образующие оболочку вируса, нуклеокапсид и т.д.) обеспечивается in trans путем интеграции в геном упаковочных клеток либо на плазмиде, вводимой в клетки совместно с вектором.

Репликация, интеграция и упаковка вирусных частиц требует наличия РНК (ДНК) областей, которые не кодируют белков. Большинство из таких цис-элементов необходимо включать в лентивирусный вектор (табл.1).

Таблица 1
Цис-элементы вектора
Название элемента	Функция в векторе
LTR (long terminal repeat)	Содержит последовательности, необходимые для обратной транскрипции и интеграции
PBS (primer binding site)	Необходим для инициации синтеза минус цепи ДНК
ψ	Необходим для упаковки векторной РНК
RRE (rev responsive element)	Взаимодействует с Rev белком, необходим для процессинга и транспорта РНК-вектора
PPT (polypurine tract)	Необходим для затравки синтеза плюс цепи
cPPT (central polypurine tract - flap)	Обеспечивает эффективную обратную транскрипцию и ядерный транспорт векторной ДНК

Структурные гены, которые поставляются in trans, включают три группы белков gag, pol и env (табл.2). Эти гены входят в состав нескольких отдельных упаковочных плазмид. Удаление таких генов из состава вектора не дает ему возможность самостоятельно реплицироваться и производить вирусные частицы, тем самым увеличивая безопасность применения таких векторов.

Таблица 2
Транс-элементы вектора
Название элемента	Функция
Gag/pol	Кодирует структурные белки капсида и нуклеокапсида и ферменты, необходимые для обратной транскрипции и интеграции
env	Определяет связывание и вход в клетку вирусной частицы
rev	Необходим для экспрессии несплайсированных и частично сплайсированных мРНК ВИЧ в клетке. Увеличивает титр вирусных частиц, содержащих вектор при упаковке в клеточной линии in vitro Дает преимущество при наличие RRE элемента в векторе

Векторы по настоящему изобретению также могут представлять собой самоинактивирующиеся лентивирусные векторы, которые придают конструкциям свойство самоинактивироваться и обеспечивают дополнительную безопасность при проведении терапии. При конструировании самоинактивирующихся векторов в 3'-LTR векторной ДНК (провирус) вносят делецию, затрагивающую энхансерно-промоторную область (она находится в US-районе LTR), т.е. конструируют 3'LTR с делецией в области U3. После заражения клетки мишени из-за особенностей обратной транскрипции образуется провирус, у которого оба LTR лишены промоторно-энхансерной области. Таким образом, после интеграции в геном клетки-мишени самоинактивирующийся вектор не способен к репликации, поэтому вероятность возникновения репликационно-компетентного вируса (RCV) в культуре трансдуцированных клеток ничтожно мала. Кроме того, исключается возможность инсерционного мутагенеза, так как отсутствие сильных энхансерно-промоторных участков на 3' конце вектора (которые находятся в делегированном участке LTR) предотвращает активацию собственных генов клетки, в том числе онкогенов.

Для получения векторных транскриптов в упаковочных клетках вместо вирусного промотора-энхансера в U5-районе LTR используется RSV/5'-LTR гибридный промотор. Это позволяет не вводить дополнительно плазмиду, кодирующую вирусный белок tat, и делает систему еще более безопасной.

Согласно настоящему изобретению в предложенных генетических конструкциях могут быть использованы любые известные векторы с последовательностью, обеспечивающей встраивание ДНК последовательностей в геном клетки человека, с высоким титром, которые способны стабильно интегрировать в клетки-мишени (включая делящиеся и неделящиеся клетки) и которые не является патогенным и не вызывают иммунной реакции. Однако использование лентивирусных векторов обеспечивает некоторые неожиданные преимущества.

Промоторы

Последовательности, кодирующие генетические антивирусные агенты, могут быть включены в векторную частицу под контролем соответствующих промоторов, известных для специалиста в данной области.

Термин "промотор" означает нуклеотидную последовательность, которая контролирует инициацию и скорость транскрипции полинуклеотида. Промотор содержит элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие факторы транскрипции, для инициации специфической транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты. Выражения «функционально расположенный», «функционально связанный», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» означают, что промотор находится в корректном функциональном расположении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии такой последовательности.

Промотор РНК полимеразы II человека

Транскрипция всех кодирующих последовательностей эукариот находится под контролем промотора РНК полимеразы II и приводит к образованию полностью зрелой мРНК, имеющей кэп на 5' конце и полиА на 3' конце последовательности мРНК. Промотор, в общем, содержит последовательность, которая определяет положение начала синтеза РНК. Лучшим известным примером такой последовательности является ТАТА-бокс, но в некоторых промоторах, лишенных ТАТА-бокса, таких как, например, промотор гена терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы млекопитающего и промотор поздних генов SV40, другой элемент, прилегающий к участку старта, способствует точному определению места инициации. Дополнительные промоторные элементы регулируют частоту инициации транскрипции. Обычно они локализованы в области на 30-110 н.п. выше участка старта, хотя некоторые промоторы, как было показано, содержат также функциональные элементы ниже участка старта. Для помещения кодирующей последовательности «под контроль промотора» располагают 5'-конец участка инициации транскрипции в транскрипционной рамке считывания «ниже» (т.е. в 3'-направлении) выбранного промотора.

Действие промотора может быть усилено «энхансером». Под энхансером подразумевают специфическую цис-действующую последовательность нуклеотидов, многократно усиливающую транскрипцию генов РНК-полимеразой II; например энхансер вируса SV40 (размер - 72 пары нуклеотидов) может усиливать транскрипцию бета-глобинового гена в 200 раз, даже находясь на значительном удалении от него и в любой ориентации по отношению к промотору. Способность ряда энхансеров взаимодействовать со специфическими белками в дифференцированных клетках обеспечивает тканеспецифичный характер экспрессии соответствующих генов.

Естественно, важно использовать промотор и/или энхансер, который эффективно направляет экспрессию сегмента ДНК в органелле, клеточном типе, ткани, органе или организме, выбранном для экспрессии. Специалистам в области молекулярной биологии, в основном, известно применение промоторов, энхансеров и комбинаций клеточных типов для экспрессии белка (см., например, Sambrook et al., 1989, включенный сюда в качестве ссылки). Используемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифичными, индуцируемыми и/или могут использоваться в условиях, подходящих для направления высокоуровневой экспрессии введенного сегмента ДНК. Промотор может быть гетерологичным или эндогенным.

Конститутивные промоторы

К конститутивным промоторам, т.е. промоторам, работающим во всех типах клеток не зависимо от условий, относятся промоторы генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes). К генам «домашнего хозяйства» относятся гены, обеспечивающие жизнедеятельность эукариотической клетки и функционирующие повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма. Они обеспечивают процесс гликолиза, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.п. Неограничивающими примерами таких промоторов являются промотор гена фактора элонгации EFα, гена фосфоглицераткиназы (PGK), гена β-актина, убиквитиновый промотор UbC, гистоновый промотор Н2В (ТН2В) и др.

Многие вирусные промоторы выполняют конститутивную функцию в эукариотических клетках. Эти промоторы включают: ранние и поздние промоторы SV40 (см. Bernoist and Chambon, Nature, 290:304 (1981)); длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Молонея и других ретровирусов (см. Weisset al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)); промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) (см. Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441 (1981)); самый ранний промотор цитомегаловируса (IE1) (см. Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13 (1989); промотор вируса саркомы Payca (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22:787 (1980)); главный поздний промотор аденовируса (Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82:3567 (1985)) и многие другие. Поэтому любые вышеуказанные конститутивные промоторы можно использовать для контроля транскрипции генной вставки.

Тканеспецифичные промоторы

Тканеспецифичными называются промоторы, которые инициируют транскрипцию гена только в клетках определенной ткани. Тканеспецифический характер экспрессии генов обеспечивается различными механизмами взаимодействия белковых факторов транскрипции с регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот. Отличительные черты тканеспецифических промоторов или элементов, а также анализы для характеристики их активности хорошо известны специалистам в данной области. Неограничивающие примеры генов под контролем таких промоторов охватывают человеческий ген LIMK2 (Nomoto et al., 1999), ген соматостатинового рецептора 2 (Kraus et al., 1998), ген связывающего ретиноевую кислоту белка придатков яичка мыши (Lareyre et al., 1999), человеческий CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), мышиный альфа-2-(XI)-коллаген (Tsumaki, et al., 1998), ген дофаминового рецептора D1A (Lee, et al., 1997), инсулиноподобный фактор роста II (Wu et al., 1997) и молекулу-1 адгезии тромбоцитов-эндотелиальных клеток человека (Almendro et al., 1996).

Ниже перечислены неограничивающие примеры тканеспецифичных элементов/промоторов РНК-полимеразы II, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения для регуляции экспрессии РНК: промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, гена Т-клеточного рецептора, гена β-интерферона, гена IL2, гена рецептора IL2, генов МНС класса II, гена α-фетопротеина, гена γ-глобина, гена β-глобина, генов, кодирующих α- и β-субъединицы гемоглобина человека, гена альбумина, гена коллагеназы, гена металлотионеина (MTII), гена эластазы I, гена c-HA-ras, гена инсулина и др.

Регулируемые промоторы

Регулируемые или индуцибельные промоторы позволяют включать и/или выключать транскрипцию гена. Активность таких промоторов зависит от введения дополнительных факторов, в норме отсутствующих в экспрессирующих клетках. Существует несколько систем обратимого регулирования экпрессии, которые позволяют включать и выключать работу гена. Наиболее используемой и изученной является тетрациклин зависимая система переключения, которая состоит из трех основных частей: молекулы тетрациклина Tet или его аналога, молекулы белка тетрациклинового репрессора TetR или активатора tTA и участка промотора (т.н. тетрациклинового оператора tetO), связывающего репрессор или активатор. Существуют два варианта: а) в системе Tet-On используется репрессор TetR, связывающийся с оператором и блокирующий транскрипцию; добавление терациклина приводит к удалению репрессора и включению экспрессии гена б) в системе Tet-OFF, используется активатор tTA, способствующий экспрессии в отсутствие тетрациклина и выключающий работу гена при добавлении тетрациклина. Аналог тетрациклина доксициклин лучше проникает через клеточную мембрану и обладает большим сродством с репрессором и активатором, поэтому чаще используется в качестве переключателя. Другими примерами регулируемых промоторов могут служить LacZ регулируемая система или экдизон регулируемая система. Единственным примером необратимой индукции (или репрессии) является система, базирующаяся на Cre-Lox рекомбинации бактериофага Р1. Использование Cre-Lox рекомбинации позволяет необратимо включить или выключить экспрессию интересующей последовательности в генной конструкции после введения ее в клетку.

Промоторы полимеразы III человека

Для экспрессии коротких РНК-последовательностей (в нашем случае рибозим, TAR, shRNA) удобно использовать промоторы для РНК полимеразы III. Промоторы для РНК-полимеразы III делятся на три типа, основываясь на композиции промоторных элементов и их положении относительно старта транскрипции (PAULE MR, WHITE RJ. Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic Acids Res 2000; 28(6): 1283-98). Промоторы 3-го типа для РНК-полимеразы III наиболее подходят для транскрипции коротких РНК-последовательностей, поскольку в природе они используются клеткой для наработки малых ядерных РНК-молекул. В отличие от промоторов 1-го и 2-го типа промоторы третьего типа полностью расположены выше транскрипционного старта и содержат 3 специфических промоторных элемента, необходимые для их функционирования: 1. ТАТА-последовательность в позиции -20 п.о., 2. PSE-последовательность проксимального элемента в позиции -50 п.н., 3. DSE-последовательность дистального элемента в позиции -240 п.н. (где +1 - первый транскрибируемый нуклеотид). Оба элемента DSE и PSE содержат энхансер и последовательность, связывающую транскрипционный фактор, которые абсолютно необходимы и делеция которых полностью элиминирует транскрипцию. Расстояние между этими элементами строго определено и критично для достижения максимальной скорости транскрипции. Характерной особенностью данных промоторов является четко определенный сайт инициации транскрипции и простой сигнал терминации, состоящий из 4-х или 5-ти последовательных тимидинов (SCHRAMM L et al. Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters. Genes Dev 2002; 16(20): 2593-620). Относительная простота и высокий уровень транскрипции (4*10⁵ транскриптов на клетку) делает их максимально удобными для использования в генетических конструкциях.

К промоторам 3-го типа для РНК-полимеразы III относятся промоторы генов H1, U6 и 7SK, которые обычно используются в экспериментах для экспрессии shRNA. Ген H1 кодирует РНК, которая является компонентом ядерной РНКазы Р и вовлечена в созревание тРНК. HI промотор человека является необыкновенно компактным - все элементы, необходимые для транскрипции, находятся в пределах 100 п.о. выше старта. РНК, кодируемая геном U6, играет центральную роль в процессинге РНК и является неотъемлимой частью сплайсосомы (BERGET SM, ROBBERSON BL. U1, U2, and U4/U6 small nuclear ribonucleoproteins are required for in vitro splicing but not polyadenylation. Cell 1986; 46(5): 691-6). Эксперименты in vivo и in vitro показывают, что U6 промотор намного активнее, чем H1. Однако по-аналогии с U1 РНК для U6 РНК предполагают наличие регуляторного механизма, который предотвращает избыточное накопление U6 РНК в клетке Noonberg SB, Scott GK, Benz CC. Evidence of posttranscriptional regulation ofU6 small nuclear RNA. J Biol Chem 1996; 271(18): 10477-81). Поэтому сверхэкспрессия shRNA, контролируемая U6 промотором, может приводить к уменьшению количества эндогенной U6 РНК и изменению фенотипа клетки. Все более популярен становится промотор 7SK как более сильный по сравнению с U6, но не обладающий механизмом саморегуляции. 7SK РНК эволюционно консервативна и присутствует в клетке в большом количестве. Существуют искусственно созданные регулируемые промоторы РНК-полимеразы III, основанные на описанных выше тетрациклиновой и Cre-Lox системе.

В общем, промоторы и энхансеры, которые контролируют транскрипцию в эукариотических клетках, составлены из множественных генетических элементов. Клеточный аппарат способен объединить и интегрировать регуляторную информацию, которую несет каждый элемент, что позволяет образовывать комплексные профили транскрипционной регуляции. Активация или репрессия промоторных и энхансерных элементов может осуществляться путем контакта данных элементов с подходящими белковыми активаторами или репрессорами транскрипции.

В контексте данного изобретения может использоваться любая комбинация элементов промотор/энхансер (согласно базе данных эукариотических промоторов EPDB), приводящая к эффективной инициации и поддержанию транскрипции последовательности в гемапоэтических клетках. Для экспрессии трансгенов могут быть использованы регулируемые промоторы, позволяющие включать/выключать транскрипцию в процессе производства вирусных частиц и/или в процессе терапии ВИЧ-инфекции. Специалист на основании данного описания и уровня техники способен подобрать соответствующий промотор для каждого из перечисленных ниже антивирусных агентов или их комбинации.

Генетические антивирусные агенты

Генетические антивирусные конструкции, которые используются в генной терапии, можно разделить на 2 типа: агенты, взаимодействующие с вирусными элементами после проникновения в клетку и начала репликации, и агенты, предотвращающие проникновение вируса в клетку и/или интеграцию в геном, и таким образом придающие клетке-хозяину резистентность (устойчивость) к инфицированию.

Согласно настоящему изобретению предлагаются генетические конструкции, включающие по меньшей мере один из перечисленных ниже антивирусных агентов.

Короткие интерферирующие РНК, направленные против гена рецептора человека CCR5 (CCR5 si)

В качестве одного из агентов, придающих клетке устойчивость к ВИЧ, авторами были выбраны короткие интерферирующие РНК, направленные против гена хемокинового рецептора CCR5, задействованного в процессе проникновения ВИЧ в клетку.

РНК-интерференция - регуляторный механизм, присутствующий в большинстве эукариотических клеток, который использует двухцепочечные РНК-молекулы как сигнал для регуляции активности генов, гомологичных этим РНК. В клетках млекопитающих эндогенный механизм РНК-интерференции запускается так называемыми молекулами микроРНК. Последовательности генов микроРНК образуют шпилечную структуру (первичная микроРНК), которая распознается и процессируется клеточным ферментом Drosha в ядре, после чего образовавшиеся короткие РНК-шпильки (предшественники микроРНК) экспортируются в цитоплазму. В цитоплазме специальный белковый комплекс (RISC) удаляет петлю шпильки, образуя короткие РНК-дуплексы. Эти дуплексы, известные как короткие интерферирующие РНК - киРНК (short interfering RNAs, siRNAs), представляют собой двухцепочечные РНК размером 21-22 пар нуклеотидов; на 3' концах обеих цепей которых присутствуют два неспаренных нуклеотида. киРНК широко используются для ингибирования экспрессии генов при работе с клеточными культурами in vitro. Дальнейшее процессирование РНК-дуплекса приводит к выбору эффекторной короткой (~21 п.н.) цепи РНК, которая направляется к гомологичной мРНК и гибридизуется с комплементарным участком мРНК-мишени. В случае 100% гомологии связывание приводит к расщеплению мРНК и последующей полной деградации мРНК.

Запустить внутриклеточный механизм РНК-интерференции, направленный на подавление вирусных или клеточных генов, можно введя в клетку трансгены, экспрессирующие короткие шпилечные РНК (short hairpin RNA, shRNA), которые образуют во вторичной структуре плотные шпильки и являются аналогами предшественников микроРНК. Так же как и микроРНК-предшественники, они экспортируются в цитоплазму и далее процессируются, используя механизм РНК интерференции. Если такая шпилечная РНК содержит последовательность, комплементарную последовательности гена CCR5, это приведет к деградации мРНК и отсутствию экспрессии рецептора. Короткие РНК, образующие шпильки, вводят в клетки при помощи вектора, использующего промотор РНК-полимеразы III для обеспечения конститутивной или индуцибельной экспрессии.

Последовательность, комплементарную последовательности гена CCR5, также можно встроить в тело эндогенной микроРНК; такая искусственно модифицированная первичная микроРНК будет процессирована и приведет к расщеплению мРНК соответствующего гена. Экспрессия микроРНК регулируется промотором РНК-полимеразы II

Интегрированный вектор, содержащий shRNA или микроРНК, передается дочерним клеткам и обеспечивает наследуемое выключение гена (PADDISON P et al, (2002). "Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells". Genes Dev. 16 (8): 948-58. DOI: 10.1101/gad.981002. PMID 11959843).

РНК-интерференция является очень эффективным механизмом подавления экспрессии генов, с ее помощью можно достигнуть 99% ингибирования, то есть практически выключить работу гена.

Основная проблема, возникающая при использовании РНК-интерферирующих молекул, направленных против генов ВИЧ, кроется в самой природе вируса, приводящей к возникновению устойчивых мутантных штаммов. Для успешного применения РНК-интерференции необходима строгая комплементарность siRNA и мРНК-мишени. Возникновение единственной замены нуклеотида в РНК ВИЧ, соответствующего 9-11 нуклеотиду siRNA, приводит к полной несостоятельности механизма РНК-интерференции и отсутствию подавления репликации. В клеточной культуре возникновение устойчивых вирусных мутантов, несущих замену единственного нуклеотида, как правило, возникает на 25 день. siRNA, направленные против высоко консервативных участков, лишь отчасти улучшают ситуацию, требуя более длительного времени для появления мутантов. Наиболее перспективный подход состоит в использовании siRNA, направленных против клеточных генов, белковые продукты которых взаимодействуют с ВИЧ, и которые отличаются высокой консервативностью.

В заявках WO2004065549 А2 (UNIV FLORIDA) 05.08.2004 и WO03022052 А1 (CALIFORNIA INST OF TECHN) 20.03.2003 раскрываются лентивирусные системы доставки siRNA в клетки для лечения рака.

В соответствии с настоящим изобретением предложены конструкции, содержащие последовательность, кодирующую siRNA, направленную против клеточного гена - гена хемокинового рецептора CCR5. CCR5 - корецептор, необходимый для проникновения в клетку R5 тропных вирусов. Естественные мутации корецепторов широко встречаются в популяции как ВИЧ-инфицированных, так и неинфицированных людей. У некоторых людей такие мутации приводят к полному отсутствию рецепторной молекулы, что делает таких людей устойчивыми к инфицированию ВИЧ. Примечательно, что отсутствие CCR5 рецептора у таких людей не приводит к нарушениям фенотипа.

Таким образом, еще одной задачей настоящего изобретения является создание конструкций, кодирующих CCR5 siRNA, которые используются для придания клетке-мишени устойчивости к инфицированию ВИЧ.

Посл