Способ структурной характеристики рекомбинантного поликлонального белка или поликлональной клеточной линии

Способ структурной характеристики рекомбинантного поликлонального белка или поликлональной клеточной линии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу структурной характеристики рекомбинантного поликлонального белка или поликлональной клеточной линии, продуцирующей такой белок, для подтверждения состава различных партий конечных продуктов, а также стабильности композиции в процессе одного из производственных циклов. В частности, настоящее изобретение относится к способу характеристики рекомбинантного поликлонального антитела.

Предшествующий уровень техники

Уже давно известно, что введение антител в профилактических или терапевтических целях (так называемая пассивная иммунизация) может усиливать способность иммунной системы организма элиминировать инфекционные агенты. Такие терапевтические антитела исторически получали из плазмы человека (а поэтому такая композиция антитела была названа “иммуноглобулином” или “гамма-глобулином”). Для получения этих антител кровь иммунизованных людей-доноров объединяли и полученную иммуноглобулиновую фракцию экстрагировали и очищали. Специфичностью к данному конкретному антигену обладает только одна фракция иммуноглобулина. Терапевтическое применение иммуноглобулина имеет определенные трудности в связи с некоторыми ограничениями, такими как ограниченное число доноров, дорогостоящая процедура получения иммуноглобулина, риск передачи инфекционного загрязнения от доноров, неизбежное отличие одной партии от другой, а также сложность режимов введения.

Недавно были получены рекомбинантные моноклональные антитела, которые являются альтернативой продуктам иммуноглобулина. Однако они направлены только против одной мишени, а поэтому не могут быть эффективными против комплексных или динамичных мишеней, таких как инфекционные агенты. Для решения этой проблемы существует несколько примеров смешивания моноклональных антител (например, Novakowski et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99, 11346-11350 и патент США № 5126130).

Недавно была разработана технология рекомбинантного продуцирования высокоспецифических поликлональных антител, подходящих для профилактического и терапевтического введения (WO 2004/061104). Рекомбинантное поликлональное антитело (rpAb) может быть выделено из промышленного биореактора в виде одного препарата без разделения, обработки, очистки или характеристики отдельных членов, составляющих рекомбинантный поликлональный белок. Однако такой способ получения требует проведения процедуры подтверждения идентичности и соответствующего состава полученной сложной смеси молекул антител в течение всего производственного цикла.

Кроме того, для получения разрешения Национальных и Наднациональных органов на проведение исследований по разработке и терапевтическому применению лекарственного средства поликлональное антитело, полученное рекомбинантным методом, должно быть, до некоторой степени, охарактеризовано. Поскольку технология получения рекомбинантного поликлонального антитела представляет собой абсолютно новую концепцию, то никогда ранее не были предприняты попытки охарактеризовать образец, содержащий множество различных, но в высокой степени гомологичных белков с точки зрения относительного соотношения отдельных белков в образце. Так, например, разрешение на применение выделенного из крови иммуноглобулина обычно получают только после получения данных о неклинической и клинической эффективности продукта, а в большинстве случаев - после предварительного получения данных о его безопасности, а также после проведения анализа на химическую структуру неочищенного продукта, оценки технологических данных и контрольных (СМС) параметров, таких как чистота, титр связывания и отсутствие посторонних агентов. Разумеется, что такой упрощенный подход не приемлем для белков, получаемых рекомбинантным способом. Поэтому Регуляторные органы постановили, что каждое антитело-компонент, входящее в состав смеси нескольких моноклональных антител, должно быть охарактеризовано отдельно в соответствии с известными методами химической характеристики в комбинации с биологическими анализами. Однако пока еще не существует технически осуществимого или подходящего способа определения истинного состава поликлональной композиции, состоящей из более чем 10, 20 или даже большего числа различных антител.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу структурной характеристики, проводимой для определения состава смеси различных гомологичных белков, такой как рекомбинантный поликлональный белок, а в частности рекомбинантное поликлональное антитело, продуцируемое поликлональной клеточной линией.

Описание изобретения

Необходимым требованием для промышленного получения рекомбинантного поликлонального белка для профилактического и терапевтического применения является сохранение его клонального разнообразия в процессе экспрессии. Поэтому очень важным фактором является возможность проведения мониторинга и определения клонального разнообразия поликлональной клеточной линии, продуцирующей поликлональное антитело, а также возможность получения относительного воспроизведения отдельных белков в поликлональном белке в любой нужный момент времени и в любом релевантном образце, что позволило бы проводить анализ на стабильность экспрессионной системы в процессе производства одной партии, а также проводить оценку различий между партиями конечного продукта.

Композиции гомологичных белков, такие как рекомбинантное поликлональное антитело или рекомбинантный поликлональный Т-клеточный рецептор (ТсR), состоят из различных белков с очень похожими физико-химическим свойствами. Это является преимуществом для очистки поликлонального белка, получаемого рекомбинантным способом, поскольку такая очистка может быть осуществлена тем же способом, как и в случае одного белка, но без потери разнообразия в составе поликлонального белка в процессе его очистки. Однако такое сходство физико-химических свойств связано с определенными трудностями, возникающими при характеристике относительного распределения отдельных членов поликлонального белка, поскольку такое сходство затрудняет дифференциацию одного конкретного члена этой композиции от другого.

Более конкретно, при получении рекомбинантного поликлонального белка его исходный состав является известным, поскольку последовательности, кодирующие этот поликлональный белок, были выделены, скринированы и секвенированы для получения поликлональной клеточной линии-продуцента, используемой для продукции рекомбинантного поликлонального белка. Описание получения такой клеточной линии можно найти в заявке WO 2004/061104, которая приведена в настоящей заявке в качестве ссылки. За редким исключением, могут возникать ситуации, когда для получения рекомбинантного поликлонального антитела непосредственно используется нескринированная или неотобранная библиотека, например, полученная у выздоравливающего пациента.

Для гарантии того, что после культивирования и очистки полученный продукт (рекомбинантный поликлональный белок) по своему разнообразию будет совпадать с исходным продуктом (библиотекой кодирующих последовательностей), необходимо получить информацию об относительном соотношении отдельных членов поликлонального белка и/или их кодирующих последовательностей в поликлональной клеточной линии-продуценте. Настоящее изобретение относится к способу структурной характеристики на основе генетических анализов, а также к способам характеристики белка, которые позволяют получать информацию о разнообразии поликлональных клеточных линий и поликлональных белков.

Определения

Термин “антиидиотипическое антитело” означает полноразмерное антитело или его фрагмент (например, Fv, scFv, Fab, Fab' или F(ab)₂), которые специфически связываются с вариабельной частью отдельного члена поликлонального белка. Предпочтительно антиидиотипическое антитело по изобретению специфически связывается с вариабельной частью отдельного члена поликлонального антитела или поликлонального TcR. Такое антиидиотипическое антитело предпочтительно обладает специфичностью к антигенспецифической части отдельного члена поликлонального антитела или поликлонального Т-клеточного рецептора, т.е. так называемой V-области. Однако оно может быть специфичным к определенной субпопуляции отдельных членов, например к специфическому семейству генов VН, присутствующих в этой смеси.

Термин “антиидиотипический пептид” означает специфический пептидный лиганд, который может специфически связываться и тем самым идентифицировать отдельный член белка в смеси гомологичных белков. При этом предпочтительно, чтобы антиидиотипический пептид по изобретению специфически связывался с отдельным членом поликлонального антитела или поликлональным ТсR. Антиидиотипические пептиды по изобретению предпочтительно направлены против антигенспецифической части последовательности отдельного антитела или отдельного Т-клеточного рецептора. Один такой антиидиотипический пептид может также обладать специфичностью к определенной субпопуляции отдельных членов.

Термин ““групповое” N-концевое секвенирование” означает N-концевое секвенирование белка, присутствующего в образце, содержащем ряд вариантов гомологичных молекул белка, например поликлонального белка. Такое групповое секвенирование позволяет получить информацию о последовательностях всех отличающихся белков, одновременно присутствующих в данном образце. В положениях, где отдельные члены в образце отличаются по своему аминокислотному составу, они могут быть количественно оценены, и эти различные количества отдельных аминокислот в вариабельных положениях могут давать информацию о субпопуляции белка, имеющего конкретные модификации. Если белки, подвергаемые N-концевому секвенированию, содержат более чем одну субъединицу, то для снижения их вариабельности предпочтительно, чтобы перед секвенированием они были выделены; так, например, если указанный образец представляет собой поликлональное антитело, то перед секвенированием его тяжелые цепи могут быть отделены от легких цепей.

Термины “клональное разнообразие” или “поликлональность” означают вариабельность или разнообразие поликлональных белков, последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих эти белки, или поликлональных клеточных линий, продуцирующих указанные белки. Такая вариабельность характеризуется различиями в аминокислотных последовательностях или в последовательностях нуклеиновой кислоты между отдельными членами поликлональных белков или библиотеки кодирующих последовательностей. Для поликлональных клеточных линий клональное разнообразие может быть оценено по вариабельности последовательностей нуклеиновой кислоты, присутствующих в клеточной линии, например по их односайтовой интеграции в геном отдельных клеток. Однако такое клональное разнообразие может быть оценено как вариабельность аминокислотных последовательностей, представленных на поверхности клеток в данной клеточной линии.

Термин “эпитоп” означает часть антигенной молекулы, с которой связывается Т-клеточный рецептор или антитело. Антиген или антигенная молекула, по существу, представляет одновременно несколько или даже множество эпитопов.

Термин “иммуноглобулин” обычно используется как общее название смеси антител, обнаруживаемых в крови или сыворотке. Следовательно, сывороточное поликлональное антитело часто называют иммуноглобулином или гамма-глобулином. Однако термин “иммуноглобулин” может также использоваться для обозначения смеси антител, происходящей от других источников, например рекомбинантного иммуноглобулина.

Используемый здесь термин “отдельный клон” означает изогенную популяцию клеток, экспрессирующих конкретный белок, например моноклональное антитело. Такие отдельные клоны могут быть, например, получены путем трансфекции клетки хозяина нужной нуклеиновой кислотой, и после отбора на положительные трансфектанты один отдельный клон может быть размножен либо могут быть собраны и размножены несколько отдельных клонов. Поликлональная клеточная линия может быть получена путем смешивания отдельных клонов, экспрессирующих различные отдельные члены поликлонального белка.

Термины “отдельный член” или “отличающийся член” означают молекулу белка белковой композиции, содержащей различные, но гомологичные друг другу молекулы, где отдельная молекула белка гомологична другим молекулами данной композиции, а также содержащей один или несколько фрагментов полипептидной последовательности, которые характеризуются тем, что аминокислотные последовательности отдельных членов поликлонального белка отличаются друг от друга, и которые также называются вариабельными областями. Так, например, в поликлональном антителе, состоящем из Ab1-Ab50, все белки с последовательностью Ab1 будут рассматриваться как отдельный член поликлонального антитела и белок Ab1 может, например, отличаться от белка Ab2 последовательностью в области CDR3. Субпопуляция отдельных членов может, например, состоять из антител, таких как Ab1, Ab12 и Ab33.

Термин “поликлональное антитело” означает композицию из различных молекул антител, способных связываться или реагировать с несколькими различными конкретными антигенными детерминантами на одних и тех же или других антигенах. Вариабельность поликлонального антитела наблюдается в так называемых вариабельных областях отдельных антител, составляющих поликлональное антитело, а в частности в комплементарность-определяющих областях (CDR1), CDR2 и CDR3.

Термины “поликлональная клеточная линия-продуцент”, “банк поликлональных клеток-хозяев, (рМСВ)” и “банк поликлональных рабочих клеток, (рWDC)” являются взаимозаменяемыми и относятся к популяции белок-экспрессирующих клеток, которые трансфецируют библиотекой представляющих интерес вариантов последовательностей нуклеиновой кислоты. Предпочтительно отдельные клетки, которые все вместе составляют рекомбинантную поликлональную клеточную линию-продуцент, несут только одну копию отдельной представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей один член представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, при этом каждая копия интегрируется в один и тот же сайт генома каждой клетки. Клетками, которые могут составлять такую клеточную линию-продуцент, могут быть, например, клетки бактерий, грибов, эукариотические клетки, такие как дрожжи, клетки насекомых или клетки млекопитающих, а в частности иммортализованные клеточные линии млекопитающих, такие как клетки СНО, клетки СОS, клетки ВНК, миеломные клетки (например, клетки Sp2/0, NS0), клетки NIH-3Т3, клетки YВ2/0 и иммортализованные человеческие клетки, такие как клетки НеLa, клетки НЕК 293 или клетки РЕR.С6.

Используемый здесь термин “поликлональный белок” означает белковую композицию, содержащую различные, но гомологичные молекулы белка, а предпочтительно молекулы, выбранные из суперсемейства иммуноглобулинов. Более предпочтительными являются гомологичные молекулы белка, которые представляют собой антитела или Т-клеточные рецепторы (ТсR). Таким образом, каждая молекула белка гомологична другим молекулам такой композиции, а также содержит один или несколько фрагментов вариабельной полипептидной последовательности, которые характеризуются тем, что аминокислотные последовательности отдельных членов поликлонального белка отличаются друг от друга, и которые также называются отдельными вариабельными членами поликлонального белка. Известными примерами таких поликлональных белков являются антитела, Т-клеточные рецепторы и В-клеточные рецепторы. Поликлональный белок может состоять из определенной субпопуляции молекул белка и определяется их общими признаками, такими как общая активность связывания с нужной мишенью, например, в том случае, когда поликлональное антитело направлено против нужного антигена-мишени. Рекомбинантный поликлональный белок обычно состоит из определенной субпопуляции молекул, где последовательность каждого такого члена является хорошо известной. Только в редких случаях рекомбинантный поликлональный белок может иметь сходство с сывороточным иммуноглобулином в том смысле, что этот рекомбинантный поликлональный белок также содержит значительное количество белков, не специфичных к данной мишени.

Термин “поликлональный Т-клеточный рецептор (ТсR)” означает композицию различных молекул ТсR, способных связываться или реагировать с несколькими различными специфическими антигенными детерминантами, происходящими от одних и тех же или от различных антигенов. Вариабельность поликлонального ТсR наблюдается в так называемых вариабельных областях отдельных молекул ТсR, составляющих поликлональный ТсR, а в частности в областях CDR1, CDR2, CDR3 и CDR4. Молекулами ТсR по изобретению являются сконструированные растворимые димеры, имеющие альфа-бета-цепи или гамма-дельта-цепи. Такие сконструированные ТсR описаны, например, в литературе (Willcox, B.E., et al., 1999, Protein Sci. 8, 2418-2423).

Термин “белок” означает любую аминокислотную цепь независимо от ее длины или посттрансляционных модификаций. Белки могут существовать в виде мономеров или мультимеров, содержащих две или более полипептидных цепей объединенных друг с другом, а также в виде их фрагментов, полипептидов, олигопептидов или пептидов.

Термин “белок-индикатор” означает отдельный компонент поликлонального белка, присутствие которого может быть детектировано в процессе продуцирования поликлонального белка или в различных партиях. Постоянное присутствие белка-индикатора в серии родственных образцов отражает стабильность экспрессии поликлонального белка в различных партиях или в течение одного производственного цикла. Кроме того, присутствие этого белка указывает на сохранение разнообразия в процессе последующей обработки, такой как очистка рекомбинантно продуцируемого поликлонального белка.

Термин “уникальные пептиды-маркеры” означает ряд пептидов, происходящих от вариабельной области отдельных компонентов поликлонального белка. Такие пептиды предпочтительно получают путем обработки протеазой или другими методами фрагментации белков, и пептиды, которые могут быть однозначно определены как один отдельный компонент поликлонального белка, называют уникальными пептидами-маркерами.

Описание графического материала

Фиг.1: Хроматограммы, полученные посредством катионообменной хроматографии, композиции рекомбинантного поликлонального антитела против RhD (анти-RhD rpAb), выделенного из аликвот 3948 и 3949 после культивирования в течение 9 недель. Нижняя хроматограмма соответствует аликвоте 3949, а верхняя хроматограмма соответствует аликвоте 3948. Ось Y верхней хроматограммы смещена для отделения ее от нижней хроматограммы. Пики А-J относятся к антителам, отличающимся по суммарному заряду, и отдельные антитела имеют различные заряды.

Фиг.2: Фотография геля, иллюстрирующая HinfI-анализ на RFLP ОТ-ПЦР-продукта, полученного из аликвот 3948+ и 3949+ (FCW065) поликлональной клеточной линии, продуцирующей анти-RhD rpAb, после ее культивирования в течение 11 недель. Идентифицированы полосы, которые могут быть приписаны специфическим клонам.

Фиг.3: Т-RFLP-профили легких цепей антитела против резус-фактора D, происходящих от поликлональной клеточной культуры, экспрессирующей анти-RhD rpAb, состоящее из восьми различных антител против резус-фактора D. Стрелки указывают на пики, которым приписаны восемь различных клонов антител против резус-фактора D.

Фиг.4: Т-RFLP-профили, полученные в данный момент времени для вариабельных областей тяжелых цепей антитела против резус-фактора D, происходящих от поликлональной клеточной культуры, экспрессирующей анти-RhD rpAb, состоящее из двадцати пяти различных антител против резус-фактора D. Стрелки указывают на пики, которым приписаны двадцать пять различных клонов антител против резус-фактора D.

Фиг.5: Распределение кДНК, оцениваемое по Т-RFLP-профилям последовательностей, кодирующих тяжелые цепи восьми различных антител против резус-фактора D и происходящих от поликлональной клеточной культуры, культивированной в течение пяти недель.

Фиг.6: Показано относительное содержание (%) анти-RhD rpAb, состоящего из восьми различных антител, проанализированных с использованием катионообменной хроматографии. Интегрированные хроматографические пики были приписаны отдельным антителам исходя из их времени удерживания, а профили пиков, полученных от отдельных антител, были проанализированы отдельно с использованием катионообменной хроматографии в идентичных условиях.

Фиг.7: Катионообменная хроматограмма анти-RhD rpAb, состоящего из двадцати пяти отдельных компонентов, для образца, полученного после культивирования в течение 4 недель. Пики АС1-25 относятся к антителам, отличающимся по суммарному заряду, и отдельные антитела имеют различные заряды.

Фиг.8: Профили элюирования при катионообменной хроматографии рекомбинантного поликлонального антитела против RhD, состоящего из десяти отдельных членов. Буквами показаны пики, подвергнутые ОТ-ВЭЖХ, проводимой по второму параметру.

Фиг.9: Показан профиль элюирования фракции В5, указанной на фиг.8, который был получен во время ОТ-ВЭЖХ.

Фиг.10: Проиллюстрирован композиционный 2-мерный (2D) ЖХ-анализ рекомбинантного поликлонального антитела против RhD, состоящего из десяти отдельных членов, визуализированных на карте белка с указанными цветовыми кодами (представленными в серой шкале).

Фиг.11: Показан профиль элюирования, полученный во время проведения катионообменной хроматографии Asp-N-гидролизата, очищенного с помощью жидкой хроматографии (ЖХ) из рекомбинантного поликлонального анти-RhD антитела, состоящего из восьми отдельных членов. Жирными горизонтальными линиями показаны фракции, подвергнутые анализу MALDI-TOF для идентификации маркерных пептидов.

Фиг.12: Показаны перекрывающиеся хроматограммы OD₂₈₀-ИОХ, полученные для анти-RhD rpAb, состоящего из двадцати пяти отдельных членов, при этом ELISA-данные были получены из трех отдельных ELISA-анализов с использованием антиидиотипических пептидов РЕР162, РЕР202 и РЕР305. ELISA-анализы проводили для каждой фракции, полученной с помощью ионообменной хроматографии. ELISA-данные нормализовали по % от общего OD для того, чтобы эти три ELISA-анализа, проводимые с использованием РЕР162, РЕР202 и РЕР305 соответственно, можно было сравнивать друг с другом.

Фиг.13: Показано распределение трех антител-индикаторов против RhD162, 202 и 305 в различные периоды времени культивирования в процессе ферментации. G8 соответствует дню 8 после инокуляции содержимого биореактора.

Фиг.14: FACS-данные для трех клеточных линий, окрашенных тетрамерами РЕР202. (А) - РЕР202-негативная клеточная линия RhD162. (В) - клеточная линия RhD202, (С) - 50%-ная смесь клеточных линий RhD162 и RhD202 (соответствующая смеси (а) в эксперименте). На первой панели А, В и С представлены точечные графики FSC-SSC, где R1 представляет дискриминационное окно для живых и здоровых клеток, отобранных по размеру (FSC) и гранулярности (SSC). Гистограмма в середине панели иллюстрирует интенсивность флуоресценции клеток. Дискриминационное окно R6 охватывает окружающие клетки, окрашенные тетрамером. На последней панели приводится процент клеток в R6, используемой в вычислениях.

Фиг.15: Профили хроматограмм, записанных во время катионообменной хроматографии для образцов на различных стадиях во время последующей обработки образца анти-RhD rpAb, содержащего 25 отдельных членов, представленных материалом, собранным после элюирования с захватом (А), на сефадексе G-25 (В), DEAE-сефарозе (С) и Hypercel MEP (D).

Фиг.16: ИОХ-профили для трех репрезентативных моноклональных анти-RhD антител, представляющие три различных профиля распределения заряда. (А) - гомогенный профиль, (В) профиль с “3 пиками”, (С) комплексный профиль.

Фиг.17: ИОХ-анализ RhD189 и варианта RhD189E с модифицированным остатком в положении Glu.

Фиг.18: Активность связывания варианта RhD189E, модифицированного Glu и его природного аналога RhD189. Связывание антител с RhD-позитивными эритроцитами определяли с помощью FACS-анализа, а средняя интенсивность флуоресценции (MFI) представлена в зависимости от концентрации антитела.

Подробное описание изобретения

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу структурной характеристики для получения информации об относительном количестве отдельных членов в образцах, содержащих (i) различные гомологичные белки, имеющие различные вариабельные области, или (ii) клеточные линии, продуцирующие такие белки. Такой способ характеристики может быть использован для оценки различных аспектов во время продукции или очистки или во время длительного хранения композиции, содержащей различные гомологичные белки. Предпочтительно указанный способ характеристики по изобретению используется для осуществления одной из нижеследующих целей: (i) для оценки относительного представления отдельных членов или некоторых из отдельных членов друг другу в одном образце, (ii) для оценки относительного количества одного или нескольких отдельных членов в различных образцах в целях определения состава различных партий и (iii) для оценки фактического содержания одного или нескольких отдельных членов. При этом может быть проведено сравнение, но необязательно, с библиотекой векторов, обычно используемых для продукции поликлональной клеточной линии-продуцента. Указанный способ характеристики может быть, в частности, использован для мониторинга клонального разнообразия поликлональной клеточной линии и/или для воспроизведения отдельных белков в поликлональном белке, продуцируемом такой клеточной линией. Может быть проведен мониторинг стабильности композиции различных партий в процессе отдельных производственных циклов и состава продукта в этих партиях. Альтернативно процедуры такого способа могут быть применены для очистки композиций различных смесей гомологичных белков, включая поликлональный белок или смесь моноклональных антител, например для оценки продолжительности сохранения стабильности отдельных членов в такой композиции.

В одном из вариантов настоящее изобретение относится к способу характеристики образцов, содержащих различные гомологичные белки, имеющие различные вариабельные области, или клетки, продуцирующие такие белки для получения данных об относительном содержании или присутствии отдельных членов указанного белка или их кодирующих последовательностей, где указанный способ включает анализ аликвот указанных образцов одним или несколькими методами характеристики белков и/или одним или несколькими методами генетического анализа белок-кодирующих последовательностей.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ структурной характеристики состоит из ряда аналитических методов, выбранных из способов характеристики, а также генетических анализов. Таким образом, указанный способ структурной характеристики может состоять из любого числа отдельных вариантов, описанных в нижеследующих разделах. При этом может оказаться достаточным получение данных для образца путем проведения лишь одного из аналитических методов, описанных в указанных вариантах. Однако для разработки способа характеристики предпочтительно получить данные путем проведения по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 этих аналитических методов с последующим объединением отдельных вариантов, представленных ниже. Комбинация нескольких аналитических методов позволяет получать серию, в основном, описательных данных об относительном или абсолютном составе поликлональной смеси. Данные, полученные этими методами, могут иметь количественный, а также качественный характер, и при их объединении они дают полную характеристику анализируемых образцов.

В предпочтительных вариантах изобретения одним из аналитических методов является метод характеристики белка, а другим аналитическим методом является генетический анализ.

Термин “генетические анализы” означает такие методы, как анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), концевой RFLP (Т-RFLP), анализ микромассивов, количественная ПЦР, такая как ПЦР, осуществляемая в реальном времени, и секвенирование нуклеиновой кислоты.

Термин “способы характеристики белка” означает способы, обычно используемые в области протеомики для характеристики неизвестных белков, такие как (i) хроматографические анализы, которые позволяют разделять белки по их физико-химическим свойствам, (ii) анализ протеолитического расщепления гомологичных белков, (iii) “групповое” N-концевое секвенирование и (iv) анализ с использованием специфических детекторных молекул для гомологичных белков.

В соответствии с настоящим изобретением была разработана дополнительная концепция, которая может быть применена в комбинации с описанными выше аналитическими методами для характеристики комплексного пула гомологичных белков. Такая концепция основана на отборе числа белков-индикаторов, присутствующих в данном пуле гомологичных белков (например, поликлонального антитела или поликлонального ТсR) или на поверхности пула клеток, продуцирующих указанные гомологичные белки (например, поликлональной клеточной линии-продуцента). Белки-индикаторы подвергают количественной и качественной характеристике для подтверждения того, что эта субполуляция белков присутствует в соответствующем количестве либо в супернатанте поликлональной клеточной культуры, либо на клеточной поверхности в процессе продуцирования этих белков. Белки-индикаторы могут быть, например, проанализированы с использованием детекторных молекул, которые являются специфичными к отдельным членам гомологичных белков, например, таких как антиидиотипические молекулы. Концепция белка-индикатора может быть также применена для оценки постоянства состава различных партий клеточных культур. Концепция белка-индикатора может также распространяться на уникальные пептиды, происходящие от поликлонального белка в результате его обработки протеазой, где указанные белки-индикаторы предпочтительно содержат часть CDR в том случае, если указанным поликлональным белком является поликлональное антитело или ТсR. В анализах, осуществляемых на генетическом уровне, может быть также использован принцип белков-индикаторов, основанный на уникальных последовательностях нуклеиновой кислоты, выделенных из отдельных членов библиотеки, кодирующей поликлональный белок. В частности, последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие областям CDR антител или ТсR, могут быть отобраны в качестве последовательностей индикаторной нуклеиновой кислоты, а наиболее предпочтительной областью является область CDR3. В каждом отдельном аналитическом методе последовательности белков-индикаторов, пептидов или нуклеиновых кислот могут варьироваться в зависимости от конкретных членов поликлонального белка или от последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих эти белки, и эти последовательности могут быть идентифицированы выбранными аналитическими методами.

Генетические анализы на клональное разнообразие поликлональной клеточной линии-продуцента

Некоторые варианты настоящего изобретения включают мониторинг поликлональности в экспрессионной системе, продуцирующей поликлональный белок, путем оценки количества клеток, кодирующих конкретный член поликлонального белка, и/или уровней мРНК, кодирующей отдельные члены такого поликлонального белка. Такой мониторинг может быть проведен на уровне мРНК или на геномном уровне с применением, например, RFLP- или Т-RFLP-анализа, анализа олигонуклеотидных микромассивов, количественной ПЦР, такой как ПЦР в реальном времени, и секвенирования нуклеиновых кислот вариабельных областей генных последовательностей, полученных из клеточной линии-продуцента. Альтернативно, аналогичные методы могут быть использованы для качественной оценки разнообразия белков в поликлональной клеточной линии. Мониторинг последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих поликлональных белок, может быть проведен на образцах, полученных из одной поликлональной клеточной культуры в различные периоды времени культивирования, и таким образом, может быть проведен мониторинг относительных количеств отдельных кодирующих последовательностей в процессе производственного цикла для оценки их композиционной стабильности. Альтернативно, может быть проведен мониторинг последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих поликлональный белок в образцах, полученных из различных поликлональных клеточных культур в конкретные периоды времени культивирования, и тем самым, может быть проведен мониторинг относительных количеств отдельных кодирующих последовательностей в различных партиях продукта для оценки изменений в этих различных партиях.

Предпочтительным образцом, используемым в генетических анализах, является фракция клеточной культуры, обогащенная клетками этой культуры, например, путем осаждения. Такой образец обычно получают путем сбора фракции клеточной культуры в нужный период времени с последующим удалением среды, например, путем центрифугирования. Образцы для сравнения состава различных партий, предпочтительно, получают из клеток in vitro при определенном ограничении их возраста клеток для продуцирования.

RFLP/Т-RFLP

RFLP- и Т-RFLP-анализ может быть осуществлен на геномном уровне или на уровне мРНК. Если поликлональная клеточная линия-продуцент была получена так, чтобы каждая клетка содержала только одну копию представляющей интерес последовательности, то анализ на геномном уровне позволяет получить данные об относительном количестве клеток в клеточной линии-продуценте, продуцирующей отдельный член поликлонального белка. С другой стороны, анализ на уровне мРНК позволяет получить данные о потенциальных уровнях экспрессии отдельных членов поликлонального белка. Анализ на уровне мРНК обычно осуществляют посредством обратной транскрипции мРНК с получением кДНК с последующим проведением рестрикционного анализа. Однако может быть также проведен анализ непосредственно на мРНК.

В RFLP-анализе концевой последовательности, прямой(ые) и/или обратный(е) праймер(ы), используемый(е) для ПЦР или ОТ-ПЦР, метят с получением меченных на концах ПЦР-фрагментов. После гидролиза соответствующими рестриктирующими ферментами получают фрагменты различных размеров, и эти фрагменты могут быть разделены с помощью электрофореза, а предпочтительно капиллярного электрофореза, после чего полученные фрагменты могут быть обнаружены с помощью меченого ампликона (Liu et al., 1997, Applied and Environmental Microbiology 63, 4516-4522). Подходящими метками могут служить сигналы, определяемые по интенсивности флуоресценции, радиоактивности, цветовым свойствам, дифракции рентгеновских лучей или абсорбции, магнетизму или ферментативной активности, и такими метками являются, например, флуорофоры, хромофоры, радиоактивные изотопы (в частности, ³²Р, ³³Р, ³⁵S и ¹²⁵I), электронно-плотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие специфических партнеров по связыванию. В качестве метки предпочтительно используют флуорофор.

При использовании поликлональной клеточной линии-продуцента с большим клональным разнообразием может оказаться невозможным получить уникальный рестрикционный фрагмент для каждой отдельной кодирующей последовательности. Если возникает такая ситуация, то последовательности индикаторных нуклеиновых кислот могут быть отобраны для мониторинга клонального разнообразия поликлональной клеточной линии продуцента. Альтернативно, фрагменты, которые не могут быть разделены по размеру, могут быть секвенированы для оценки распределения всех отдельных кодирующих последовательностей.

Анализ олигонуклеотидных микромассивов

Олигонуклеотидные микромассивы, такие как ДНК-чипы, могут быть использованы для измерения уровней геномной ДНК или уровней мРНК в поликлональной клеточной линии путем определения уровня гибридизации меченой ДНК, генер