Дозирование олигонуклеотидов

Дозирование олигонуклеотидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к получению фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения заболеваний, которые модулируются геном TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкином-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2.

Введение

Всеобщей характеристикой фармацевтических веществ является их увеличивающаяся эффективность, сопровождающаяся ростом вводимых количеств. Для конкретных веществ, применяемых в терапии опухолей, показана существенная корреляция между суммарным вводимым количеством и ингибированием опухолевого роста.

Кроме того, клеточный захват является лимитирующим фактором в отношении эффективности введения олигонуклеотидов «in vivo», когда большие количества олигонуклеотидов вводят для ингибирования продукции соответствующего белка.

Тем не менее, клинический успех этих веществ ограничен, так как рост концентрации и суммарного количества этих веществ, которые могут вводиться млекопитающему, страдающему от метастазов опухолей, нервного заболевания и иммуносупрессии, коррелирует с сильным увеличением тяжелых побочных эффектов и токсичности.

До настоящего времени в терапии рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии нет результатов клинических испытаний, предоставляющих данные о количестве олигонуклеотидов, которое подходит для успешной терапии опухолей.

Патенты EP 1008649 и EP 0695354 указывают на то, что олигонуклеотиды, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета1 и/или TGF-бета 2, могут быть использованы для получения фармацевтических композиций. Патент EP 1089764 дополнительно указывает на то, что ингибиторы веществ, отрицательно влияющих на иммунную систему, в сочетании с олигонуклеотидами, гибридизующимися с мРНК TGF-бета, VEGF, интерлейкина-10, а также их соответствующих рецепторов и рецептора простагландина E2, также могут быть использованы для получения фармацевтической композиции. Однако эти патенты предлагают широкий диапазон концентраций, при которых могут быть введены олигонуклеотиды.

Результаты токсикологических исследований на млекопитающих показали, что можно вводить большие количества олигонуклеотидов для ингибирования продукции соответствующих мишеней без токсических побочных эффектов (смотри примеры 1, 2, 3 и Schlingensiepen, R. et al, 2005). Впоследствии стало очевидным введение высоких концентраций и больших количеств олигонуклеотидов для ингибирования мишеней, вовлеченных в терапию рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии.

Краткое изложение сущности изобретения

Неожиданно в ходе клинических испытаний заявители обнаружили, что фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один олигонуклеотид в более низкой концентрации и/или вводимые в более низких суточных количествах, ингибируют опухолевый рост быстрее и с меньшими симптомами при прогрессии заболевания, чем таковые с более высокими концентрациями и/или с более высокими суточными количествами.

Кроме того, эти концентрации или суточные количества были от 10 до 50 раз ниже, чем максимальная концентрация, тестируемая в токсикологических исследованиях без тяжелых побочных эффектов (смотри также фиг.4).

Таким образом по меньшей мере один олигонуклеотид, применяемый для получения фармацевтического препарата настоящего изобретения, имеет концентрацию от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 25 мкМ и длину от приблизительно 8 до приблизительно 30 нуклеотидных строительных блоков, вводится для профилактики и/или лечения заболеваний, которые модулируются TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкином-10, c-jun, c-fos и/или рецептором простагландина E2, и гибридизуется с матричной РНК гена TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2.

Дополнительным аспектом изобретения является введение указанного фармацевтического препарата с помощью инфузии в ткань, полость тела или опухоль со скоростью потока от приблизительно 0,1 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин или с помощью болюсной инъекции.

Еще одним аспектом изобретения является нанесение по меньшей мере одного олигонуклеотида на ткань, опухоль, полость тела в количествах от приблизительно 0,15 нмоль до приблизительно 3 мкмоль, при введении в опухоль, ткань или полость тела, выбранных из группы полости сустава или пространства желудочка, соответственно в количествах от приблизительно 0,005 мкмоль до приблизительно 0,06 ммоль, при введении в большую полость тела, такую как внутрибрюшинная полость или плевральная полость, в количествах от приблизительно 0,005 мкмоль до приблизительно 0,05 ммоль.

Дополнительными преимуществами вариантов осуществления, описанных в настоящем изобретении, являются повышенная эффективность, повышенная аффинность для нуклеиновой кислоты-мишени, повышенный клеточный захват, повышенная безопасность, сниженные побочные эффекты и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Чертежи

На фиг.1 представлено количество больных анапластической астроцитомой с симптомами, обусловленными прогрессией заболевания, после лечения растворами (0,9% хлорид натрия) 10 мкМ и 80 мкм олигонуклеотида, гибридизованного с мРНК TGF-бета2, идентифицированного в последовательности, представленной как SEQ ID NO 5, вводимого внутрь опухоли с помощью доставки, усиленной конвекцией CED при скорости потока 4 мкл/мин. Как можно видеть на фиг.1, количество больных анапластической астроцитомой с симптомами, обусловленными прогрессией опухоли, а также со стадией и тяжестью этих эффектов после лечения 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида снижено по сравнению с больными, которым инфузировали 80 мкМ раствора указанного олигонуклеотида. Смотри более подробно в примере 3. Степени определяли в соответствии с NCI CTC Toxicity Scale Version 2.0. SAEs (= серьезные неблагоприятные эффекты) определяли как любое неблагоприятное медицинское проявление, возникшее в результате такой дозы, которая, например, ведет к опасным для жизни эффектам, требует госпитализации больного или продления существующей госпитализации.

На фиг.2 представлено снижение размера опухоли в течение двух месяцев у четырех больных анапластической астроцитомой, подвергаемых лечению 10 мкМ (фиг.2A, 2B, 2C) и 80 мкМ (фиг.2D) раствором (0,9% хлорид натрия, DAB7) антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета2, описываемого последовательностью, представленной SEQ ID NO 5, введенного внутрь опухоли с помощью конвекционной увеличенной доставки. Более подробно смотри пример 10. У трех больных, которых лечили 10 мкМ раствором (фиг.2A, 2B, 2C), наблюдалось снижение размера опухоли в течение периода от приблизительно 2 до 5 месяцев в диапазоне от приблизительно 30% до 66%, в то время как у больного, которого лечили 80 мкМ, выявлялось увеличение роста опухоли (фиг.2D). Более подробно смотри в примере 10.

На фиг.3 изображены предпочтительные олигонуклеотиды, способные гибридизоваться с мРНК-мишенями, таких как TGF-бета1 (SEQ ID NO с 1 по 4), TGF-бета2 (SEQ ID NO с 5 по 8), TGF-бета3 (SEQ ID NO с 9 по 38), рецептор простагландина E2 (SEQ ID NO с 39 по 49), VEGF (SEQ ID NO с 50 по 56), интерлейкин 10 (SEQ ID NO с 57 по 76), c-jun (SEQ ID NO с 78 по 83) и c-fos (SEQ ID NO с 85 по 93).

На фиг.4 качественно изображены эффективность и токсичность олигонуклеотидов, коррелирующие с концентрацией. Вертикальная ось качественно показывает токсичность и эффективность, а горизонтальная ось отображает концентрацию олигонуклеотида. На фигуре можно видеть, что пик эффективности достигается при намного более низкой концентрации, чем при концентрации, проявляющей токсические эффекты.

На фиг.5 представлено ингибирование секреции TGF-бета2 клетками A-172, обработанными 5 мкМ, 10 мкМ и 80 мкМ олигонуклеотида, описываемого последовательностью SEQ ID NO 5, в течение 7 дней, представлено в процентах от необработанного контроля (столбик 1). Инкубация клеток A-172 с тремя различными концентрациями этого олигонуклеотида приводила к среднему показателю ингибирования 61,1% (5 мкМ, столбик 2), 68,1% (10 мкМ, столбик 3) и 56,2% (80 мкМ, столбик 4). Следовательно, 10 мкМ олигонуклеотида, описываемого последовательностью SEQ ID NO 5, как обнаружено, проявляет наилучшее ингибирование экспрессии TGF-бета2 по сравнению с 5 и 80 мкМ этого олигонуклеотида. Секретируемый TGF-бета2 количественно определяли с помощью ИФА. Результаты получены в четырех независимых экспериментах. Более подробно смотри в примере 12.

На фиг.6 показано отношение выживаемости больных в зависимости от времени для трех групп, подвергаемых лечению. В одной группе SEQ ID NO 5 вводили в концентрации 10 мкМ (сплошная линия) и 80 мкМ (пунктирная линия). Больные контрольной группы (точечная линия), с другой стороны, получали стандартную химиотерапию. Более подробно смотри в примере 11. Больные, которые были живы к моменту оценки, представлены как «цензурные» величины с их соответствующим временем выживания до оценки (точки на кривых). Этот вид представления известен как «кривая выживания Каплана-Мейера». Данные показывают, что больные, получавшие 10 мкМ SEQ ID NO 5, имеют намного лучшую возможность выживания, чем те, которых лечили 80 мкМ, и контрольная группа.

Подробное описание изобретения

Выражение «около» в контексте настоящего изобретения включает отклонения от абсолютной величины, данной в тексте, от 0 до 100%, более предпочтительно от 1 до 80%, еще более предпочтительно от 2 до 60%, более предпочтительно от 3 до 40%, более предпочтительно от 4 до 20% и еще более предпочтительно от 5 до 10%, от соответствующей величины.

Неблагоприятное событие в контексте настоящего изобретения понимается как любой неблагоприятный медицинский эпизод у больного или индивида, подвергаемого клиническому исследованию, после введения фармацевтического препарата, который не имеет причинной связи с лечением соответствующим фармацевтическим препаратом. Неблагоприятное событие может, следовательно, быть любым неблагоприятным и непредполагаемым признаком (включая ошибочные лабораторные данные), симптомом или заболеванием, например, обусловленным прогрессией заболевания. Другое проявление неблагоприятного события представляет собой симптом.

Термин «мозговая опухоль», применяемая как синоним термина «опухоли мозга» в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой любую опухоль мозга, включая метастазы, метастазы, происходящие из других частей мозга или происходящие из любой другой опухоли организма и метастазы спинного мозга. Опухоль мозга дополнительно включает первичную опухоль мозга, астроцитому, включая глиобластому и олигоастроцитому, олигодендроглиому и глиосаркому.

Под термином «полость» в контексте настоящего изобретения понимают, например, ободочную кишку, двенадцатиперстную кишку, подвздошную кишку, полость суставов, плевральную полость, внутрибрюшинное пространство, просвет пищевода, гортань, гайморову полость, носовую полость, глотку, прямую кишку, желудок, кишечный тракт, мочеточник, мочевой пузырь и пространство желудочков.

В настоящем изобретении выражение «заболевание» включает неоплазмы, метастазы, неврологические нарушения и иммуносупрессию.

Под «гибридизацией» в контексте настоящего изобретения подразумевает, что две нуклеотидные цепи по меньшей мере частично образуют двойную цепь с помощью водородных мостиков. Двойная цепь образуется полностью, когда две нуклеотидные цепи имеют точные антисмысловые последовательности. Но даже, если любой нуклеотид олигонуклеотида, также обозначаемый как нуклеотидный строительный блок, замещен другим нуклеотидом, соответствующий нуклеотид модифицирован или даже, когда на месте соответствующего олигонуклеотида находится спейсер, олигонуклеотид все еще может гибридизоваться с молекулой-мишенью, обычно с мРНК белка, и в результате этого ингибировать продукцию указанного белка.

«Метастаз» в контексте настоящего изобретения обозначает, что по меньшей мере одна клетка отделяется или диссоциирует от опухолевой ткани и передвигается по лимфатической системе, кровеносным сосудам и/или, проникая в окружающую ткань, достигает другой части организма млекопитающего, предпочтительно человека, где она прикрепляется и образует новую опухолевую ткань.

Термин «олигонуклеотиды изобретения» охватывает любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или любое другое соединение, которое при введении млекопитающему способно дать его биологически активный метаболит или остаток. Это осуществляется с помощью специфической гибридизации соединений с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бетаa3, VEGF и интерлейкин-10, и/или рецептор простагландина E2.

Термины «нуклеиновые кислоты» и «олигонуклеотиды» применяют как синонимы в контексте настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не являются антисмысловыми нуклеиновыми кислотами, что означает, что они не работают в клетке в результате частичного или полного связывания с видами комплементарной геномной ДНК или РНК, тем самым ингибируя функцию указанных видов геномной ДНК или РНК.

В одном варианте осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения также включают олигонуклеотиды, как описано в патентах EP 0695354 и EP 1008649, а также олигонуклеотиды из международных патентных заявок, опубликованных под No WO 01/68146, WO 98/33904, WO 99/63975 и WO 99/63975, включенных здесь в качестве ссылки. Олигонуклеотиды, гибридизующиеся с TGF-бета, в одном предпочтительном варианте осуществления включают по меньшей мере одну последовательность, предлагаемую как SEQ ID № с 1 по 93.

Олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают олигонуклеотиды, имеющие не существующие в природе части со сходной функцией. Существующие в природе нуклеотиды, а также не существующие в природе нуклеотиды, модификации и спейсеры также относятся к нуклеотидному строительному блоку. Наиболее обычным нуклеотидным строительным блоком является нуклеотид. Модифицированные или замещенные нуклеотиды, а также спейсеры также включаются в выражение «нуклеотидный строительный блок».

Эти модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто являются предпочтительными по сравнению с нативными формами из-за желаемых свойств, таких как повышенный клеточный захват, повышенное сродство к нуклеиновой кислоте-мишени (например, белку), измененная внутриклеточная локализация и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз. Модификации олигонуклеотидов, как применятся здесь, включают любую химическую модификацию сахара, основной части и/или межнуклеозидной связи.

В одном варианте осуществления кольцевая структура рибозной группы нуклеотидов в модифицированном олигонуклеотиде или полинуклеотиде имеет в кольцевой структуре кислород, замещенный N-H, N-R (где R представляет собой алкил, более предпочтительно алкил с от 1 до 20 углеродами, очень предпочтительными алкилами являются метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, или R представляет собой арильный заместитель), S и/или метилен.

Фармацевтический препарат в контексте настоящего изобретения включает олигонуклеотид настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.

В одном варианте осуществления нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с ковалентно модифицированным основанием и/или сахаром включают, например, нуклеиновые кислоты, имеющие сахара остова, которые ковалентно присоединены к органическим группам с низкой молекулярной массой, отличным от гидроксильной группы в 3' и/или 2' положении или фосфатной группы в 5' положении. Модифицированные таким образом нуклеиновые кислоты могут дополнительно включать по меньшей мере одну 2'-O-замещенную рибозную группу. В целях настоящего изобретения термин «2'-замещенная» обозначает замещение 2'-OH молекулы рибозы. O может быть замещен N, S, и заместитель может дополнительно включать алкил с от 1 до 20 углеродами, например O-алкил, S-алкил, NH-алкил, N-диалкил, O-арил, S-арил, NH-арил, O-аралкил, S-аралкил, NH-аралкил. В предпочтительных вариантах осуществления 2'-O-алкильных групп представляют собой метокси-, этокси-, пропилокси-, изопропилокси-, метоксиэтокси. Дополнительные модификации нуклеотидных строительных блоков также даны в патентах США 6143881, US 5591721, US 5652355, US 5962425, US 5969116 и US 5914396, включенных здесь в качестве ссылки. Другим предпочтительным вариантом осуществления является нуклеотидный строительный блок, включающий по меньшей мере одну дезоксирибозу с алкильной группой, связанной с 2'-углеродом. Алкил может иметь от приблизительно 1 до приблизительно 30 углеродов, от 1 до приблизительно 20 углеродов, от 1 до приблизительно 10 углеродов или от 1 до приблизительно 5 углеродов. Предпочтительными алкильными группами являются этил-, пропил-, изопропил-, бутильная группа, наиболее предпочтительной является метильная группа.

В еще одном варианте осуществления модифицированные нуклеиновые кислоты включают сахара, такие как арабиноза вместо рибозы. Таким образом, нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными по составу остова, в результате чего содержащими любое возможное сочетание полимерных единиц, связанных друг с другом, таких как пептид-нуклеиновые кислоты (которые имеют аминокислотный остов, связанный с основаниями нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гомогенными по составу остова.

Замещенные пурины и пиримидины нуклеиновых кислот включают стандартные пурины и пиримидины, такие как цитозин, а также аналоги оснований, такие как замещенные основания (Wagner et al., 1993). Пурины и пиримидины включают, но ими не ограничиваются, аденин, цитозин, гуанин, тимин, инозин, 5-метилцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие существующие и не существующие в природе нуклеиновые основания, замещенные и незамещенные ароматическими частями.

Одиночные нуклеотиды в каждом олигонуклеотиде могут содержать те же самые модификации, могут содержать сочетания этих модификаций или могут сочетать эти модификации с фосфодиэфирными связями. Способы придания олигонуклеотиду устойчивости к нуклеазам включают, но ими не ограничиваются, ковалентную модификацию пуриновых или пиримидиновых оснований. Например, основания могут быть метилированы, гидроксиметилированы или замещены другим образом (например, гликозилированы), так что олигонуклеотидам или полинуклеотидам придается существенная устойчивость к кислотам и нуклеазам.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один конец олигонуклеотида представляет собой биотин, аналог биотина, авидин или аналог авидина. Эти молекулы обладают способностью блокировать деградацию защищенного олигонуклеотида и обеспечивают возможность присоединения модифицированных нуклеиновых кислот к твердой подложке с высоким сродством. Производные авидина и биотина, которые могут быть применены для получения реагентов настоящего изобретения, включают стрептавидин, сукцинилированный авидин, мономерный авидин, биотин (биотин-эпсилон-N-лизин), гидразид биотина, аминные или сульфгидрильные производные 2-иминобиотина и гидразид биотинил-эпсилон-аминокапроновой кислоты. Дополнительные производные биотина, такие как биотин-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, сложный эфир биотинил-эпсилон-аминокапроновой кислоты N-гидроксисукцинимида, сульфосукцинимидил-6-(биотинамино)гексаноат, N-гидроксисукцинимидиминобиотин, биотинбромацетилгидразид, п-диазобензоилбиоцитин и 3-(N-малеимидпропионил)-биоцитин, также могут быть применены в качестве концевых блокирующих групп на олигонуклеотидах настоящего изобретения.

В еще одном варианте осуществления основные единицы поддерживаются для гибридизации подходящим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, олигонуклеотидный миметик, который, как показано, обладает прекрасными свойствами гибридизации, обозначается как пептид-нуклеиновая кислота (PNA). В соединениях PNA сахарный остов олигонуклеотида заменен содержащим амиды остовом, в частности аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания связываются прямо или непрямо с аза атомами азота амидной части остова. Примеры патентов США, которые указывают на получение соединений PNA, включают, но ими не ограничиваются, патенты США № 5539082, 5714331 и 5719262, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки. Дополнительное указание на соединения PNA может быть найдено в Nielsen et al. 1991.

Другие олигонуклеотиды с модифицированным остовом включают, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфоротриэфиры, аминоалкилфосфоротриэфиры, метил- и другие алкил-фосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты, и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионо-фосфор-амидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5' связи, их 2'-5'- соединенные аналоги, и те, которые имеют инвертированную полярность, где соседние пары нуклеозидных единиц соединены 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Включаются также различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты. Одним предпочтительным вариантом осуществления является натриевая соль нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеотид олигонуклеотида модифицирован, как описано в одной из модификаций выше. Модификация может охватывать олигонуклеотид либо непрерывно, либо нерегулярно.

В еще одном варианте осуществления по меньшей мере две модификации, как описано выше, сочетаются в одном олигонуклеотиде.

В другом варианте осуществления от 1 до приблизительно 12, или от 1 до приблизительно 8, или от 1 до приблизительно 4, или от 1 до приблизительно 2 олигонуклеотидных и/или нуклеотидных связей у 3' и/или 5' конца олигонуклеотида модифицированы, как описано выше.

В одном варианте осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения гибридизуются с мишенью, например, TGF-бета или его подтипами, более предпочтительно TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, ИЛ-10 и низкий PGE₂. Эти мишени хорошо известны специалистам в данной области техники. Антисмысловая структура мРНК указанных мишеней также дана в патенте PCT/EP2004/053604, включенном здесь в качестве ссылки.

Удлинение цепи обозначает, что олигонуклеотиды представленных последовательностей и другие олигонуклеотиды, которые имеют дополнительные нуклеотиды в последовательности соответствующей антисмысловой структуры мРНК указанных мишеней, все еще находится в объеме настоящего изобретения. Дополнительные нуклеотиды в одном варианте осуществления находятся в соответствии с кодирующей областью мРНК, в еще одном варианте осуществления дополнительные нуклеотиды находятся также в некодирующем участке мРНК, включая интроны и экзоны. Дополнительные нуклеотиды включают от приблизительно 1 до приблизительно 10000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 5000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 3000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 1000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 500 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 100 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 25 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 10 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 5 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 2 нуклеотидов, связанных с по меньшей мере одним из 3'- и/или 5'-концом, в другом варианте осуществления с по меньшей мере одним из 2'- и/или 5'-концом. В еще одном варианте осуществления некоторые нуклеотидные строительные блоки этих олигонуклеотидов или полинуклеотидов могут быть модифицированы или замещены с помощью спейсеров и/или модификаций, как здесь описано.

Фармацевтически приемлемые соли относятся к физиологически и фармакологически приемлемым солям соединений, применяемых в изобретении, что означает, что соли сохраняют биологическую активность родительских соединений без нежелательных токсикологических эффектов.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид или его активное производное представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид, в еще одном варианте осуществления олигонуклеотид является двухцепочечным, что означает, что олигонуклеотид полностью или частично гибридизован со вторым олигонуклеотидом, который имеет от приблизительно 50% до приблизительно 100% точную антисмысловую структуру указанного олигонуклеотида. Это может приводить к двойной цепи, в которой оба олигонуклеотида гибридизуются с меньшей силой связи, или к двойной цепи с перекрывающимися концами. Два олигонуклеотида могут иметь одну и ту же длину, другими словами, они имеют одинаковое количество нуклеотидных строительных блоков, или их длина может различаться, также приводя к перекрыванию концов на одном или обоих концах.

Экспрессионный спейсер в контексте настоящего изобретения включает любой нуклеотидный строительный блок, который не обязательно является производным или модификацией нуклеотида, но связывает два нуклеотидных строительных блока таким образом, что полученный олигонуклеотид все еще гибридизуется со своей мишенью, например мРНК TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, рецептора простагландина E2, c-fos, c-jun или интерлейкина-10.

Одним вариантом осуществления изобретения является применение по меньшей мере одного олигонуклеотида с длиной в от 8 до 30 нуклеотидных строительных блоков для получения фармацевтического препарата для профилактики и/или лечения заболеваний, которые модулируются TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкином-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2, у млекопитающего, где указанный олигонуклеотид гибридизуется с матричной РНК гена TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2, и где указанный препарат включает указанный олигонуклеотид в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 25 мкМ.

В других вариантах осуществления фармацевтический препарат настоящего изобретения включает олигонуклеотиды в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 15 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 2,5 мкМ до приблизительно 14 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 4 мкМ до приблизительно 13 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 5 мкМ до приблизительно 12,5 мкМ, наиболее предпочтительно концентрация олигонуклеотидов составляет приблизительно 20 мкМ, приблизительно 10 мкМ или приблизительно 5 мкМ.

В еще одном варианте осуществления фармацевтический препарат этого изобретения включает олигонуклеотиды в концентрации от приблизительно 50 мкМ до приблизительно 150 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 60 мкМ до приблизительно 100 мкМ, еще более предпочтительно от приблизительно 70 мкМ до приблизительно 90 мкМ и наиболее предпочтительно приблизительно 80 мкМ, 60 мкМ или 100 мкм.

Тогда как олигонуклеотиды настоящего изобретения являются одноцепочечными, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере части одноцепочечной нуклеиновой кислоты являются двухцепочечными. Двухцепочечные молекулы более стабильны in vivo, в то время как одноцепочечные молекулы имеют повышенную активность.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид имеет длину между приблизительно 6 и приблизительно 30 нуклеотидов и является комплементарным мРНК мишеней TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и рецептора простагландина E2. В более предпочтительных вариантах осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения имеют длину от приблизительно 7 до приблизительно 25 нуклеотидов, от приблизительно 8 до приблизительно 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно от приблизительно 12 до 18 нуклеотидов. Предпочтительные варианты осуществления олигонуклеотидов, применяемых в настоящем изобретении, показаны в перечне последовательностей под SEQ ID NO с 1 по 93, наиболее предпочтительными вариантами осуществления являются SEQ ID NO с 1 по 38, наиболее предпочтительны SEQ ID NO 2 и/или 5.

Другие олигонуклеотиды, применяемые в фармакологических препаратах в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой олигонуклеотиды, описанные в перечне последовательностей, соответственно в примерах патентов EP 1089764, EP 0695534, PCT/EP 98/00497 и PCT/EP 2005/002101, включенных здесь в качестве ссылки.

В других вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотид для получения фармацевтического препарата включает по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь между двумя нуклеотидными строительными блоками. Фосфоротиоатная связь может составлять 0% - 5%, от 5% до 10%, от 10% до 15%, от 15% до 20%, от 20% до 25%, от 25% до 30%, от 30% до 35%, от 35% до 40%, от 40% до 45%, от 45% до 50%, от 50% до 55%, от 55% до 60%, от 60% до 65%, от 65% до 70%, от 70% до 75%, от 75% до 80%, от 80% до 85%, от 85% до 90%, от 90% до 95% или от 95% до 100% связей. Фосфоротиоатные связи могут быть разбросаны по олигонуклеотиду регулярно или нерегулярно. В некоторых вариантах осуществления фосфоротиоат аккумулируется либо на одном, либо на обоих 3'- и/или 5'-концах олигонуклеотида. Другим предпочтительным вариантом осуществления является олигонуклеотид, в котором все связи между нуклеотидами представляют собой фосфоротиоаты.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид. Одноцепочечный означает, что все олигонуклеотидные строительные блоки построены в одну линию и не гибридизуются со вторым олигонуклеотидом или антисмысловым олигонуклеотидом и не связываются иным способом.

В еще одних вариантах осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения применяют для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии.

В других вариантах осуществления фармацевтические препараты олигонуклеотидов вводят путем инфузии в ткань, опухоль или полость тела. В более предпочтительных вариантах осуществления ткань выбрана из группы желчного протока, пузыря, кости, костного мозга, мозга, молочной железы, ободочной кишки, эндометрия, эпителия, желчного пузыря, головы, головы и шеи, сердца, кишечника, суставов, почки, гортани, печени, легкого, лимфатического узла, лимфатических сосудов, мышцы, пищевода, яичника, поджелудочной железы, простаты, прямой кишки, мочеточника, кожи и ее слоев, селезенки, желудка, семенника, тимуса, щитовидной железы, миндалины или матки и/или вводят в соответствующую опухоль данной ткани.

В более предпочтительном вариантах осуществления фармацевтический препарат вводят в опухоль в мозге, предпочтительно в опухоль мозга, выбранную из группы астроцитомы, включая глиобластому и олигоастроцитому.

В другом варианте осуществления фармацевтический препарат олигонуклеотидов вводят в полость тела, выбранную из группы желчного протока, пузыря, ободочной кишки, желчного пузыря, полости сустава, плевральной полости, внутрибрюшинного пространства, прямой кишки, кишечного тракта, мочеточника, мочевого пузыря и пространства желудочков.

В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические препараты, включающие по меньшей мере один олигонуклеотид настоящего изобретения, вводят в опухоль или ткань, полость сосуда или пространство желудочков со скоростью потока от приблизительно 0,1 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин. Дополнительно предпочтительными являются скорости потока от приблизительно 0,5 мкл/мин до приблизительно 0,05 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 0,8 мкл/мин до приблизительно 0,04 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 1 мкл/мин до приблизительно 0,02 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 2 мкл/мин до приблизительно 10 мкл/мин, наиболее предпочтительно от приблизительно 4 мкл/мин. В наиболее предпочтительном варианте осуществления фармацевтический препарат вводят при этих скоростях потока в опухоль мозга, более предпочтительно в астроцитому, включая глиобластому и олигоастроцитому.

В другом варианте осуществления фармацевтический препарат вводят в полости тела, которые не представляют собой пространство желудочков или полость сустава, например ободочную кишку, плевральную полость, внутрибрюшинное пространство, прямую кишку, желудок, кишечный тракт, мочеточник или мочевой пузырь. В этих вариантах осуществления фармацевтический препарат вводят со скоростями потока от приблизительно 5 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 0,05 мл/мин до приблизительно 1 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 0,1 мл/мин до приблизительно 0,5 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 0,3 мл/мин до приблизительно 0,4 мл/мин, наиболее предпочтительно приблизительно 0,35 мл/мин.

В еще одних вариантах осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения применяют для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии.

В предпочтительных вариантах осуществления рак, метастазы, нервную систему и/или иммуносупрессию лечат соответствующими олигонуклеотидами, гибридизующимися с мРНК мишеней TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2, еще более предпочтительными являются последовательности, идентифицированные в перечне последовательностей SEQ ID NO 1-93. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета1, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 1-4, наиболее предпочтительной является SEQ ID NO 2. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета2, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 5-8, наиболее предпочтительной является SEQ ID NO 5. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета3, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 9-38. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК рецептора простагландина E2, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 39-49. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК интерлейкина-10, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 57-76. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК c-jun, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 78-83. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК c-jun, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 85-93.

Другим вариантом осуществления заболеванием нервной системы является боковой амиотрофический склероз. В предпочтительном варианте осуществления нейрональные нарушения лечат соответствующими олигонуклеотидами, гибридизующимися с мРНК мишеней c-jun или j-fos, еще более предпочтительными являются последовательности c-jun, идентифицированные в перечне последовательностей SEQ ID NO 78-83, соответственно последовательности c-fos, идентифицированные в перечне последовательностей SEQ ID NO 85-93.

В одном варианте осуществления фармацевтический препарат вводят с помощью аппликационной системы. Предпочтительная аппликационная система включает портативный насос, связанный гибкими трубками с системой входа. Система входа связана с катетером для инфузии, хирургически имплантированным в центр опухоли, ткани или краем полости тела. В другом варианте осуществления применяют несколько катетеров для инфузии при инфузии фармацевтического препарата. В еще одних вариантах осуществления катетеры для инфузии располагают не в центре опухоли или ткани, а их располагают на краю ткани и/или опухоли, инфузируемых фармацевтическим препаратом. Аппликационные системы, применимые в настоящем изобретении, описаны также в международной патентной заявке PCT/EP 2004/004211, включенной здесь в качестве ссылки.

Суммарный объем в день фармацевтического препарата, предпочтительно инфузируемого в опухоли, ткани или полости тела, выбранные из полости суставов или желудочкового пространства, варьирует от приблизительно 0,15 мл/д до приблизительно 0,15 л/д, более предпочтительно от приблизительно 0,7 мл/д до приблизительно 0,07 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 1,2 мл/д до приблизительно 0,06 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 2 мл/д до приблизительно 0,03 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 3 мл/д до приблизительно 15 мл/д и наиболее предпочтительно он составляет приблизительно 5,6 мл/д или приблизительно 11 мл/д.

В другом варианте осуществления суммарный объем фармацевтического препарата, пр