Вирусы prrs, их инфекционные клоны, мутантные формы и способы применения

Вирусы prrs, их инфекционные клоны, мутантные формы и способы применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ДАННЫЕ О ПРОДОЛЖАЮЩЕЙСЯ ЗАЯВКЕ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США с серийным № 60/694021, поданной 24 июня 2005 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) является этиологическим фактором заболевания, характеризующегося респираторными нарушениями у молодых свиней и неспособностью к размножению у самок свиней (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:127-133 (1992); Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest.,4:117-126 (1992); Wensvoort et al., Vet. Q., 13:121-130 (1991)) и в настоящее время он является эндемичным в большинстве стран. Синдром впервые был выявлен как "загадочная болезнь свиней" в США в 1987 году и Европе он был выявлен в 1990 году. Два прототипных вирусных штамма (Lelystad и VR-2332) отличаются по нуклеотидной последовательности приблизительно на 40% и представляют собой два различных генотипа, обозначаемых как европейский (EU или 1 типа, Lelystad; Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993)) и североамериканский (NA или 2 типа, VR-2332; Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)) штаммы (Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Mardassi et al., J. Gen. Virol., 75:681-5 (1994); Meng et al., Arch. Virol., 140:745-55 (1995); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Заболевание также было названо синдромом Уобаш, загадочной болезнью свиней, репродуктивным и респираторным синдромом свиней, геморрагической септицемией свиней, эпидемическим вызывающим аборт и респираторным синдромом свиней, болезнью голубого аборта, болезнью синего уха, abortus blau и seuchenhafter spatabort der schweine. Заболевание характеризуется репродуктивной недостаточностью у беременных самок свиней и респираторными проблемами у свиней всех возрастов. Заболевание оказывает значительное отрицательное влияние на промышленное свиноводство.

PRRSV представляет собой оболочечный вирус с положительной смысловой РНК, принадлежащий семейству Arteriviridae к отряду Nidovirales (Cavanagh, Arch. Virol., 142:629:633 (1997)). Длина генома PRRSV варьирует между 15,1-15,5 т.п.н. (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)). Первые 75% генома кодируют репликазный полибелок, необходимый для репликации вируса, и содержат две большие открытые рамки считывания (ORF) (1a и 1b), которые котрансляционно преобразуются в белки меньших размеров посредством кодируемых вирусом протеаз (Snijder et al., J Gen. Virol., 79:961-79 (1998)). Структурные белки кодируются семью расположенными ниже ORF и они транслируются с 3'-котерминального вложенного множества субгеномных мРНК (sgmRNA) (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)). В штамме VR-2332 кодирующая область генома (15411 оснований) фланкирована 5' и 3'-нетранслируемыми областями из 189 и 151 нуклеотидов, соответственно.

Штамм PRRSV VR-2332 охарактеризован по его полной геномной последовательности (Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)), по способности PRRSV конститутивно продуцировать дефектные виды субгеномной РНК, называемые гетероклитами (латин.: редко встречающиеся формы) (Yuan et al., Virology, 275:158-169 (2000)); Yuan et al., Virus Research, 105:75-87 (2004)), и по его ростовым характеристикам in vitro, а также in vivo (Murtaugh et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 102:105-349 (2004)). Кроме того, инфекционный клон этого PRRSV с геномом РНК 15,4 т.п.н. был получен и исследован на его способность вызывать заболевание у свиней (pVR-HN; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)).

PRRSV продолжает приводить к значительным экономическим потерям во всем мире. Существуют вакцины, но в их основе лежит один штамм PRRSV, и показано, что штаммы PRRSV варьируют на антигенном и генетическом уровнях. Кроме того, с того времени как вирус был идентифицирован в Европе и в США, продолжают появляться новые фенотипы заболевания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предшествующие данные позволили предположить, что делеции и/или мутации любого штамма вируса PRRS часто оказывают значительное отрицательное воздействие на рост вируса. Конкретно, в отдельных лабораториях были внесены мутации в 3'-конец вируса, и полученный вирус оказывался либо нестабильным, и происходила быстрая реверсия в последовательность дикого типа, либо его рост происходил очень медленно или отсутствовал вообще (Lee et al., Virol., 331:47-62 (2005); Choi et al., J. Virol., 80:723-736 (2006); Lee et al., Virolog., 346:238-250 (2005)). Таким образом, при сравнении нуклеотидных последовательностей европейского (генотип 1 типа) и VR-2332 (генотип 2 типа) была неизвестна область внесения мутаций в NSP2 VR-2332, которые не оказывали значительного отрицательного воздействия. Однако выравнивание полных геномных последовательностей новых вирусов PRRS 2 типа с VR-2332 привело к появлению представлений о том, в какой области можно получить жизнеспособные мутантные формы. Дальнейший делеционный мутагенез показал, что область между аминокислотами nsp2 324-813 не является необходимой для роста in vitro.

Настоящее изобретение относится к выделенному инфекционному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:1, и делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранную из нуклеотидов от нуклеотида 2062 до нуклеотида 3864 SEQ ID NO:1. Также предусмотрен выделенный инфекционный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:14, и делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов от нуклеотида 2061 до нуклеотида 3545 SEQ ID NO:14. Выделенный полинуклеотид может находиться в векторе, в выделенной вирусной частице, находящейся в клетке, или в их сочетании. Когда полинуклеотид находится в векторе, с ним может быть функционально связан промотор РНК-полимеразы. Выделенный полинуклеотид может представлять собой РНК. Выделенный полинуклеотид может включать 2 или более делеций, и каждая делеция может независимо представлять собой по меньшей мере 37 последовательно расположенных нуклеотидов. Выделенный полинуклеотид дополнительно может включать экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции, и экзогенный полинуклеотид может кодировать полипептид, такой как детектируемый маркер.

Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:1, и по меньшей мере одну делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранную из нуклеотидов от нуклеотида 2062 до нуклеотида 3864 SEQ ID NO:1, и где полинуклеотид реплицируется и продуцирует инфекционные вирусные частицы при введении в клетку. Также предусмотрен выделенный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:14, и по меньшей мере одну делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранную из нуклеотидов от нуклеотида 2061 до нуклеотида 3545 SEQ ID NO:14, где полинуклеотид при введении в клетку реплицируется и продуцирует инфекционные вирусные частицы. Выделенный полинуклеотид может находиться в векторе, в выделенной вирусной частице, находящейся в клетке, или в их сочетании. Когда полинуклеотид находится в векторе, с ним может быть функционально связан промотор РНК-полимеразы. Выделенный полинуклеотид может представлять собой РНК. Выделенный полинуклеотид может включать 2 или более делеций, и каждая делеция может независимо представлять собой по меньшей мере 37 последовательно расположенных нуклеотидов. Выделенный полинуклеотид дополнительно может включать экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции, и экзогенный полинуклеотид может кодировать полипептид, такой как детектируемый маркер.

Настоящее изобретение дополнительно относится к инфекционному клону, имеющему полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, обладающей по меньшей мере 88% идентичностью с SEQ ID NO:1, и по меньшей мере одной делецией по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов от нуклеотида 2062 до нуклеотида 3864 SEQ ID NO:1. Также предусмотрен инфекционный клон, имеющий полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 88% идентичность с SEQ ID NO:14, и по меньшей мере одну делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов от нуклеотида 2061 до нуклеотид 3545 SEQ ID NO:14. Инфекционный клон может находиться в клетке. С полинуклеотидом может быть функционально связан промотор РНК-полимеразы. Инфекционный клон может включать 2 или более делеций, где каждая делеция независимо представляет собой по меньшей мере 37 последовательно расположенных нуклеотидов. Выделенный полинуклеотид дополнительно может включать экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции, и экзогенный полинуклеотид может кодировать полипептид, такой как детектируемый маркер.

Также настоящее изобретение относится к выделенному инфекционному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13, и к полипептиду nsp2, кодируемому инфекционным полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13.

Термины "содержат" и его варианты, когда эти термины представлены в описании и формуле изобретения, не имеют ограничивающего значения. Если нет иных указаний, форму единственного числа и термин "по меньшей мере один" используют взаимозаменяемо и они означают один или более одного.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. A. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) инфекционного полинуклеотида VR-V7 (также обозначаемого в настоящем описании как V6G7475A). B. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:2) инфекционного полинуклеотида VR-V5. C. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) инфекционного полинуклеотида VR-V5G7475A. D. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:4) инфекционного полинуклеотида VR-V6. E. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:5) инфекционного полинуклеотида MN184A. F. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:6) инфекционного полинуклеотида MN184B. G. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:7) инфекционного полинуклеотида Nsp2 Δ324-434. H. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:8) инфекционного полинуклеотида Nsp2 Δ324-523. I. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:9) инфекционного полинуклеотида Nsp2 Δ543-632. J. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:10) инфекционного полинуклеотида Nsp2 Δ633-726. L. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11) инфекционного полинуклеотида Nsp2 Δ543-726. L. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:12) инфекционного полинуклеотида Nsp2 Δ727-813. M. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:13) инфекционного полинуклеотида Nsp2 Δ324-726.

Фиг.2. Конструкция полноразмерных клонов штамма VR-2332 PRRSV. Геном, составляющий 15,4, амплифицировали в виде четырех фрагментов (I-IV), которые включали уникальные сайты расщепления ферментов рестрикции, находящиеся в вирусной кДНК (FseI, AvrII, BsrGI) или внесенные в последовательность PRRSV с 5'- и 3'-концов посредством инсерционного мутагенеза (SphI, PacI, соответственно). Промотор полимеразы T7 и 2 нематричных остатка G и остаток T расположены перед вирусной последовательностью. Вектор pOK12 (24) модифицировали с включением сайта PacI и рибозима гепатита дельта ниже полиаденозинового хвоста из 50 нуклеотидов.

Фиг.3. Схема нуклеотидных изменений инфекционных клонов или потомков свиней. Представлена диаграмма организации генома PRRSV, под которой представлены сравнения полных геномов. Предполагаемые участки расщепления неструктурных белков изображены выше ORF1a и -1b и обозначены направленными вниз стрелками. Характерные мотивы указаны ниже ORF1a и -1b направленными вверх стрелками, показывающими их расположение в геноме PRRSV [папаин-подобная цистеиновая протеаза α и β (PCPα, PCPβ); цистеиновая протеаза (CP); сериновая/3C протеаза (SP/3CP); полимераза (POL); цистеин/гистидин-богатая область (C/H); хеликаза (Hel); поли(U)-специфичная эндорибонуклеаза гомолога Xenopus laevis (XendoU); Ivanov et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 101:12694-12699 (2004); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)]. Нуклеотидные различия показаны вертикальными полосами. 1. штамм дикого типа VR-2332 (U87392) по сравнению с образованной из VR-2332 вакциной (Ingelvac® MLV или RespPRRS, AF066183). 2. штамм дикого типа VR-2332 по сравнению с pVR-V6G7475A. 3. pVR-V5 по сравнению с пассированным in vivo V5-1-P3 (Sw612). 4. штамм дикого типа VR-2332 по сравнению с Sw612. Подробно нуклеотидные изменения представлены в таблицах 4 и 5.

Фиг.4. Сероконверсия у свиньи после инфицирования PRRSV. Растущую свинью инфицировали природным штаммом дикого типа VR-2332 (□), Ingelvac® MLV (×), V5-1 P3 (Ο) или оставляли неинфицированной (■). На указанные сутки проводили забор образцов сыворотки и тестировали посредством IDEXX Elisa для выявления сероконверсии с помощью антител против нуклеокапсидного белка PRRSV.

Фиг.5. A. Анализы бляшкообразования потомков P3 (первая линия поколений) всех инфекционных клонов, а также штамма дикого типа VR-2332, показали бляшки различных размеров. B. Потомки P3 V5-1 после выращивания в свинье (Sw612) образовывали бляшки, сходные с бляшками штамма дикого типа VR-2332.

Фиг.6. A. Анализы бляшкообразования потомков P3 (вторая линия поколений) всех инфекционных клонов, а также штамма дикого типа VR-2332, показали бляшки с размерами, которые отличались от вирусных препаратов первой линии поколений. B. Титры вируса P4 указывают на потомков инфекционных клонов, которые не реплицировались как вирус штамма дикого типа VR-2332 или Sw612, несмотря на сходный размер бляшек.

Фиг.7. A. Потомков P3 штамма дикого типа VR-2332 (♦), Sw612 (▲), pVR-HN (□), pVR-V5 (×), pVR-V5G7475A (), pVR-V6 (●), pVR-V6G7475A (Ο) одновременно исследовали на одностадийную кинетику роста, как описано в примере 1. Во все моменты времени репликация вирусов штамма дикого типа VR-2332 и Sw612 происходила до титров, больших приблизительно в 10 раз. pVR-V6G7475A, без аминокислотных изменений по сравнению с природным вирусом или вакциной, продуцировал вирус, который реплицировался с более высоким титром во все моменты времени, чем у всех других потомков инфекционных клонов. Конечный титр для каждого препарата вируса представлен в дополнительной таблице.

Фиг.8. Нозерн-блот анализ различных дочерних пассажей pVR-V6G7475A, а также Sw612 и исходных транскриптов in vitro выявил гетероклиты, которые продуцируются уже в P1, и их количество совместно с геномной РНК повышается при пассировании. Однако трансрипт РНК (Tx) не содержит легко выявляемых образцов гетероклитов.

Фиг.9. A. Схематичное изображение генома PRRSV. Предполагаемые участки расщепления неструктурных белков изображены выше ORF1a и -1b и показаны направленными вниз стрелками. Характерные мотивы показаны ниже ORF1a и -1b с указанием их расположения в геноме PRRSV [папаин-подобная цистеиновая протеаза α и β (PL1); цистеиновая протеаза (PL2); сериновая/3C протеаза (3CL); полимераза (RdRp); хеликаза (Hel); поли(U)-специфичная эндорибонуклеаза гомолога Xenopus laevis (N); Ziebuhr et al., 2000; Ivanov et al., 2004; Gorbalenya et al., 2006]. B. Схематичное изображение сравнения белка ORF1 (репликаза) MN184A и MN184B и предполагаемого процессинга. В сравнение включена вырожденность, наблюдаемая в nsp2. C. Схематичное изображение сравнения белков ORF2-7 MN184A и MN184B.

Фиг.10. Выравнивание аминокислотной последовательности ORF5 дивергентных PRRSV. Темно-серыми прямоугольниками показана высокая аминокислотная консервативность (>80%; идентичными являются 16-19 остатков), средне-серыми (>60%; идентичными являются 12-15 остатков), светло-серыми (>40%; идентичными остатками являются 8-11 остатков) и незакрашенными (<40%; идентичными являются менее 8 остатков) прямоугольниками показаны менее консервативные остатки. Заштрихованной областью показана предполагаемая сигнальная последовательность, заключенными в прямоугольники областями показаны предполагаемые трансмембранные области, указаны гипервариабельные участки (HV-1 and HV-2), предполагаемая ориентация белка в вирионе указана полужирным курсивом. Консервативный остаток цистеина, который предположительно взаимодействует с M-белком, указан направленной вниз стрелкой (↓). Два консервативных предполагаемых участка N-гликозилирования обозначены звездочками и гипервариабельный участок 1 содержит штамм/изолят-специфичные участки N-гликозилирования (NxS/T). Для сравнения использовали следующие полноразмерные последовательности GenBank: VR-2332 (U87392), Ingelvac MLV (AF066183), 01NP1.2 (DQ056373), PL97-1 (AY58524), PA-8 (AF176348), SP (AF184212), BJ-4 (AF331831), HN1 (AY457635), 16244B (AF046869), HB-1 (AY150312), HB-2 (AY262352), CH-1a (AY032626), P129 (AF494042), JA142 (AY424271), SDPRRS-01-08 (AY375474), EuroPRRSV (AY366525), Lelystad (M96262), IAF-93-653 (U64931), IAF-K1op (AY184209), 98-3298 (DQ306877), 98-3403 (DQ306878), 99-3584 (DQ306879).

Фиг.11. Выравнивание аминокислотной последовательности Nsp1β дивергентных PRRSV. Происхождение фигуры и цветовая схема описаны в кратком описании фиг.10. Два полностью консервативных предполагаемых каталитических остатка указаны звездочками, и заключенными в прямоугольники аминокислотами обозначена консервативность последовательности MN184 с изолятами 1 типа и EAV. Предполагаемый сайт расщепления обозначен направленной вниз стрелкой (↓).

Фиг.12. Выравнивание аминокислотной последовательности Nsp2 дивергентных PRRSV. Полностью консервативные предполагаемые каталитические остатки цистеиновой протеазы (Cys и His) указаны звездочками, и заключенными в прямоугольники аминокислотами обозначена консервативность последовательности протеазы в PRRSV и EAV. Предполагаемые сайты расщепления указаны закрашенными стрелками (↓); дополнительные возможные сайты расщепления указаны точечной стрелкой; сигнальный пептид указан закрашенным серым прямоугольником; трансмембранные участки показаны черными прямоугольниками с точками; потенциальные участки N-гликозилирования указаны звездочкой (*). Происхождение и цветовая схема фигуры описаны в кратком описании фиг.10.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к инфекционным клонам вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) VR-2332. Как используют в настоящем описании, термин "инфекционный клон" представляет собой полинуклеотид, имеющий два компонента: последовательность вектора, которая реплицируется в прокариотической клетке-хозяине, и второй полинуклеотид, обозначаемый в настоящем описании как инфекционный полинуклеотид. После транскрипции in vitro с получением полинуклеотида РНК и введения в пермиссивную клетку инфекционный полинуклеотид реплицируется (в виде РНК) и продуцирует инфекционные вирусные частицы. Таким образом, инфекционный полинуклеотид может находиться в векторе в виде ДНК, в виде РНК в случае вирусной частицы или в виде выделенной ДНК или РНК. Термин "полинуклеотид" относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, и включают как двух-, так и одноцепочечную ДНК и РНК. Если нет иных указаний, полинуклеотид включает комплементарную ему цепь. Нуклеотидную последовательность комплементарной полинуклеотиду последовательности может легко определить специалист в данной области. Полинуклеотид может включать нуклеотидные последовательности с различными функциями, включая, например, кодирующие последовательности и некодирующие последовательности, такие как регуляторные последовательности и/или нетранслируемые области. Полинуклеотид можно получать непосредственно из природного источника, или его можно получать с помощью рекомбинантных, ферментативных или химических способов. Полинуклеотид может обладать линейной или кольцевой топологией. Полинуклеотид может представлять собой, например, часть вектора, такого как экспрессирующий вектор или вектор для клонирования, или фрагмент.

В случае природного полинуклеотида, он предпочтительно является выделенным, более предпочтительно, очищенным. "Выделенное" соединение, такое как полинуклеотид, полипептид или вирусная частица, представляет собой соединение, которое извлечено из его природных окружающих условий и отделено от них. "Очищенное" соединение представляет собой соединение, которое по меньшей мере на 60%, предпочтительно на 75% и наиболее предпочтительно на 90% не содержит других компонентов, с которыми оно ассоциировано в природе. Соединения, такие как полинуклеотиды и полипептиды, которые продуцируют вне организма, в котором они встречаются в природе, например, химическими или рекомбинантными способами, рассматривают как выделенные и очищенные согласно определению, поскольку они никогда не находились в природных окружающих условиях.

Пример инфекционного полинуклеотида по настоящему изобретению включает инфекционный полинуклеотид VR-V7 (SEQ ID NO:1). VR-V7 также обозначают в настоящем описании как V6G7475A. Другие примеры инфекционных полинуклеотидов по настоящему изобретению включают VR-V5 (SEQ ID NO:2), VR-V5G7475A (SEQ ID NO:3) и VR-V6 (SEQ ID NO:4). Следует отметить, что несмотря на то, что SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и другие вирусные нуклеотидные последовательности описаны в настоящем описании в качестве последовательностей ДНК, к настоящему изобретению относятся соответствующая последовательность РНК, а также комплементарные им последовательности РНК и ДНК.

Другие инфекционные полинуклеотиды по настоящему изобретению обладают полинуклеотидной последовательностью, имеющей структурное сходство с эталонным полинуклеотидом. Эталонные полинуклеотиды включают SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, европейский прототипный штамм вируса PRRS, Lelystad (регистрационный номер Genbank M96262; SEQ ID NO:14), и североамериканский прототипный штамм вируса PRRS, VR-2332 (регистрационный номер Genbank U87392; SEQ ID NO:15). Сходство называют "процентной идентичностью" и его определяют выравниванием остатков двух полинуклеотидов (т.е. нуклеотидной последовательности инфекционного полинуклеотида-кандидата и нуклеотидной последовательности эталонного полинуклеотида) для оптимизации количества идентичных нуклеотидов вдоль длин их последовательностей; при проведении выравнивания допускаются разрывы в любой или в обеих последовательностях в целях оптимизации количества общих нуклеотидов, хотя нуклеотиды в каждой последовательности, тем не менее, должны оставаться в их правильном порядке. В некоторых аспектах настоящего изобретения разрыв (также называемый делецией) находится в последовательности инфекционного полинуклеотида-кандидата. Инфекционный полинуклеотид-кандидат представляет собой полинуклеотид, который обладает нуклеотидной последовательностью, подлежащей сравнению с эталонным полинуклеотидом. Инфекционный полинуклеотид-кандидат можно выделять из животного, такого как свинья, инфицированная PRRSV, выделенным из культивируемой клеточной линии, или его можно получать с использованием рекомбинантных способов или химически или ферментативно синтезировать. Две нуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием любого из коммерчески доступных компьютерных алгоритмов, обычно используемых для проведения выравнивания нуклеотидных последовательностей. Предпочтительно, две нуклеотидные последовательности сравнивают с использованием программы GAP пакета программ GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc.) версии 10.3 (2001). Программа GAP использует алгоритм Needleman et al., (J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970)) для проведения выравнивания двух полных последовательностей, который максимизирует количество совпадений и минимизирует количество разрывов. Предпочтительно, для всех параметров поиска GAP используют значения по умолчанию, включая оценочную матрицу = NewsgapDNA.cmp, штраф за делецию = 50, штраф за продолжение делеции = 3, среднее значение для совпадений = 10, среднее значение для несовпадений = 0. При сравнении двух нуклеотидных последовательностей с использованием алгоритма поиска GAP структурное сходство называют "процентной идентичностью." Предпочтительно, полинуклеотид обладает структурным сходством с контрольным полинуклеотидом, составляющим по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность, когда структурное сходство определяют с использованием программы GAP.

Наличие у полинуклеотида инфекционности можно определять встраиванием инфекционного полинуклеотида-кандидата в вектор, транскрипцией инфекционного полинуклеотида-кандидата in vitro, трансфекцией пермиссивной клетки полученными молекулами РНК и детекцией вирусной РНК потомков, вирусного нуклеокапсидного белка потомков, детекцией инфекционных вирусных частиц, или их сочетания. Вектор предпочтительно обладает свойствами наличия низкого количества копий и остается стабильным после встраивания больших (например, 15 т.п.н.) вставок. Примером пригодного вектора является pOK и pOK12 (регистрационный номер GenBank AF223639, Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), и известны и доступны другие векторы, обладающие этими свойствами. В векторе инфекционный полинуклеотид-кандидат расположен непосредственно ниже промотора. Пригодные промоторы представляют собой промоторы, которые могут быть индуцированы для достижения высоких уровней транскрипции, такие как промотор РНК-полимеразы T7, например TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO:16), или промоторы РНК-полимеразы SP6 и T3. Транскрпиция инфекционного полинуклеотида-кандидата, как правило, включает расщепление эндонуклеазой рестрикции вектора для его линеаризации, и продукцию транскриптов РНК с использованием общепринятых и хорошо известных способов транскрипции in vitro. Наборы для транскрипции in vitro коммерчески доступны (например, mMessage mMachine, доступные от Ambion, Austin, TX).

После транскрипции in vitro РНК очищают с использованием общепринятых способов, а затем используют для трансфекции пермиссивной клетки. Примеры пермиссивных клеток включают, например, BHK-21 (которые позволяют один цикл продукции вирусных частиц), CL-2621, MA-104 (ATCC CRL-2378), MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477-483 (1993)), клеточные линии, клонированные из этих клеточных линий, или первичные альвеолярные макрофаги свиней. Способы эффективной трансфекции клеток включают применение бромида 1,2-димиристилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония и холестерина (DMRIE-C), и других коммерчески доступных продуктов, предпочтительно DMRIE-C. Способы эффективной трансфекции первичных альвеолярных макрофагов свиньи известны в данной области (Groot Bramel-Verheige et al., Virol., 278:380-389 (2000)). Как правило, для трансфекции можно использовать от 2 до 3 микрограмм РНК, однако можно использовать меньшие и большие количества. После подходящего периода времени наличие вирусной РНК потомков можно выявлять, например, посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Аналогично вирусный нуклеокапсидный белок потомков можно выявлять, например, с помощью специфичного к нуклеокапсиду антитела. Кроме того, наличие последующего инфицирования вирусными частицами, продуцируемыми клетками, трансфицированными инфекционным полинуклеотидом-кандидатом, другой клетки можно определять, подвергая неинфицированные пермиссивные клетки воздействию супернатанта инфицированных клеток. Необязательно, можно определять цитопатический эффект (CPE). Инфекционный полинуклеотид-кандидат рассматривают как инфекционный полинуклеотид, когда он продуцирует вирусную РНК потомков, вирусные белки потомков (нуклеокапсидный, мембранный, GP5 и другие), и инфицирует другие пермиссивные клетки.

В некоторых аспектах настоящего изобретения инфекционный полинуклеотид включает делецию нуклеотидов, кодирующих неструктурный белок 2 (nsp2), один из нескольких (12 предсказанных) полипептидов, представленных в полибелке, кодируемом ORF1. В вирусе PRRS и его инфекционных полинуклеотидах, нуклеотиды, кодирующие первую аминокислоту nsp2, можно определять идентификацией участка расщепления папаин-подобной протеазы 1-бета, для которого предсказано, что он расположен после аминокислоты глицина ORF1 в положении 383 VR-2332.

В отношении идентификации нуклеотидов, кодирующих последнюю аминокислоту nsp2, точный C-концевой для nsp2 сайт расщепления кодируемого ORF1a полибелка эмпирически не определен, таким образом, нуклеотиды, соответствующие 3'-концу кодирующей области, неизвестны. Однако было предсказано два C-концевых сайта расщепления, один Gly|Gly (где вертикальной линией между двумя остатками глицина показано положение расщепления) по аминокислоте 980 в VR-2332, и другой по аминокислоте 1197 в VR-2332. При выравнивании всех имеющихся последовательностей PRRSV существует несколько полностью консервативных дублетов Gly|Gly в этом белке, которые также могут представлять собой C-концевой для nsp2 сайт расщепления полибелка (аминокислоты 646, 980, 1116, 1196, 1197) в VR-2332. Положения дублетов Gly|Gly в других вирусах и инфекционных полинуклеотидах можно идентифицировать сравнением последовательностей nsp2 и дублетов Gly|Gly, описанных на фиг.12. Современные исследования позволяют предположить, что в nsp2 может существовать по меньшей мере 3 сайта расщепления, соответствующих аминокислотам 980, 1116, 1196 или 1197.

Полипептид nsp2 включает высококонсервативный домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы (показанный как CP на фиг.3 и PL2 на фиг.9), находящийся на N-конце, и 3-4 предсказанных трансмембранных домена рядом с C-концом nsp2 (где количество трансмембранных доменов варьирует в зависимости от расположения C-концевого сайта расщепления). Как правило, делеция нуклеотидов, кодирующих аминокислоты домена PL2 или всех предсказанных трансмембранных доменов, приводит к полинуклеотиду, который может реплицироваться в пермиссивных клетках, но не продуцирует инфекционных вирусных частиц. Таким образом, инфекционный клон по настоящему изобретению, как правило, не включает делецию всего домена PL2 или всех предсказанных трансмембранных доменов.

Нуклеотиды, кодирующие домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы, представляют собой нуклеотиды с 1474 по 1776 в VR-V7 (SEQ ID NO:1), нуклеотиды с 1474 по 1776 в VR-2332 (регистрационный номер Genbank U87392), и нуклеотиды с 1482 по 1784 в Lelystad (регистрационный номер Genbank M96262). Положение домена химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы в нуклеотидной последовательности других вирусов PRRS можно идентифицировать выравниванием аминокислотной последовательности полипептида nsp2, кодируемого вирусом PRRS, с результатом выравнивания аминокислотных последовательностей, описанным на фиг.12, и определением того, какие нуклеотиды кодируют те аминокислоты, которые выравниваются с доменом химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы. Альтернативно аминокислотные последовательности полипептидов nsp2 других вирусов PRRS можно идентифицировать выравниванием аминокислотной последовательности полипептида nsp2, кодируемого вирусом PRRS с аминокислотной последовательностью полипептидов nsp2, продуцируемых другими артеривирусами, такими как вирус артериита лошадей (EAV) и вирус повышения уровня лактатдегидрогеназы (LDV).

Нуклеотиды, кодирующие предсказанные трансмембранные домены VR-V7 (SEQ ID NO:1), VR-2332 (регистрационный номер Genbank U87392) и Lelystad (регистрационный номер Genbank M96262), представлены в таблице 1.

Таблица 1
Нуклеотиды Nsp2, кодирующие предсказанные трансмембранные домены
	VR-V7	VR-2332	Lelystad
Трансмембранный домен I	с 881 по 901	с 881 по 901	с 761 по 781
Трансмембранный домен II	с 913 по 934	с 913 по 934	с 793 по 814
Трансмембранный домен III	с 963 по 980	с 963 по 980	с 843 по 860
Трансмембранный домен IV	с 985 по 1003	с 985 по 1003	с 865 по 883

Расположение трансмембранных доменов в нуклеотидной последовательности других вирусов PRRS можно определять выравниванием аминокислотной последовательности полипептида nsp2, кодируемого вирусом PRRS, с результатом выравнивания аминокислотной последовательности, описанным на фиг.12, и определением того, какие нуклеотиды кодируют те аминокислоты, которые выравниваются с трансмембранными доменами. Альтернативно положение трансмембранных доменов можно определить с помощью компьютерного алгоритма, такого как алгоритм PredictProtein, как описано Rost et al. (Nucleic Acids Res., 32 (публикация на Web-сервере): W321-326 (2004), или алгоритм TMHMM, как описано Krogh et al. (J. Mol. Biol., 305: 567-580 (2001)), и доступный через Всемирную сеть.

Делеция, имеющаяся в инфекционных полинуклеотидах по настоящему изобретению, как правило, находится между нуклеотидами, кодирующими домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы, и нуклеотидами, кодирующими трансмембранные домены, и не приводит к сдвигу рамки считывания в рамке считывания ORF1. Как описано выше, делеция, как правило, не включает каких-либо нуклеотидов, кодирующих домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы, каких-либо нуклеотидов, кодирующих трансмембранные домены, или их сочетание. В некоторых аспектах, например, когда инфекционный полинуклеотид обладает структурным сходством с SEQ ID NO:1, 5'-граница делеции расположена в области нуклеотида 2305, нуклеотида 2205, нуклеотида 2105 или нуклеотида 2062, и 3'-граница делеции расположена в области нуклеотида 3774, нуклеотида 3804, нуклеотида 3834 или нуклеотида 3864. В других аспектах, например, когда инфекционный полинуклеотид обладает структурным сходством с SEQ ID NO:14, 5'-граница делеции расположена в области нуклеотида 2304, нуклеотида 2204, нуклеотида 2104 или нуклеотида 2061, и 3'-граница делеции расположена в области нуклеотида 3455, нуклеотида 3495, нуклеотида 3525 или нуклеотида 3545. Делеция может представлять собой по меньшей мере 39 нуклеотидов, 48 нуклеотидов или 57 нуклеотидов. В некоторых аспектах делеция может представлять собой по меньшей мере 267 нуклеотидов, по меньшей мере 276 нуклеотидов или по меньшей мере 285 нуклеотидов. В некоторых аспектах делеция составляет не более 489 нуклеотидов, не более 459, не более 429 или не более 402 нуклеотидов. Инфекционный полинуклеотид может иметь более одной делеции в участке nsp2.

Примеры инфекционных полинуклеотидов, образованных из VR-V7 и содержащих делецию, представлены в таблице 2.

Таблица 2
Инфекционные полинуклеотиды, образованные из VR-V7 (SEQ ID NO:1)
Полинуклеотид*	Делетированные нуклеотиды SEQ ID NO:1	Делетированные аминокислоты ORF1	Титры вирусов (Б.О.Е./мл)	Краткая информация о фенотипе**
Nsp2 Δ180-323	1876-2304	563-705	-	Нежизнеспособный
Nsp2 Δ242-323	2056-2304	623-705	-	Нежизнеспособный
Nsp2 Δ324-434	2305-2637	706-816	+(~105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 Δ324-523	2305-2904	706-905	+(~105-106)	Промежуточный
Nsp2 Δ543-632	2962-3231	925-1014	+(-105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 Δ633-726	3232-3513	1015-1108	+(~105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 Δ543-726	2962-3513	925-1108	+(~105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 Δ727-813	3514-3774	1109-1195	+(~10i)	Маленький размер бляшек
Nsp2 Δ324-726	2305-3513	706-1108	+(-101-2)	ND
Nsp2 Δ324-813	2305-3774	706-1195	-	Нежизнеспособный
Nsp2 Δ727-845	3514-3870	1109-1227	-	Нежизнеспособный
Nsp2 Δ324-845	2305-3870	706-1227	-	Нежизнеспособный
* делеция относится к аминокислотам nsp2, которые являются делетированными, например, в вирусе Nsp2 Δ180-323 делетированы аминокислоты 180-323 nsp2.**размер бляшек приведен относительно бляшек, образуемых VR-2332 дикого типа.

Инфекционный полинуклеотид, содержащий делецию, может включать экзогенный полинуклеотид, встроенный вместо делеции. "Экзогенный" полинуклеотид относится к чужеродной нуклеотидной последовательности, т.е. к нуклеотидной последовательности, которая в норме не представлена в вирусе PRRS или его инфекционном клоне. Экзогенный полинуклеотид может кодировать, и предпочтительно кодирует, полипептид. Пригодные экзогенные полинуклеотиды включают полинуклеотиды, кодирующие детектируемый маркер, например молекулу, которую легко выявить различными способами. Его примеры включают флуоресцентные полипептиды (например, зеленый, желтый, голубой или красный флуоресцентный белки), люциферазу, хлорамфениколацетилтрансферазу и другие молекулы (такие как c-myc, flag, 6xhis, HisGln (HQ) металл-связывающий пептид, и V5-эпитоп), выявляемые по их флуоресценции, ферментативной активности или иммунологическим свойствам, и, как правило, они пригодны при детекции в клетке, например культивируемой клетке, или в образце ткани, который извлекли из животного. Другие экзогенные полинуклеотиды, которые можно использовать, представляют собой полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, экспрессируемые другими организмами, такими как клетки и патогены. Экспрессия экзогенного полинуклеотида приводит к инфекционному полинуклеотиду, который экспрессирует чужеродные антигены. Примеры последовательностей экзогенных нуклеотидов включают последовательности, кодирующие белки