Способ формирования зуба, зубной ряд и способ формирования ткани

Способ формирования зуба, зубной ряд и способ формирования ткани

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Изобретение относится к способу формирования зуба, зубного ряда и к способу формирования ткани, в частности к способу формирования зуба, зубного ряда и к способу формирования ткани с использованием клеток.

Предшествующий уровень техники

Зуб представляет собой орган, который может быть утрачен в результате зубного кариеса, заболеваний периодонта и тому подобного и который имеет твердые ткани, такие как эмаль в самом наружном слое и дентин во внутреннем слое, и, кроме того, имеет одонтобласт, образующий дентин в более глубоком слое зуба, и зубную пульпу в сердцевине. Как правило, потеря зуба в настоящее время, в основном, компенсируется во многих случаях искусственными зубами и имплантатами, поскольку полагают, что она представляет минимальную угрозу жизни. Тем не менее существует возрастающий интерес к разработке технологии регенерации зубов ввиду значительного влияния, которое наличие или отсутствие зубов оказывает на внешний вид человека и на вкус пищи и ввиду перспективы поддержания здоровья и высокого качества жизни.

Зубы представляют собой функциональные единицы, которые образуются в результате индукции в течение процесса развития на эмбриональной стадии и составлены множеством клеточных типов, полагают, что они представляют собой такие же органы, как и внутренние органы. Таким образом, зубы не формируются системой стволовых клеток, в которой клеточные типы формируются из стволовых клеток, таких как кроветворные стволовые клетки и мезенхимные стволовые клетки, во взрослом организме, и зубы не могут быть регенерированы исключительно путем имплантации стволовых клеток (терапии путем имплантации стволовых клеток), которая в настоящее время находится в стадии разработки регенеративной медициной. Кроме того, хотя рассматривают регенерацию зубов путем идентификации гена, который специфично экспрессируется в процессе развития зуба, и искусственной индукции зубного зачатка, регенерация зуба не может быть полностью индуцирована просто путем идентификации гена.

Таким образом, недавно проведены исследования, сфокусированные на регенерации зуба путем трансплантации восстановленного зубного зачатка, полученного путем восстановления зубного зачатка с использованием изолированных клеток зубного зачатка.

Например, в непатентном документе 1 раскрыто, что ткань, подобную ткани зуба, регенерируют путем трансплантации клеток, таких как эпителиальные клетки, изолированные из зубного зачатка, и мезенхимальные клетки зубных фолликул, с биоабсорбируемым носителем в брюшную полость крысы.

В непатентном документе 2 описано, что совместное культивирование с помощью коллагенового геля эффективно в качестве системы, в которой может быть реализовано эпителиально-мезенхимное взаимодействие клетками пересеваемой культуры.

В качестве способа регенерации зубного зачатка описано, например в патентном документе 1, что клетки зубного зачатка культивируют в присутствии физиологически активных веществ, таких как факторы роста фибробластов и тому подобное. В патентном документе 2 предложено культивирование по меньшей мере одного типа клеток, выбранного из клеток зубного зачатка и клеток, которые могут быть дифференцированы в эти клетки зубного зачатка, параллельно с носителем, содержащим фибрин, и описано, что "зуб", имеющий специфическую форму, образуют путем использования носителя, содержащего фибрин, имеющего желаемую форму для зубного зачатка.

В патентных документах 3 и 4 раскрыт способ образования зубов, при котором смесь клеток зубного зачатка, содержащую мезенхимные клетки, образующие дентин, выделенные из зубной пульпы, и эпителиальные клетки, которые вносят вклад в формирование эмали, из верхней челюсти 6-месячной свиньи засевают в каркас, который представляет собой затвердевший биоразрушаемый полимер, содержащий сополимер полигликолевой кислоты/полиуксусной кислоты; и трансплантируют его в организм животного. В данных документах описано, что "зуб", имеющий специфическую форму, образуется в результате использования каркаса, имеющего желаемую форму для зубного зачатка.

Кроме того, в патентном документе 5 раскрыт способ регенерации зуба для лечения пациента с разрежением или повреждением кости. В соответствии с этим способом кость образуют путем засевания мезенхимных клеток в сетчатом носителе из полигликолевой кислоты, после чего этот носитель наслаивают эпителиальными клетками и коллагеном или завертывают его в пласт эпителиальных клеток. Кроме того, в патентном документе 5 носитель используют для конструирования формы кости.

Непатентный документ 1: J. Dent. Res., 2002, Vol.81 (10), pp.695-700.

Непатентный документ 2: "Regenerative medicine using teeth and cells derived from tooth germ and the possibility of the same," Regenerative Medicine, Journal of the Japanese Society for Regenerative Medicine, 2005, Vol.4(1), pp.79-83.

Патентный документ 1: японская выложенная патентная заявка №2004-331557.

Патентный документ 2: японская выложенная патентная заявка №2004-357567.

Патентный документ 3: публикация патентной заявки США №2002/0119180.

Патентный документ 4: публикация патентной заявки США №2004/0219489.

Патентный документ 5: международная публикация (WO) №2005/014070.

Описание изобретения

Цели изобретения

Тем не менее для функционирования в качестве ткани важно, чтобы множественные типы клеток, составляющих ткань, были расположены в правильном относительном положении (расположение клеток) и обладали направленностью в качестве ткани. Ткань, например зуб, представляет собой "внутренний орган" или "орган", формируемый путем взаимодействия между эпителиальными клетками, происходящими из зубного зачатка, и мезенхимными клетками, происходящими из клеток краниального нервного валика во время процессов дифференцировки-развития. Можно формировать нормальные зубы путем трансплантации самого зубного зачатка; тем не менее, зубы, обладающие специфичным расположением клеток и направленностью функциональной единицы, представляющей собой зуб, не могут быть регенерированы исключительно путем изоляции и культивирования клеток зубного зачатка, состоящего из множества типов клеток.

Хотя при вышеупомянутых методиках зубной зачаток реконструируют с использованием клеток, клеточных факторов и тому подобного, специфичное расположение клеток и направленность, достаточные для осуществления функций зуба, не регенерируют.

Кроме того, сложно реконструировать ткань, обладающую специфичным расположением клеток, просто путем изоляции и культивирования множества клеток, составляющих ткань.

Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка способа формирования зуба, имеющего специфичное расположение клеток, зубного ряда, полученного данным способом, и способ формирования ткани периодонта.

Кроме того, другой целью настоящего изобретения является разработка способа формирования ткани, имеющей тканеспецифичное расположение клеток.

Средства для достижения цели

Способ формирования зуба по настоящему изобретению включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, где по меньшей мере один из типов мезенхимных клеток или эпителиальных клеток происходит из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, и культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя.

Способ формирования ткани периодонта по настоящему изобретению включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, где по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, происходит из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя до того, как будет сформирован зуб и ткань периодонта, примыкающая к зубу, и изоляцию ткани периодонта, полученной путем культивирования.

Зубной ряд по настоящему изобретению получают путем расположения первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, где по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, происходит из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй тип клеток, выбранный из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, и культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя.

При обоих вышеупомянутых способах формирования зуба или зубного ряда предпочтительно, чтобы вышеупомянутые как первая клеточная масса, так и вторая клеточная масса происходили из зубного зачатка.

Кроме того, вышеупомянутые как первая клеточная масса, так и вторая клеточная масса могут представлять собой массу отдельных клеток.

Кроме того, способ формирования ткани по настоящему изобретению представляет собой способ формирования ткани, образованной в результате взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, где этот способ включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, и культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя.

При вышеупомянутом способе формирования ткани предпочтительно, чтобы по меньшей мере один из вышеупомянутых типов мезенхимных клеток и эпителиальных клеток представлял собой клетки, происходящие из целевой ткани.

Кроме того, вышеупомянутая ткань характеризуется тем, что она выбрана из группы, состоящей из зуба, волоса, почки, легкого и печени.

В настоящем изобретении, поскольку клеточные массы, по существу содержащие только мезенхимные клетки или эпителиальные клетки, располагают и культивируют внутри поддерживающего носителя в контакте друг с другом, каждая из клеточных масс растет внутри поддерживающего носителя, не смешиваясь с клетками, составляющими другую клеточную массу, тогда как состояние контакта между этими массами сохраняется. Это обеспечивает возможность эффективного воспроизведения отличного взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, необходимого при образовании ткани.

В результате может быть получена ткань, имеющая специфичное расположение клеток для целевой ткани. Кроме того, зуб или зубной ряд, имеющий специфичное расположение клеток, при котором эмаль находится снаружи и дентин внутри, может быть получен, когда по меньшей мере один из типов мезенхимных клеток и эпителиальных клеток происходит из зубного зачатка.

Эффект(ы) изобретения

В соответствии с настоящим изобретением может быть предложен способ формирования зуба, имеющего специфичное расположение клеток, зубного ряда, полученного при помощи этого способа, и способ формирования ткани периодонта.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением может быть предложен способ формирования ткани, имеющей расположение клеток, специфичное для этой ткани.

Краткое пояснение чертежей

[Фиг.1] Фиг.1 представляет собой схематическую диаграмму, демонстрирующую образование зубного зачатка.

[Фиг.2] (A)-(D) представляют собой схематические изображения, по существу демонстрирующие способ реконструкции зубного зачатка с использованием мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, в соответствии с Примерами по настоящему изобретению.

[Фиг.3] Фиг.3 демонстрирует фазово-контрастные изображения и окрашенные изображения нормальных тканей зубного зачатка и изображения окрашивания в зависимости от времени для зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу нормального зубного зачатка в соответствии со сравнительным Примером 1 по настоящему изобретению.

[Фиг.4] Фиг.4 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображения окрашивания в зависимости от времени зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 1 по настоящему изобретению.

[Фиг.5] Фиг.5 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальной ткани, выделенной из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка мыши GFP, и изображение окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 1 по настоящему изобретению.

[Фиг.6] Фиг.6 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка мыши GFP, и мезенхимных тканей, выделенных из зубного зачатка, и изображение окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 2 по настоящему изобретению.

[Фиг.7] Фиг.7 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображение окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 3 по настоящему изобретению.

[Фиг.8] Фиг.8 демонстрирует фазово-контрастные изображения эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных тканей, выделенных из зубного зачатка, и цветные изображения на 14-е сутки после трансплантации в индивидуальную субренальную капсулу каждой из вышеуказанных тканей в соответствии со сравнительным Примером 2 по настоящему изобретению.

[Фиг.9] Фиг.9 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка низкой плотности, восстановленного с использованием эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображения окрашивания на 20-е сутки после трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка низкой плотности, в соответствии со сравнительным Примером 3 по настоящему изобретению.

[Фиг.10] Фиг.10 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного путем восстановления эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, при высокой плотности и без компартментализации, и изображения окрашивания на 20-е сутки после трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка низкой плотности в соответствии со сравнительным Примером 4 по настоящему изобретению.

[Фиг.11] Фиг.11 демонстрирует изображения окрашивания альвеолярного отростка и корневой оболочки, которые представляют собой ткани периодонта, образованные вокруг зуба, сформированного из восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примерами 1-3 по настоящему изобретению.

[Фиг.12] Фиг.12 демонстрирует изображения окрашивания обнаруженной мРНК периостина, специфичного для корневой оболочки, которая представляет собой ткань периодонта, образованную вокруг зуба, сформированного из восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 2 по настоящему изобретению (17-е сутки после трансплантации) и сравнительным Примером 1 (14-е сутки после трансплантации).

[Фиг.13] Фиг.13 демонстрирует фазово-контрастные изображения и изображения окрашивания зуба, сформированного при помощи органной культуры путем продления процесса культивирования после получения восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примерами 4 и 5 по настоящему изобретению и сравнительным Примером 5.

[Фиг.14] Фиг.14 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображения окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 6 по настоящему изобретению.

[Фиг.15] (А) представляет собой изображение окрашивания для нетрансплантированной мыши на 14-е сутки после удаления зуба по настоящему изобретению и (В) представляет собой увеличенное изображение области, ограниченной рамкой в (А), в соответствии со сравнительным Примером 6.

[Фиг.16] Фиг.16 демонстрирует изображения окрашивания на 14-е сутки после трансплантации индивидуально выделенного зубного зачатка в ротовую полость в соответствии с Примером 6 по настоящему изобретению.

[Фиг.17] Фиг.17 демонстрирует изображения окрашивания на 14-е сутки после трансплантации индивидуально выделенного зуба в ротовую полость в соответствии с Примером 7 по настоящему изобретению.

[Фиг.18] Фиг.18 демонстрирует фазово-контрастные изображения волосяного фолликула, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и мезенхимных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и изображения окрашивания на 14-е сутки волоса, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного волосяного фолликула, в соответствии с Примером 8 по настоящему изобретению.

[Фиг.19] Фиг.19 демонстрирует стереоскопические микроскопические изображения на 14-е сутки волосяного фолликула, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного волосяного фолликула из эпителиальных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и мезенхимных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, в соответствии с Примером 8 по настоящему изобретению.

[Фиг.20] Фиг.20 демонстрирует фазово-контрастные изображения волосяного фолликула, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и мезенхимных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, в соответствии со сравнительным Примером 7 по настоящему изобретению, и изображения окрашивания на 14-е сутки волосяного фолликула, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного волосяного фолликула.

Наилучший способ реализации изобретения

Способ формирования зуба по настоящему изобретению включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, в которой по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, выделен из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей другой тип клеток, выбранный из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом (процесс расположения), а также культивирование вышеупомянутой первой и второй клеточной массы внутри вышеупомянутого поддерживающего носителя (процесс культивирования).

При настоящем способе формирования зуба, поскольку мезенхимные клетки и эпителиальные клетки выращивают в виде клеточных масс в поддерживающем носителе и в контакте друг с другом, причем по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, происходит из зубного зачатка, взаимодействие между клетками может быть эффективно осуществлено благодаря состоянию тесного контакта между ними, и может быть сформирован зуб, имеющий расположение клеток, специфичное для зубов, при котором дентин находится внутри, а эмаль снаружи.

В настоящем изобретении термин "зуб" относится к ткани, имеющей слой дентина внутри и прилегающий слой эмали снаружи, и предпочтительно к ткани, имеющей эти слоистые структуры, а также направленность, имеющую коронку и корень. Специалисты в данной области техники легко могут идентифицировать дентин и эмаль морфологически путем окрашивания ткани и тому подобного. Кроме того, эмаль может быть идентифицирована по наличию энамелобласта, и наличие энамелобласта может быть подтверждено присутствием амелогенина. С другой стороны, дентин может быть идентифицирован по наличию одонтобласта, и наличие одонтобласта может быть подтверждено по наличию сиалопротеина дентина. Наличие амелогенина и сиалопротеина дентина легко может быть подтверждено при помощи способа, хорошо известного в данной области техники, например гибридизации in situ, окрашивания антителами и тому подобного.

Кроме того, направленность зуба может быть идентифицирована по расположению коронки и корня. Коронка и корень могут быть подтверждены на основании визуально наблюдаемой формы и окрашивания ткани.

Дополнительно в настоящем изобретении термин "ткань периодонта" относится к альвеолярному отростку и корневой оболочке, которые образованы, в основном, в наружном слое зуба. Альвеолярный отросток и корневая оболочка легко могут быть идентифицированы морфологически специалистами в данной области техники путем окрашивания ткани или тому подобного.

Кроме того, в настоящем изобретении термин "мезенхимные клетки" относится к клеткам, имеющим происхождение из мезенхимной ткани, а "эпителиальные клетки" относится к клеткам, имеющим происхождение из эпителиальной ткани.

В настоящем изобретении термины "зубной зачаток" и "зубная почка" представляют собой выражения, используемые по отношению конкретно к зубному зачатку и зубной почке, которые являются отличимыми от другой ткани на основе описанной позже стадии развития. В этом случае "зубной зачаток" относится к зародышу зуба ранней стадии, который предназначен для того, чтобы стать зубом в будущем, и к ткани от стадии почки до стадии колокола при типичных стадиях развития зуба, и, в частности, к ткани, в которой не идентифицируется аккумуляция дентина и эмали, которые являются признаками зуба как твердой ткани. "Зубная почка" относится к ткани в отношении перехода между стадиями "зубного зачатка", используемыми в настоящем изобретении, и к ткани между стадиями, на которых начинается аккумуляция дентина и эмали, которые являются признаками твердой ткани зуба, и стадией, предваряющей прорастание зуба из десны с проявлением типичных функций зуба.

Зубной зачаток, как показано на Фиг.1, развивается в процессе онтогенеза через каждую из стадий: стадию почки, стадию мешочка, раннюю стадию колокола и позднюю стадию колокола. На стадии почки эпителиальные клетки впячиваются с оборачиванием вокруг мезенхимных клеток (см. (А) и (В) Фиг.1), и часть эпителиальных клеток становится наружной эмалью, а часть мезенхимных клеток начинает образовывать дентин внутри (см. (С) и (D) Фиг.1) по мере продвижения к ранней стадии колокола и поздней стадии колокола. Таким образом, зубной зачаток образуется в результате взаимодействия между эпителиальными клетками и мезенхимными клетками.

Мезенхимные клетки и эпителиальные клетки в настоящем изобретении могут представлять собой клетки на стадиях от вышеупомянутой стадии почки до поздней стадии колокола, на которых образуется или может образоваться зубной зачаток (далее просто называемый "зубной зачаток"), и с точки зрения уровня незрелости и однородности на стадиях дифференциации клеток предпочтительно, чтобы они находились на стадиях от стадии почки до стадии мешочка.

Кроме того, термин "клеточная масса" относится к состоянию, в котором клетки плотно упакованы, и может относиться к состоянию ткани или к состоянию отдельных клеток. Дополнительно термин "по существу содержащий" означает, что что-либо иное, кроме целевых клеток, исключено в наибольшей возможной степени. Поскольку каждая клеточная масса может представлять собой саму ткань или ее часть, либо массу отдельных клеток, любая из клеточных масс может представлять собой клеточную массу, состоящую из отдельных клеток, либо обе клеточные массы могут представлять собой клеточные массы, состоящие из отдельных клеток; тем не менее, в целях эффективного достижения реконструкции ткани по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы обе клеточные массы состояли из отдельных клеток.

Любая из первой клеточной массы или второй клеточной массы может представлять собой эпителиальные клетки или мезенхимные клетки, и число клеток, составляющих клеточную массу, может варьировать в зависимости от вида животного, а также от типа, жесткости и размера поддерживающего носителя, но, как правило, оно может составлять от 10¹ до 10⁸ клеток на клеточную массу, и предпочтительно составляет от 10³ до 10⁸ клеток на клеточную массу.

В процессе расположения первую клеточную массу и вторую клеточную массу располагают внутри поддерживающего носителя в контакте друг с другом.

В процессе расположения при способе формирования по настоящему изобретению, поскольку вышеупомянутые первую и вторую клеточные массы располагают внутри поддерживающего носителя, который может поддерживать состояние контакта клеток, клетки, составляющие каждую клеточную массу, не смешиваются с клетками, составляющими другую клеточную массу. Таким образом, в процессе расположения каждая клеточная масса располагается без смешивания с другой, и между клеточными массами образуется пограничная поверхность. Такой способ расположения в настоящем описании подходящим образом обозначают как "компартментализацию".

В этом случае первую клеточную массу и вторую клеточную массу готовят в независимых процессах подготовки (первом процессе подготовки и втором процессе подготовки) таким образом, что каждая из клеточных масс по существу может состоять из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток.

По меньшей мере один из типов мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, использованных при настоящем способе формирования, может происходить из зубного зачатка с целью воспроизведения расположения клеток in vivo с образованием зуба, имеющего специфическую структуру и направленность; тем не менее, в целях обеспечения формирования зуба наиболее предпочтительно оба типа мезенхимных клеток и эпителиальных клеток происходят из зубного зачатка.

Примеры мезенхимных клеток, имеющих иное происхождение, чем из зубного зачатка, включают клетки, выделенные из других мезенхимных тканей in vivo; предпочтительно клетки костного мозга, не включающие клетки крови, или мезенхимные стволовые клетки; более предпочтительно мезенхимные клетки в ротовой полости и клетки костного мозга внутри челюстной кости и мезенхимные клетки, происходящие из клеток краниального нервного валика; а также мезенхимные клетки-предшественники, которые могут генерировать вышеупомянутые мезенхимные клетки, их стволовые клетки и тому подобное.

Кроме того, примеры эпителиальных клеток, выделенных из тканей, иных, чем зубной зачаток, включают клетки, выделенные из других эпителиальных тканей in vivo; предпочтительно эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки или десны в ротовой полости; и более предпочтительно незрелые эпителиальные клетки-предшественники, которые могут продуцировать дифференцированные эпителиальные клетки, например кератинизированные или паракератинизированные эпителиальные клетки кожи и слизистой оболочки; например некератинизированные эпителиальные клетки и их стволовые клетки и тому подобное.

Зубной зачаток и другие ткани могут быть собраны из челюстной кости различных животных, таких как млекопитающие-приматы, такие как люди и обезьяны; копытные животные, такие как свиньи, коровы и лошади; небольшие млекопитающие-грызуны, такие как мыши, крысы и кролики. При сборе зубного зачатка и ткани условия, обычно используемые при сборе ткани, могут быть применены без модификации, и зубной зачаток и ткань могут быть выделены в стерильных условиях и сохранены в подходящем консервирующем растворе. Кроме того, примеры человеческого зубного зачатка включают фетальный зубной зачаток, а также третий моляр или так называемый зуб мудрости, но предпочтительно использовать зубной зачаток зуба мудрости с точки зрения использования аутогенной ткани.

Получение мезенхимных клеток и эпителиальных клеток из такого зубного зачатка начинают путем разделения зубного зачатка, который был изолирован от окружающей ткани, на мезенхимную ткань зубного зачатка и эпителиальную ткань зубного зачатка в соответствии с их формами. Ткани зубного зачатка могут быть легко разделены путем разрезания или разрывания с использованием анатомических ножниц, пинцетов или тому подобного, поскольку можно структурно идентифицировать ткани зубного зачатка под микроскопом. Кроме того, отделение мезенхимной ткани зубного зачатка и эпителиальной ткани зубного зачатка от зубного зачатка легко может быть осуществлено путем разрезания или разрывания с использованием инъекционных игл, вольфрамовых игл, пинцетов или тому подобного, в соответствии с их формами.

Предпочтительно можно использовать ферменты, чтобы легко отделить клетки зубного зачатка от окружающей ткани и/или для отделения эпителиальной ткани и мезенхимной ткани от ткани зубного зачатка. Примеры ферментов, используемых в таких применениях, включают диспазу, коллагеназу, трипсин и тому подобное.

Мезенхимные клетки и эпителиальные клетки могут быть получены в состоянии отдельных клеток соответственно из мезенхимной ткани и эпителиальной ткани. В процессе получения можно использовать ферменты, чтобы сделать клетки легко диспергируемыми в виде отдельных клеток. Примеры таких ферментов включают диспазу, коллагеназу, трипсин и тому подобное. В этом случае для отделения эпителиальных клеток от эпителиальной ткани предпочтительно осуществлять обработку трипсином и обработку ДНКазой после обработки коллагеназой. С другой стороны, для отделения мезенхимных клеток от мезенхимной ткани предпочтительно одновременно осуществлять обработку коллагеназой и обработку трипсином и в конечном итоге осуществлять обработку ДНКазой. В этом случае осуществляют обработку ДНКазой в целях предотвращения уменьшения количества выделенных клеток в результате агрегации клеток, вызванной ДНК, высвобождаемой в раствор после лизиса клеточной мембраны, после того, как некоторые из клеток повреждаются в результате ферментативных обработок.

Дополнительно мезенхимные клетки и эпителиальные клетки могут представлять собой клетки, которые подвергнуты предварительному культивированию перед процессом расположения с целью получения достаточно большого количества каждого типа клеток. В культуре мезенхимных клеток и эпителиальных клеток могут применяться обычные условия, такие как температура, используемые в культуре животных клеток, без модификации.

В качестве среды, используемой в культуре, можно использовать среду, обычно используемую для культур животных клеток, такую как среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM). Может быть добавлена сыворотка для стимуляции клеточной пролиферации, или в качестве альтернативы сыворотке могут быть добавлены клеточные факторы роста, такие как фактор роста фибробластов (FGF), эпителиальный фактор роста (EGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF) и тому подобное, или хорошо известные компоненты сыворотки, такие как трансферин. Дополнительно, когда добавляют сыворотку крови, концентрацию сыворотки можно соответствующим образом менять в зависимости от культуральных условий, но обычно она может составлять 10%. Для клеточной культуры могут быть применены условия культивирования, обычно используемые в культурах, такие как культура в инкубаторе при 5% концентрации С02 при 37°С. Кроме того, если пригодно, могут быть добавлены антибиотики, такие как стрептомицин.

В качестве поддерживающего носителя, используемого в настоящем изобретении, может быть использован поддерживающий носитель, в котором можно культивировать клетки, и предпочтительной является смесь с вышеупомянутой культуральной средой. Примеры таких поддерживающих носителей включают коллаген, фибрин, ламинин, смесь внеклеточного матрикса, полигликолевую кислоту (ПГК), полимер молочной кислоты (ПМК), сополимер молочной кислоты/гликолевой кислоты (МКГК), Cellmatrix (торговое название), Mebiol Gel (торговое название) и Matrigel (торговое название). Эти поддерживающие носители могут иметь жесткость, которая по существу может поддерживать приблизительную локализацию, при которой клетки располагают внутри носителя, и их примеры включают носители гелеобразного типа, волокнистого типа и твердого типа. В этом случае уровень жесткости, который может поддерживать локализацию клеток, может представлять собой уровень жесткости, обычно применяемый в трехмерной культуре; другими словами, уровень жесткости, который не ингибирует гипертрофию клеток вследствие пролиферации при поддержании расположения клеток, и этот уровень жесткости легко определяют. Например, в случае коллагена использование при конечной концентрации 2,4 мг/мл обеспечивает подходящий уровень жесткости.

Дополнительно в этом случае поддерживающий носитель может иметь толщину, достаточную для первой и второй клеточной масс для роста внутри носителя, и ее установка пригодно основана на размере целевых тканей.

Кроме того, поддерживающий носитель может представлять собой носитель, который может поддерживать состояние контакта между клетками. Здесь "состояние контакта" предпочтительно представляет собой состояние высокой плотности для обеспечения межклеточного взаимодействия внутри каждой клеточной массы или между клеточными массами.

Состояние высокой плотности относится к плотности, подобной плотности в момент времени, когда формируется ткань, такой как в случае клеточных масс от 5×10⁷ до 1×10⁹/мл в момент расположения клеток, предпочтительно от 1×10⁸ до 1×10⁹/мл, для обеспечения взаимодействия между клетками без потери клеточной активности, и наиболее предпочтительно от 2×10⁸ до 8×10⁸/мл. Для приготовления клеточной массы при такой плотности клеток предпочтительно агрегировать клетки путем центрифугирования и иметь их осадок, поскольку это удобно для обеспечения высокой плотности без потери клеточной активности. Центрифугирование можно проводить при частоте вращения, эквивалентной центробежной силе от 300 до 1200 × g, которая не будет препятствовать выживанию клеток, и предпочтительно от 500 до 1000 × g, в течение от 3 до 10 минут. Центрифугирование при центробежной силе ниже, чем 300 × g, может привести к недостаточному осаждению клеток, и плотность клеток может оказаться низкой, тогда как центрифугирование при центробежной силе выше 1200 × g может привести к повреждению клеток и, таким образом, ни один из этих случаев не является предпочтительным.

При получении высокой плотности клеток путем центрифугирования это центрифугирование, как правило, проводят после приготовления суспензии отдельных клеток в контейнерах, таких как пробирки, используемые для центрифугирования клеток, и надосадочную жидкость удаляют в наибольшей возможной степени, оставляя клетки в виде осадка. Предпочтительно, чтобы контейнеры, такие как пробирки, были покрыты силиконом с точки зрения полного удаления надосадочной жидкости.

Когда осадки получают путем центрифугирования, эти осадки можно непосредственно располагать внутри поддерживающего носителя. Здесь компоненты, иные чем целевые клетки (например, культуральный раствор, буферный раствор, поддерживающий носитель и тому подобное), предпочтительно имеют объем, равный или меньший, чем объем клеток, и наиболее предпочт