Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс

Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс

Реферат

Изобретение относится к способу получения биологически активного комплекса и биологически активному белково-полипептидному комплексу. Данный комплекс представляет собой биологически активную субстанцию, получаемую из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных для фармацевтического производства препаратов, стимулирующих физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях центральной и периферической нервной системы и способу ее получения.

В настоящее время, на фоне неуклонного роста заболеваний нервной системы сосудистого, токсического, инфекционного и аутоиммунного генеза, не существует препаратов группы прямых репарантов, специфичных для нервной ткани. Целью данного изобретения явилось создание биологически активной субстанции, обладающей тканеспецифическим репаративнорегенеративным действием на нервную ткань, путем выделения белково-полипептидного комплекса из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных.

Субстанция представляет собой биологически активный белково-полипептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа и содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, с общей концентрацией белка 0,8-4,2 мг/мл. Субстанция получена путем ионообменной хроматографии фильтрата гомогената ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности.

Биологическая и фармакологическая активность заявляемого белково-пептидного комплекса осуществляется за счет наличия эффективных концентрационных соотношений водорастворимых отрицательно заряженных слабо кислых, нейтральных белков и полипептидов, относящихся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, обеспечивая тем самым тканеспецифическое репаративно-регенеративное действие.

Известен целый ряд препаратов белково-пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающих ноотропной и нейрометаболической активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы. К этим препаратам относятся:

1. Церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов, фирмы «Ebewe» (Австрия) [1], который является продуктом обработки мозга интактных свиней.

2. Цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина) [2], который является продуктом обработки мозга эмбрионов животных.

3. Кортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия) [3], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием.

4. Церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепараг) [4], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.

В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (-85%), низкомолекулярные пептиды (-15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 Дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойствами препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатками известного препарата являются значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.

В состав «Цереброкурина» входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают исходя из контрольной пробы получаемого средства и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с Церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза, данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применении препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов на этапах получения Цереброкурина, а также неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов протеолиза ткани.

В состав «Кортексина» входит комплекс водорастворимых биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота, путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивании с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта.

Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то, что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМК-позитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессорных воздействий. Кортексин имеет не высокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения.

В состав «Церебролизата» также входят водорастворимые полипептиды, как результат гидролиза коры головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15000 Да. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.

Задачей настоящего изобретения является создание биологически активной субстанции с расширенными свойствами и высокой биологической активностью, обладающей тканеспецифическим репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, и разработка способа ее получения путем выделения биологически активного белково-полипептидного комплекса из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, которая решается за счет выбранной совокупности действий и режимов. Особенно важным оказалось определение оптимальных сроков гестации эмбрионального мозга, а также подбора реагентов, их доз, режимов экстракции, буферизации и регуляции протеолитической активности для сохранения эффективных концентрационных соотношений белков и полипептидов, закрепленных эволюционно и определяющих биологическую активность субстанции, обеспечивая репаративно-регенеративное тканеспецифическое действие.

Поставленная задача достигается соблюдением всех параметров заготовки и характеристик сырья, а также заявленного способа получения субстанции из эмбрионального мозга копытных сельскохозяйственных животных на определенных сроках гестации, биологическая активность которой доказана экспериментально.

Предлагаемый способ получения биологически активного белково-полипептидного комплекса заключается том, что быстрозамороженный мозг эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности, размораживают и поэтапно при режимах температур от 2° до 28°С:

- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в объемных соотношениях раствора и ткани не менее 1:0,5;

- отделяют гомогенат от нерастворившихся тканевых и клеточных компонентов центрифугированием при значении g в интервале 10000-30000 в течение 90-30 мин, соответственно;

- фильтруют супернатант поэтапно, заканчивая фильтрами с величиной пор не более 0,45 мкм;

- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы солевой буферный раствор, разделяя связавшиеся с сорбентом белки и полипептиды ступенчатым градиентом с помощью элюента, имеющего ионную силу в интервале от 0,08 до 0,26 моль/л и рН от 5,2 до 8,5, повышая ионную силу подвижной фазы с шагом 0,02 моль/л, начиная собор целевых фракций с раствором, ионная сила которого не ниже 0,1;

- собранные целевые фракции обессоливают методом диализа или гель-фильтрации и после добавления консервантов с бактериостатическим и фунгицидным действием в общей концентрации не более 0,06 мг/мл и солюбилизатора в общей концентрации не более 0,01 мг/мл проводят ультрафильтрацию с величиной пор не более 0,22 мкм и стерильно упаковывают.

Другим изобретением заявленной группы является сам биологически активный белково-полипептидный комплекс, полученный вышеуказанным способом, обладающий тканеспецифическпм репаративным действием на нервную ткань и включающий отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющие его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, и характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.

При выделения целевого продукта важно, чтобы на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 5,2-8,5; обязательное присутствие в буферном растворе, на стадии гомогенизации и экстракции детергентов и ингибиторов протеолиза в достаточных концентрациях; на стадии анионообменной хроматографии использовались в качестве подвижной фазы растворы, имеющие ионную силу в интервале от 0,08 до 0,26 моль/л, с шагом 0,02 моль/л, рН от 5,2 до 8,5 и сбор целевых фракций начинался с элюента, ионная сила которого не ниже 0,1; в полученных целевых фракциях содержатся белки и полипептиды с молекулярными массами от 5 кДа до 200 кДа, причем содержание в комплексе белков и полипептидов с молекулярными массами от 10 кДа до 120 кДа было не менее 80% от общего содержания белка; полученный комплекс характеризуется наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле, а также наличием протеолитической активности входящих в него протеолитических белков; в качестве сырья использовался быстрозамороженный эмбриональный мозг копытных сельскохозяйственных животных со сроком гестации от конца первой трети до середины последней трети беременности. При других параметрах белково-полипептидный состав комплекса и концентрационные соотношения входящих биологически активных компонентов будут иными.

Выделяемая биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс, отличается от полученных ранее субстанций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сроках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций, их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по биологической и фармакологической активности, по специфичности этой активности. Выделенный методом анионообменной хроматограии, позволяющей получать целевые фракции водорастворимых белков и полипептидов, уровень заряда которых зависит от ионной силы элюента, белково-пептидный комплекс состоит из слабокислых и нейтральных протеиновых и полипептидных компонентов за счет эмпирически подобранных условий, описанных выше. Одной из отличительной особенностью в получаемом комплексе является наличие достаточно больших молекул протеинов (до 200 кДа) с отсутствием аллергезирующих и иммунотоксических свойств, что в первую очередь связано с характеристиками органоспецифического сырья (быстрозамороженный эмбриональный мозг на определенных стадиях гестации органа). Именно характеристики сырья, из которого выделяется заявляемый белково-полипептидный комплекс, обуславливают не только наличие необходимых для получения всего спектра биологической активности составляющих - факторов роста, дифференцировки тканей и клеток, сигнальных молекул, но и их концентрационные соотношения. Причем несмотря на то что на разных стадиях гестации в определенной мере меняется качественный белково-полипептидный состав эмбрионального мозга, как сырья для выделения, при заявленном способе получения целевые компоненты, оставаясь в эволюционно закрепленных концентрационных соотношениях, обеспечивают необходимую биологически активную активность субстанции. Изменение характеристик сырья и параметров получения заявляемого белково-пептидного комплекса не только значительно снижает его биологическую активность, но и может проявится в нежелательных явлениях, таких как канцерогенность, аллергенность, иммунотоксичность и др. Лиофильное высушивание заявляемой биологически активной субстанции также значительно (до 70%) снижает его биологическую, ткане- и органоспецифическую активность.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга овец. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов ягнят сроком гестации 16-18 недель размораживают и гомогенизируют в 1000 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 1 мМ этилендиамино-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 минут при 4°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 20 000 g в течение 60 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05 М глициново-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом 0,05 М глициново-фосфатного буфеpa pH 8,0, содержащего 0,04 М КСl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракций с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH, pH 7,4, до концентрации белка 1,2 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до его общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 82% имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа. Аминокислотный анализ (%): Asp - 10,82+2,5; Thr - 5,4+1,2; Ser - 5,2+1,3; Glu - 16,2+3,1; Pro - 7,045+2,4; Gly - 5,2+2,2; Ala - 5,4+1,2; Val - 7,08+2,7; Met - 2,65+1,3; He - 4,45+1,5; Leu - 9,4+2,2; Туr - 4,02+1,1; Phe - 4,8+1,3; Orn - 0,48+0,1; Lys - 8,48+2,1; His - 2,8+0,8; Arg - 6,52+2,1.

Пример 2. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 20 до 22-х недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ Трис-малеатного буферного раствора, рН 5,8, содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% мальтозу, в течение 5 минут при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30000 g в течение 30 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М NaCl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракций с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 250 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-NaOH, рН 7,4, до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до его общей концентрации 0,005 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 82% имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа. Аминокислотный анализ полученного комплекса (%): Asp - 10,82+1,3; Thr - 5,4+0,9; Ser - 5,2+1,1; Glu - 16,2+1,9; Pro - 7,045+1,7; Gly - 5,2+0,8; Ala - 5,4+1,1; Val - 7,08+2,3; Met - 2,65+0,6; He - 4,45+0,8; Leu - 9,4+2,5; Туr - 4,02+0,6; Phe - 4,8+1,1; Orn - 0,48+0,1; Lys - 8,48+2,3; His - 2,8+0,7; Arg - 6,52+2,1.

Пример 3. Влияние биологически активного комплекса (препарата) на развитие эксплантатов головного мозга.

Эксперименты проведены на 52 фрагментах коры головного мозга и 40 фрагментах спинномозговых ганглиев 10-12-суточных эмбрионов цыпленка. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты коры головного мозга или спинномозговых ганглиев помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли исследуемый белково-полипептидный комплекс и как положительный контроль - церебролизин и кортексин в концентрациях 0,5, 1,2, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%. Зону роста контрольных эксплантатов головного мозга составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки. При исследовании непосредственного влияния препаратов на фрагменты головного мозга были поставлены следующие серии опытов. В питательную среду эксплантатов коры головного мозга и спинномозговых ганглиев эмбрионов цыплят добавляли церебролизин и кортексин в различных концентрациях. На 3-и сутки культивирования с добавлением церебролизина при концентрации 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 24±3,5%, по сравнению с контрольными значениями ИП. Достоверных значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций церебролизина не наблюдалось. На 3-и сутки культивирования с добавлением кортексина при концентрации 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 32±4%, по сравнению с контрольными значениями ИП. Отмечалось достоверное повышение ИП эксплантантов коры головного мозга при концентрации кортексина 100 нг/мл на 28+3,5%, концентрации 200 нг/мл на 23+2%. Достоверные значения ИП эксплантатов коры при действии других концентраций кортексина не наблюдались. Отчетливая стимуляция развития эксплантатов коры головного мозга выявилась при действии исследуемого комплекса в концентрации 20 нг/мл, когда ИП экспериментальных эксплантатов на 48±4,5% был достоверно выше, чем ИП контрольных эксплантатов и эксплантатов сравнения при действии кортексина и церебролизина. При добавлении церебролизина в среду для культивирования эксплантатов спинномозговых ганглиев достоверного увеличения ИП эксплантатов не отмечалось, в то время как при добавлении в среду кортексина наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 22±3%. При добавлении исследуемого комплекса в среду для культивирования эксплантатов спинномозговых ганглиев наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 36±3,5%. При исследовании эксплантатов коры головного мозга и спинномозговых ганглиев на более длительных сроках культивирования - 7 дней - выявились те же эффекты нейрит-стимулирующего действия в тех же концентрациях исследуемого комплекса. Таким образом, в отношении тканей головного мозга наблюдалось уменьшение порога эффективных концентраций для исследуемого белково-полипептидного комплекса по сравнению с церебролизином и кортексином. Так увеличение зоны роста эксплантатов фрагментов коры головного мозга выявлялось при действии церебролизина только в концентрации 100 нг/мл, кортексина только в концентрациях 50 и 100 нг/мл, а при действии исследуемого белково-полипептидного комплекса - в концентрации 20, 10, 50 и 100 нг/мл соответственно. При этом интенсивность стимулирующего действия белково-полипептидного комплекса была достоверно выше, чем кортексина и церебролизина. На увеличение зоны роста эксплантатов спинномозговых ганглиев церебролизин достоверного действия не оказывал, кортексин достоверно увеличивал ИП на 24%, в то время как исследуемый белково-полипептидный комплекс способствовал увеличению ИП на. 36%. Это свидетельствует о выраженном и направленном стимулирующем действии препарата на нейроны различных отделов головного мозга.

Пример 4. Изучение токсичности биологически активного комплекса.

Общетоксическое действие белково-полипептидного комплекса исследовали в режимах острой токсичности при однократном введении, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении комплекса [5]. Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Комплекс вводили животным однократно внутримышечно в дозах 5 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг, 500 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. Животным контрольной группы в том же объеме вводили стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор, рН 7,5. Исследование по изучению подострой токсичности проведено на 95 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили белково-полипептидный комплекс внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кт, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора, рН 7,5. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор, рН 7,5. До введения комплекса и на 30, 60 и 90 сутки после начала введения у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев на 112 морских свинках-самцах с массой тела 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно белково-полипептидный комплекс в течение 6 мес в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора, рН 7,5. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор, рН 7,5, в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга. При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого комплекса животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте комплекса.

Изучение подострой и хронической токсичности комплекса свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при его длительном применении в дозах, превышающих предполагаемую терапевтическую в 3000 раз. При исследовании влияния комплекса на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены. Следовательно, белково-полипептидный комплекс, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.

Пример 5. Мутагенность субстанции.

Для оценки мутагенных свойств заявляемого белково-полипептидного комплекса применили набор следующих тестов: - учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100; - учет микроядер в клетках костного мозга мышей. Испытан образец белково-полипептидного комплекса, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 2,3 мг/мл.

Оценка мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса в тесте Эймса.

Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований, - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.

Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.

Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.

Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.

Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.

Белково-полипептидный комплекс в виде стерильного раствора с содержанием белка 2,3 мг/мл исследовали 0,3 и 0,1 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 690; 230; 23; 2,3 и 0,23 мкг на чашку.

Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).

Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46°С.

Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.

Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.

Исследованный белково-полипептидный комплекс во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без и в присутствии системы метаболической активации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидный комплекс не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.

Оценка мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса микроядерным методом в клетках млекопитающих.

Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.

Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анателофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.

Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ГТХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации кл