Способы регуляции медиаторов воспаления и пептиды, используемые в них

Способы регуляции медиаторов воспаления и пептиды, используемые в них

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на связанные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет патентной заявки США № 11/367449, поданной 6 марта 2006, которая является частичным продолжением патентной заявки США № 10/802644, поданной 17 марта 2004, которая является продолженной заявкой для патентной заявки США № 10/180753, поданной 26 июня 2002, в настоящее время отозванной, которая заявляет приоритет предварительной заявки США № 60/300933, поданной 26 июня 2001, описание которых включено в настоящее описание полностью в виде ссылки.

Заявление о федеральной поддержке

Настоящее изобретение было осуществлено при поддержке Федерального правительства Соединенных Штатов в рамках гранта номер R01 HL36982 от Национального Института Здоровья. Правительство Соединенных Штатов может иметь определенные права на это изобретение.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам модуляции клеточных секреторных процессов. В частности, настоящее изобретение относится к модуляции высвобождения медиаторов воспаления. Настоящее изобретение также относится к внутриклеточному сигнальному механизму, регулирующему секрецию медиаторов воспаления из связанных с мембраной везикул или гранул в воспалительных клетках.

Предшествующий уровень техники

Повышенная секреция слизи участвует в патогенезе большого количества воспалительных заболеваний дыхательных путей и у людей и у животных, не принадлежащих к человеческому роду. Повышенную секрецию слизи наблюдают при хронических патологических состояниях, таких как астма, ХОБЛ (COPD) и хронический бронхит; при генетических заболеваниях, таких как муковисцидоз; при аллергических состояниях (атопия, аллергическое воспаление); при бронхоэктазах; при ряде острых инфекционных заболеваний дыхательных путей, таких как пневмония, ринит, грипп или простуда.

Повышенной секреции слизи при множестве таких заболеваний дыхательных путей сопутствует постоянное присутствие в дыхательных путях воспалительных клеток. Такие клетки участвуют в патогенезе указанных заболеваний преимущественно посредством повреждения тканей, осуществляемого медиаторами воспаления, высвобождаемыми из таких клеток. Одним примером такого разрушения посредством хронического воспаления являются пациенты с муковисцидозом, когда медиаторы, высвобождаемые из нейтрофилов (например, миелопероксидаза), вызывают десквамацию эпителиальной ткани дыхательных путей.

Пониженная секреция слизи также обладает повреждающим действием. Слизь дыхательных путей действует как физический барьер против вдыхаемых биологически активных частиц и может помочь предотвратить бактериальную колонизацию дыхательных путей и инактивировать цитотоксические продукты, высвобождаемые из лейкоцитов. King et al., Respir. Physiol. 62: 47-59 (1985); Vishwanath and Ramphal, Infect. Immun. 45: 197 (1984); Cross et al., Lancet 1: 1328 (1984). В глазу слизь поддерживает слезную пленку и важна для здоровья и комфорта глаза. Секреция слизи в желудочно-кишечном тракте также обладает цитопротективным действием. Роль слизи в качестве химического, биологического и механического барьера обозначает, что ненормально низкая секреция слизи слизистыми мембранами является нежелательной.

Дыхательные пути млекопитающих выстланы тонким слоем слизи, продуцируемой и секретируемой эпителиальными клетками дыхательных путей (бокаловидными) и подслизистыми железами. При заболеваниях дыхательных путей, таких как астма, хронический бронхит и муковисцидоз, повышенная секреция слизи является частым симптомом. Избыток слизи может вносить вклад в обструкцию и подверженность инфекции. Основным компонентом слизи являются гликопротеины муцина, синтезируемые секреторными клетками и хранящиеся в цитоплазматических гранулах. Муцины представляют собой гликопротеины, секретируемые эпителиальными клетками, включая таковые в дыхательном, желудочно-кишечном и женском репродуктивном тракте. Муцины отвечают за вязко-эластические свойства слизи и известны, по меньшей мере, восемь генов муцинов. Thornton, et al., J.Biol.Chem. 272, 9561-9566 (1997). Повреждение реснитчатого эпителия, вызванное повышенной секрецией муцина и/или гиперплазией слизистых клеток, приводит к закупориванию слизью дыхательных путей, что способствует хронической инфекции, обструкции тока воздуха и иногда смерти. Множество заболеваний дыхательных путей, такие как хронический бронхит, хронические обструктивные болезни легких, бронхоэктазы, астма, муковисцидоз и бактериальные инфекции характеризуются повышенной продукцией муцина. E. Prescott, et al. Eur. Respir.J., 8: 1333-1338 (1995); K.C. Kim, et al., Eur. Respir.J., 10: 1438 (1997); D. Steiger, et al., Am. J.Respir. Cell Mol. Biol., 12:307-314 (1995). При соответствующей стимуляции, гранулы муцина высвобождаются посредством процесса экзоцитоза, при котором гранулы переносятся на периферию клетки, где мембраны гранул соединяются с плазматической мембраной, позволяя секретировать содержимое в просвет.

Несмотря на очевидную патофизиологическую важность такого процесса, внутриклеточные сигнальные механизмы, связывающие стимуляцию на поверхности клеток с высвобождением гранул муцина, были описаны только недавно. См. Li et al., Journal of Biological Chemistry, 276: 40982-40990 (2001). Известно, что большое множество веществ и медиаторов воспаления/гуморальных медиаторов способствуют секреции слизи. Они включают холинергические вещества, липидные медиаторы, оксиданты, цитокины, нейропептиды, АТФ и УТФ, бактериальные продукты, эластазу нейтрофилов и ингалируемые загрязнители. См. Adler et al., Res. Immunol. 149, 245-248 (1998). Интересно, что также известно, что множество таких стимуляторов секреции муцина активируют некоторые протеинкиназы, и исследования, изучающие регуляцию избыточной секреции муцина различными видами эпителиальных клеток дыхательных путей, постоянно включают участие в секреторном процессе или протеинкиназы С (РКС) или цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG). См., например, Ko et al., Am. J.Respir. Cell Mol. Biol. 16, 194-198 (1997); Abdullah et al., Am. J. Physiol. 273, L201-L210 (1997); Abdullah et al., Biochem. J. 316, 943-954 (1996); Larivee et al., Am.J.Respir. Cell Mol. Biol.11, 199-205 (1994); и Fisher et al., Am.J.Respir. Cell Mol. Biol. 20, 413-422 (1999). Только недавно было продемонстрировано, что координированные взаимодействия или «взаимное влияние» между такими двумя протеинкиназами в регуляции секреции муцина включают белки MARCKS. См. Li et al., Journal of Biological Chemistry, 276: 40982-40990 (2001). Однако сигнальные события после совместного действия таких протеинкиназ, которое, в конечном счете, приводит к экзоцитозному высвобождению гранул муцина, полностью не освещены.

MARCKS, белок, приблизительно 82 кДа, обладает тремя эволюционно-консервативными участками (Aderem et al., Nature 1998; 332: 362-364; Thelen et al., Nature 1991; 351:320-322; Hartwig et al., Nature 1992; 356: 618-622; Seykora et al., J. Biol. Chem. 1996; 271: 18797-18802): N-конец, домен сайта фосфорилирования (PSD) и домен множественной гомологии 2 (МН2). N-конец, последовательность 24 аминокислот с компонентом миристиновой кислоты, прикрепленным к концевому остатку глицина, участвует в связывании MARCKS с мембранами (Seykora et al., J. Biol. Chem. 1996; 271: 18797-18802) и возможно с кальмодулином (Matsubara et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 48898-48902). Эта последовательность из 24 аминокислот известна как MANS-пептид. MANS-пептид и его активные фрагменты могут конкурировать с нативным MARCKS в клетках в отношении связывания с мембраной. Участие белка MARCKS в высвобождении медиаторов воспаления из гранул инфильтрирующих лейкоцитов имеет отношение к воспалению при заболеваниях во всех тканях и органах, включая заболевания легких, характеризуемые воспалением дыхательных путей, такие как астма, ХОБЛ и муковисцидоз. Однако воспаление и секреция слизи в дыхательных путях представляют собой два отдельных и независимых процесса (Li et al., J.Biol. Chem. 2001; 276: 40982-40990; Singer et al., Nat.Med 2004; 10: 193-196). Тогда как продукция и секреция слизи могут быть вызваны рядом факторов, включая медиаторы, высвобождаемые из воспалительных клеток, прямая связь между избытком слизи и воспалением неизвестна.

Сущность изобретения

Изобретение относится к новому применению 24-аминокислотного, миристоилированного полипептида, также известного как MANS-пептид. Изобретение также относится к новому способу блокирования любого клеточного секреторного процесса, особенно такого, который включает высвобождение медиаторов воспаления из воспалительных клеток, чьи стимулирующие пути включают субстрат протеинкиназы С (РКС)-белок MARCKS, и высвобождение содержимого из внутриклеточных везикул или гранул.

Настоящее изобретение относится к способу ингибирования экзоцитозного высвобождения, по меньшей мере, одного медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки, включающему контакт, по меньшей мере, одной воспалительной клетки, которая содержит, по меньшей мере, один медиатор воспаления, содержащийся в везикуле в клетке, с, по меньшей мере, одним пептидом, выбираемым из группы, состоящей из MANS-пептида и его активного фрагмента в эффективном количестве для уменьшения высвобождения медиатора воспаления из воспалительной клетки по сравнению с высвобождением медиатора воспаления из воспалительной клетки такого же типа, которое возникает в отсутствие, по меньшей мере, одного пептида.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу ингибирования высвобождения, по меньшей мере, одного медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки в ткани или жидкости пациента, включающему введение в ткани и/или жидкости пациента, которые содержат, по меньшей мере, одну воспалительную клетку, содержащую, по меньшей мере, один медиатор воспаления, содержащийся в везикуле в клетке, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, один пептид, выбираемый из группы, состоящей из MANS-пептида и его активного фрагмента, в терапевтически эффективном количестве для снижения высвобождения медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки, по сравнению с высвобождением медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки того же типа, которое возникает в отсутствие, по меньшей мере, одного пептида. В частности, ингибирование высвобождения медиатора воспаления включает блокаду или уменьшение высвобождения медиатора воспаления из воспалительной клетки.

В частности, настоящее изобретение включает способ уменьшения воспаления у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей MANS-пептид [т.е. N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ.ID.NO:20)] или его активный фрагмент. Активный фрагмент представляет собой, по меньшей мере, шесть аминокислот в длину. Как используется в настоящем описании, «активный фрагмент» MARCKS-белка представляет собой таковой, который влияет на (ингибирует или усиливает) высвобождение, опосредованное MARCKS белком. Активный фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ.ID.NO:3); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ.ID.NO:4); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ.ID.NO:5); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ.ID.NO:6); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ.ID.NO:7); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ.ID.NO:8); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ.ID.NO:9); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ.ID.NO:10); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ.ID.NO:11); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEA (SEQ.ID.NO:12); N-миристоил-GAQFSKTAAKGE (SEQ.ID.NO:13); N-миристоил-GAQFSKTAAKG (SEQ.ID.NO:14); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ.ID.NO:15); N-миристоил-GAQFSKTAA (SEQ.ID.NO:16); N-миристоил-GAQFSKTA (SEQ.ID.NO:17); N-миристоил-GAQFSKT (SEQ.ID.NO:18); и N-миристоил-GAQFSK (SEQ.ID.NO:19). Присутствие гидрофобного N-концевого миристатного компонента в таких пептидах может усиливать их совместимость с и, вероятно, их проницаемость через плазматические мембраны и потенциально делает возможным поглощение пептидов клетками. Гидрофобная вставка миристата в бислой может обеспечивать коэффициент распределения или наблюдаемую константу ассоциации с липидами до 10⁴ М^-1 или свободную энергию связывания Гиббса около 8 ккал/моль (см., например, Peitzsch, R.M. и McLaughlin, S. 1993, Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32: 10436-10443), что является достаточным, по меньшей мере, частично для возможности распределения MANS-пептида и пептидных фрагментов MANS-пептида в плазматической мембране клеток, как описано в настоящем описании, тогда как дополнительные функциональные группы и их взаимодействия в MANS-пептиде (который является миристоилированным) и в пептидных фрагментах миристоилированного MANS-пептида могут потенциировать их относительную мембранную проницаемость. Каждый фрагмент может проявлять коэффициенты распределения и сродство к мембране, которые характерны для их соответствующей структуры. Фрагменты могут быть получены методами пептидного синтеза, известными в области техники, такими как твердофазный пептидный синтез (см., например, методы, описанные в Chan, Wеng C. and White, Peter D. Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, New York (2000); и Lloyd-Williams, P. Et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (1997)) и очищены методами, известными в области техники, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография. Молекулярная масса каждого пептида может быть подтверждена масс-спектроскопией, с каждым показанным пиком с соответствующей молекулярной массой. Эффективность отдельных пептидов и комбинаций отдельных пептидов (например, комбинации 2 пептидов, комбинации 3 пептидов, комбинации 4 пептидов) в способах по настоящему описанию могут быть легко определены без ненужных экспериментов с использованием методик, описанных в примерах, представленных в настоящем описании. Предпочтительная комбинация включает два пептида; молярное соотношение пептидов может составлять предпочтительно от 50:50 до 99,99:0,01, такое соотношение может быть легко определено с использованием методик, описанных в примерах, представленных в настоящем описании.

Предпочтительно MANS-пептид или его активный фрагмент содержится в фармацевтической композиции, которую применяют для блокады воспаления. Настоящее изобретение также включает способы контроля клеточного секреторного процесса у пациента, включающие введение терапевтически эффективного количества соединения, содержащего MANS-пептид или его активный фрагмент, которое регулирует медиаторы воспаления у пациента. Введение обычно выбирают из группы, состоящей из местного введения, парентерального введения, ректального введения, легочного введения, ингаляции и назального или перорального введения, где легочное введение обычно включает или аэрозоль, или введения с помощью ингалятора сухого порошка, ингалятора с дозирующим клапаном или небулайзера.

Введение композиции, содержащей количество MANS-пептида, ингибирующее дегрануляцию, или количество его активного фрагмента, ингибирующее дегрануляцию, так что фармацевтическая композиция MANS-пептида или его активного фрагмента для применения у человека или животного обеспечивает MANS-пептид или его активный фрагмент, по меньшей мере, в месте или в ткани, или в жидкостьсодержащем, или слизьсодержащем слое в контакте с поверхностью ткани, где находятся воспалительные гранулоцитарные клетки или в которые воспалительные гранулоцитарные клетки могут внедряться, таким образом, позволяя MANS-пептиду или его фрагменту контактировать с воспалительной гранулоцитарной клеткой. В одном аспекте введение такой композиции может быть осуществлено при первичном начале, или первичном определении воспаления, или первом ощущении воспаления человеком или животным, или при первом ощутимом изменении степени воспаления у человека или животного для уменьшения выраженности воспаления, которое возникает в отсутствие MANS-пептида или его активного фрагмента. В другом аспекте введение может быть осуществлено во время текущего воспаления ткани у человека или животного для уменьшения выраженности дополнительного воспаления, которое иным образом возникает в отсутствие MANS-пептида или его активного фрагмента. Тогда как количество и частота дозирования могут быть определены путем клинического обследования и являются функцией заболевания или источника воспаления и степени вовлечения ткани, и возраста, и размера пациента, считают, что дозирование фармацевтической композиции может быть повторено через 3-8 часов, предпочтительно через 6-8 часов после первого введения фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также включает способы уменьшения воспаления у пациента, включающие введение терапевтически эффективного количества соединения, которое ингибирует MARCKS-связанное высвобождение медиаторов воспаления, вследствие чего высвобождение, по меньшей мере, одного медиатора воспаления у пациента снижается по сравнению с таковым, которое возникает в отсутствие указанного лечения. Как используется в настоящем описании, «снижение» обычно обозначает уменьшение эффектов воспаления. Предпочтительно, медиаторы воспаления ингибируются или блокируются описанными способами.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает способы уменьшения воспаления у пациента, включающие введение терапевтически эффективного количества соединения, которое ингибирует MARCKS-связанное высвобождение медиаторов воспаления, вследствие чего воспаление у пациента уменьшается по сравнению с таковым, которое возникает в отсутствие указанного лечения. Настоящее изобретение также описывает способы снижения или ингибирования воспаления у пациента, включающие введение терапевтически эффективного количества MANS-пептида или его активного фрагмента, эффективного для модуляции медиатора воспаления в месте воспаления. Термин «ингибирование» обозначает снижение количества секреции медиатора воспаления. Термин «полное ингибирование» обозначает снижение степени секреции медиатора воспаления до нуля. Также, как указано выше, активный фрагмент имеет по меньшей мере шесть аминокислот в длину. Термин «экзоцитозный процесс» обозначает экзоцитоз, т.е. процесс клеточной секреции или экскреции, при которой вещества, содержащиеся в везикулах, которые находятся внутри клетки, выделяются из клетки путем сшивки мембраны везикул с наружной клеточной мембраной. «Дегрануляция» обозначает высвобождение содержимого клеточных гранул. Термин «ингибирование дегрануляции» обозначает снижение высвобождения медиаторов воспаления, содержащихся в гранулах воспалительных клеток. Следовательно, количество MANS-пептида и/или его активного фрагмента, ингибирующее дегрануляцию, представляет собой количество таких пептидов, которое достаточно для снижения высвобождения медиаторов воспаления, содержащихся в гранулах, по сравнению с высвобождением в отсутствие того же пептида.

MANS-пептид и его активные фрагменты могут быть применимыми при профилактике или уменьшении выраженности воспаления, вызванного медиаторами воспаления в ткани животного. MANS-пептид и его активные фрагменты могут быть применимы при профилактике или уменьшении степени повреждения ткани у животного, вызываемого или вызванного медиаторами воспаления.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А-1D представляют собой гистограммы, иллюстрирующие, что гиперсекреция муцина клетками NHBE доводится до максимума путем активации и РКС, и PKG.

На фиг. 2А-2В продемонстрировано, что MARCKS-белок является ключевым компонентом секреторного пути муцина.

На фиг. 3А-3С изображен гель, иллюстрирующий, что антисмысловой нуклеотид, направленный против MARCKS, подавляет экспрессию MARCKS и ослабляет гиперсекрецию муцина.

На фиг. 4А-4В проиллюстрировано, что РКС-зависимое фосфорилирование высвобождает MARCKS из плазматической мембраны в цитоплазму.

На фиг. 5А-5С показано, что PKG индуцирует дефосфорилирование MARCKS путем активации РР2А.

На фиг. 6 изображены гистограммы, которые демонстрируют, что РР2А является обязательным компонентом секреторного пути муцина.

Фиг. 7 представляет собой гель, который иллюстрирует, что MARCKS ассоциируется с актином и миозином в цитоплазме.

На фиг. 8 изображен сигнальный механизм, регулирующий секрецию муцина эпителиальными клетками дыхательных путей человека.

Фиг. 9 представляет собой гистограмму, изображающую способность MANS-пептида блокировать секрецию миелопероксидазы из выделенных нейтрофилов собак.

Фиг. 10 представляет собой гистограмму, изображающую способность MANS-пептида блокировать секрецию миелопероксидазы из выделенных человеческих нейтрофилов.

Фиг. 11 представляет собой гистограмму, показывающую, что РМА стимулирует небольшое увеличение секреции МРО из человеческих нейтрофилов, стимулированных LPS, которая усиливается в зависимости от концентрации путем совместной стимуляции с помощью 8-Br-cGMP.

Фиг. 12 представляет собой гистограмму, показывающую, что стимуляция 8-Br-cGMP обладает небольшим эффектом на секрецию МРО из человеческих нейтрофилов, стимулированных LPS, до возникновения совместной стимуляции с РМА в зависимости от концентрации.

Фиг. 13 представляет собой гистограмму, показывающую, что РМА стимулирует небольшое увеличение секреции МРО из собачьих нейтрофилов, стимулированных LPS, которая усиливается в зависимости от концентрации путем совместной стимуляции с помощью 8-Br-cGMP.

Фиг. 14 представляет собой гистограмму, показывающую, что стимуляция 8-Br-cGMP обладает небольшим эффектом на секрецию МРО из собачьих нейтрофилов, стимулированных LPS, до возникновения совместной стимуляции с РМА в зависимости от концентрации.

Фиг.15 представляет собой гистограмму, показывающую, что для максимальной секреции МРО из нейтрофилов собак, стимулированных LPS, требуется совместная стимуляция PMA + 8-Br-cGMP.

Подробное описание изобретения

Далее настоящее описание будет описано более полно со ссылками на сопутствующие чертежи, в которых проиллюстрированы предпочтительные варианты осуществления изобретения. Настоящее изобретение, однако, может быть воплощено в различных формах и не должно расцениваться как ограниченное вариантами осуществления изобретения, указанными в настоящем описании. Более того, обеспечены такие варианты осуществления изобретения, посредством которых настоящее описание является полным и основательным и полностью покрывает спектр изобретения для специалиста в области техники.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как обычно понимает обычный специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, включены полностью в виде ссылки. Применение единственного числа в настоящем описании для описания любого аспекта настоящего изобретения должно интерпретироваться как указывающее на один или более.

Настоящее изобретение относится к способу ингибирования экзоцитозного высвобождения, по меньшей мере, одного медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки, включающему контакт, по меньшей мере, одной воспалительной клетки, которая содержит, по меньшей мере, один медиатор воспаления, содержащийся в везикулах внутри клетки, с, по меньшей мере, одним пептидом, выбираемым из группы, состоящей из MANS-пептида и его активного фрагмента, в эффективном количестве для снижения высвобождения медиатора воспаления из воспалительной клетки по сравнению с высвобождением медиатора воспаления из воспалительной клетки такого же типа, которое возникает в отсутствие, по меньшей мере, одного пептида.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу ингибирования высвобождения, по меньшей мере, одного медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки в ткани или жидкости пациента, включающему введение в ткань и/или жидкость пациента, которые содержат, по меньшей мере, одну воспалительную клетку, содержащую, по меньшей мере, один медиатор воспаления, содержащийся в везикулах в клетке, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один пептид, выбираемый из группы, состоящей из MANS-пептида и его активного фрагмента, в терапевтически эффективном количестве для снижения высвобождения медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки по сравнению с высвобождением медиатора воспаления из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки такого же типа, которое возникает в отсутствие, по меньшей мере, одного пептида. В частности, снижение высвобождения медиатора воспаления включает блокаду или ингибирование механизма, который высвобождает медиатор воспаления из воспалительной клетки.

MANS-пептид, используемый в настоящих способах, описанных выше, включает SEQ ID NO:1. Активный фрагмент, применимый в настоящем изобретении, включает, по меньшей мере, один миристоилированный N-концевой фрагмент SEQ ID NO:1, который содержит, по меньшей мере, шесть аминокислот, где первая аминокислота указанного фрагмента начинается с N-концевого глицина SEQ ID NO:1. В частности, активный фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO:3); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO:4); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO:5); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO:6); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO:7); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO:8); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO:9); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO:10); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO:11); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO:12); N-миристоил-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO:13); N-миристоил-GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO:14); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO:15); N-миристоил-GAQFSKTAA (SEQ ID NO:16); N-миристоил-GAQFSKTA (SEQ ID NO:17); N-миристоил-GAQFSKT (SEQ ID NO:18); и N-миристоил-GAQFSK (SEQ ID NO:19).

Настоящее изобретение относится к контакту и/или введению пептида, описанного выше и на всем протяжении описания, с любой известной воспалительной клеткой, которая может содержаться в ткани или жидкости пациента, которая содержит по меньшей мере один медиатор воспаления, содержащийся в везикулах внутри клетки. Воспалительной клеткой предпочтительно является лейкоцит, более предпочтительно - гранулоцит, который может быть классифицирован далее как нейтрофил, базофил, эозинофил или их комбинация. Воспалительными клетками, контактирующими в настоящем способе, также могут быть моноцит/макрофаг.

Настоящее изобретение относится к уменьшению высвобождения медиаторов воспаления, содержащихся в везикулах воспалительных клеток, и такие медиаторы воспаления выбирают из группы, состоящей из миелопероксидазы (МРО), эозинофильной пероксидазы (ЕРО), главного основного белка (МВР), лизозима, гранзима, гистамина, протеогликана, протеазы, хемотаксического фактора, цитокина, метаболита арахидоновой кислоты, дефензина, бактерицидного белка, повышающего проницаемость (BPI), эластазы, катепсина G, катепсина В, катепсина D, бета-D-глюкуронидазы, альфа-маннозидазы, фосфолипазы А₂, хондроитин-4-сульфата, протеиназы 3, лактоферрина, коллагеназы, активатора комплемента, рецептора комплемента, рецептора N-формилметионил-лейцил-фенилаланина (FMLP), рецептора ламинина, цитохрома b₅₅₈, моноцитарного хемотаксического фактора, гистаминазы, белка, связывающего витамин В12, желатиназы, активатора плазминогена, бета-D-глюкуронидазы и их комбинации. Предпочтительно такие медиаторы воспаления выбирают из группы, состоящей из миелопероксидазы (МРО), эозинофильной пероксидазы (ЕРО), главного основного белка (МВР), лизозима, гранзима и их комбинации.

Настоящее изобретение приводит в соприкосновение эффективное количество пептида с воспалительной клеткой, где эффективное количество определяют как ингибирующее дегрануляцию количество MANS-пептида или его активного фрагмента, которое снижает количество медиатора воспаления, высвобождаемое из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки от около 1% до около 99% по сравнению с количеством, высвобождаемым из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки в отсутствие MANS-пептида или его активного фрагмента. Более предпочтительно такое эффективное количество контактирующего пептида включает ингибирующее дегрануляцию количество MANS-пептида или его активного фрагмента, которое снижает количество медиатора воспаления, высвобождаемое из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки между около 5-50% до около 99% по сравнению с количеством, высвобождаемым из, по меньшей мере, одной воспалительной клетки в отсутствие MANS-пептида или его активного фрагмента.

Настоящее изобретение в одном варианте осуществления направлено на введение, по меньшей мере, одного пептида, включающего MANS-пептид или его активный фрагмент, в терапевтически эффективном количестве в ткань или жидкость пациента, где пациент страдает от респираторного заболевания, которым предпочтительно является астма, хронический бронхит или ХОБЛ. В следующем варианте осуществления изобретения пациент может быть поражен заболеванием кишечника, заболеванием кожи, аутоиммунным заболеванием, болевым синдромом и их комбинацией. Болезнью кишечника может быть язвенный колит, болезнь Крона или синдром раздраженной кишки. Пациент может страдать от заболевания кожи, такого как розовые угри, экзема, псориаз или тяжелое акне. Пациент также может страдать от артрита, такого как ревматоидный артрит, псориатический артрит, системная красная волчанка. Пациенты, страдающие от муковисцидоза, также могут получать лечение посредством настоящего способа и пептидов. Настоящий способ предпочтительно применим для лечения пациентов, таких как млекопитающие, и предпочтительно людей, собак, лошадей и кошек.

Настоящий способ лечения пациентов представляет собой введение одного или более пептидов, включающих MANS-пептид или его активный фрагмент, описанный в настоящем описании, включая местное введение, парентеральное введение, ректальное введение, легочное введение, назальное введение или пероральное введение. В частности, легочное введение выбирают из группы аэрозольного введения, введения с помощью ингалятора сухого порошка, ингалятора с дозирующим клапаном и небулайзера. Дополнительно, описанный способ может кроме того включать введение пациенту второй молекулы, выбираемой из группы, состоящей из антибиотика, противовирусного соединения, противопаразитарного соединения, противовоспалительного соединения и иммунодепрессанта.

В одном аспекте, изобретение относится к способу введения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество известного соединения и фармацевтически приемлемый носитель. «Терапевтически эффективным» количеством, как используется в настоящем описании, является количество соединения, достаточное для облегчения имеющихся у пациента симптомов. Терапевтически эффективное количество варьируется в зависимости от возраста и физического состояния пациента, тяжести состояния пациента, получающего лечение, длительности лечения, природы любого сопутствующего лечения, используемого фармацевтически приемлемого носителя и подобных факторов в рамках знаний и опыта специалиста в данной области техники. Фармацевтически приемлемыми носителями являются предпочтительно твердые лекарственные формы, такие как таблетки или капсулы. Также могут быть использованы жидкие препараты для перорального введения, и могут быть получены в форме сиропов или суспензий, например, растворов, содержащих активный ингредиент, сахар и смесь этанола, воды, глицерина и пропиленгликоля. При желании, такие жидкие препараты могут включать одно или более из следующего: красители, ароматизаторы и сахарин. Кроме того, также могут быть использованы загустители, такие как карбоксиметилцеллюлоза, а также другие приемлемые носители, выбор которых очевиден в области техники.

Как указано выше, настоящее изобретение относится к способам регуляции клеточных секреторных процессов, особенно высвобождения медиаторов воспаления из воспалительных клеток. Как используется в настоящем описании, термин «регуляция» обозначает блокаду, ингибирование, снижение, понижение, увеличение, усиление или стимуляцию. Ряд клеточных секреторных процессов включает высвобождение содержимого из везикул или гранул, связанных с мембраной клеток. Везикулы или гранулы, связанные с мембраной, определяют как внутриклеточные частицы, которые являются преимущественно пузырькообразной (или везикулы внутри клетки) и которые содержат хранящееся вещество, которое может секретироваться. Было обнаружено, что некоторое из содержимого таких везикул, таких как содержащихся в воспалительных клетках, отвечает за множество патологических процессов во множестве тканей млекопитающих. Некоторые эффекты такой секреции видимо включают повреждение ранее здоровых тканей при воспалении. Настоящее изобретение обеспечивает средство блокады секреции из любых везикул, связанных с мембраной, включая таковые, обнаруживаемые в воспалительных клетках, путем нацеливания синтетического пептида на специфическую молекулу, важную во внутриклеточном секреторном пути. Такой подход может иметь терапевтическую пользу для лечения широкого множества гиперсекреторных и воспалительных состояний у людей и животных.

В частности, настоящее изобретение имеет мишенью воспалительные клетки, которые содержат медиаторы воспаления в одной или более гранул или везикул в цитоплазме клеток. Клетки контактируют с одним или более пептидами, которые выбирают из MANS-пептида или его активного фрагмента, все из которых ниже описаны детально. Предпочтительно контакт пептида с воспалительной клеткой происходит посредством введения пациенту, пораженному или страдающему от заболевания, при котором такие воспалительные клетки присутствуют в специфической ткани или жидкости в ткани. При введении или контакте пептида с клеткой пептид конкурентно конкурирует за и конкурентно ингибирует связывание естественного MARCKS-белка с мембраной внутриклеточных гранул или везикул, которые содержат медиаторы воспаления. В результате блокады связывания MARCKS-белка с везикулами в воспалительных клетках, такие везикулы в таких клетках не передвигаются к плазматической мембране клетки, как они должны в норме при стимуляции для экзоцитозного высвобождения из клетки содержащихся в них медиаторов воспаления. Следовательно, способ по настоящему изобретению ингибирует движение везикул к плазматической мембране клетки, что в свою очередь снижает высвобождение медиаторов воспаления из воспалительных клеток. Количество медиаторов воспаления, высвобождаемых из клеток, с течением времени снижается, так как и скорость высвобождения, и количество высвобождаемых медиаторов из воспалительных клеток зависит от концентрации вводимого и контактирующего с воспалительными клетками пептида.

Одним преимуществом настоящего изобретения является то, что оно может комбинировать терапию, которая включает непосредственную блокаду секреции слизи с уникальной противовоспалительной терапией. Преимуществом настоящего изобретения над существующим противовоспалительным лечением, которое вызывает общее подавление иммунной системы, является то, что, вероятно, пептид блокирует секрецию только внутриклеточных компонентов, секретируемых из воспалительных клеток. Следовательно, множество аспектов иммунной системы все еще функционируют даже при ингибировании медиаторов воспаления.

Соединения по настоящему изобретению могут регулировать, т.е. блокировать, высвобождение медиатора воспаления из клеток. Такое ингибирование высвобождения медиаторов воспаления является привлекательным свойством для предотвращения и лечения множества расстройств, например болезней и патологических состояний, включающих воспаление. Следовательно, соединения по изобретению могут быть применимы для лечения таких состояний. Они включают заболевания дыхательных путей и хронические воспалительные заболевания, включая, но, не ограничиваясь, остеоартрит, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, болезнь трансплантат-против-хозяина, системную красную волчанку и инсулинозависимый сахарный диабет. Соединения по изобретению также могут быть использованы для лечения других расстройств, ассоциированных с активностью повышенного уровня провоспалительных медиаторов и ферментов, таких как ответ на различные инфекционные агенты и ряд заболеваний, таких как ревматоидный артрит, синдром токсического шока и воспалительные заболевания кишечника.

Применение пептидов и способы по изобретению включают терапию для борьбы с воспалением вместе с терапией, котора