Ферментативное получение 1-бутанола

Ферментативное получение 1-бутанола

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

В настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с разделом 35 кодекса законов США §119 по предварительной заявке США № 60/721677, поданной 29 сентября 2005 года, и по предварительной заявке США № 60/814470, поданной 16 июня 2006 года.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области промышленной микробиологии и получению спиртов. Конкретнее, 1-бутанол получают посредством промышленного брожения рекомбинантного микроорганизма.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Бутанол является важным промышленным химическим продуктом, который применим в качестве добавки к топливу, в качестве сырьевого химического вещества в производстве пластических масс и в качестве пищевых экстрагирующих агентов в пищевой промышленности и промышленности вкусовых и ароматических веществ. Каждый год от 10 до 12 миллиардов фунтов бутанола производится нефтехимическим способом, и потребность в этом химическом продукте, вероятно, будет увеличиваться.

Известны способы химического синтеза 1-бутанола, такие как оксопроцесс, процесс Реппе и гидрогенизация кротонового альдегида (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^th edition, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH and Co., Weinheim, Germany, Vol. 5, pp. 716-719). В этих процессах используют исходные вещества, которые получены из нефтехимических продуктов и в большинстве случаев являются дорогостоящими и вредными для окружающей среды. Получение 1-бутанола из сырьевых материалов, полученных из растений, могло бы свести к минимуму тепличные газовые выбросы и может представлять собой технический прогресс.

Также известны способы получения 1-бутанола посредством биотрансформации других органических химических веществ. Например, Muramoto et al. (JP 63017695) описывает способ получения спиртов, в том числе бутанола, из альдегидов, используя штаммы Pseudomonas. Кроме того, Kuehnle et al. (EP 1149918) описывает способ получения 1-бутанола и 2-бутанола в результате окисления углеводородов различными штаммами Rhodococcus ruber.

Также известны способы получения бутанола в результате брожения, где в самом популярном процессе получается смесь ацетона, 1-бутанола и этанола, который относится к АВЕ-процессам (Blaschek et al., патент США № 6358717). Ацетон-бутанол-этанольное брожение (АВЕ) посредством Clostridium acetobutylicum является одним из самых старых, известных среди промышленных брожений, и каскад реакций и гены, ответственные за продукцию этих растворителей, были описаны (Girbal et al., Trends in Biotechnology 16:11-16 (1998)). Однако фактическое брожение было достаточно сложным и трудно регулируемым. Использование АВЕ-брожения постоянно снижалось начиная с 1950-х годов, и в настоящее время почти весь бутанол получают посредством нефтехимических процессов, как описано выше. При обычном АВЕ-брожении сначала C.acetobutylicum продуцирует масляную, пропионовую, молочную и уксусную кислоты, уменьшается рН культуры и происходит метаболический сдвиг «бабочки», и затем образуются 1-бутанол, ацетон, изопропанол и этанол. В обычных процессах АВЕ-брожения уровень 1-бутанола, полученного из глюкозы, небольшой, обычно около 15 процентов и изредка превышает 25 процентов. Следовательно, концентрация 1-бутанола в обычных процессах АВЕ-брожения, как правило, ниже 1,3 процента.

Попытки максимизировать получение 1-бутанола в результате процесса АВЕ-брожения посредством удаления всех других побочных продуктов растворителей не были полностью успешными, и, таким образом, в этом процессе продуцируются значительные количества ацетона, который не пригоден в качестве добавки к бензину. Способ ферментативного получения бутанола, в котором 1-бутанол является единственным продуктом, представлял бы собой технический прогресс.

Таким образом, существует потребность в безопасном для окружающей среды, экономичном способе получения 1-бутанола в виде единственного продукта. Настоящее изобретение рассматривает указанную потребность посредством открытия рекомбинантного микробного продуцирующего организма-хозяина, экспрессирующего биосинтетический путь 1-бутанола.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет рекомбинантный микроорганизм, имеющий сконструированный биосинтетический путь 1-бутанола. Указанный сконструированный микроорганизм можно использовать для промышленного получения 1-бутанола. Соответственно настоящее изобретение представляет рекомбинантную микробную клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует конверсию субстрата в продукт, выбранную из группы, состоящей из:

a) ацетил-CoA в ацетоацетил-CoA,

b) ацетоацетил-CoA в 3-гидроксибутирил-CoA,

c) 3-гидроксибутирил-CoA в кротонил-CoA,

d) кротонил-CoA в бутирил-CoA,

e) бутирил-CoA в бутиральдегид,

f) бутиральдегид в 1-бутанол;

где по меньшей мере одна молекула ДНК является гетерологичной указанной микробной клетке-хозяину и где указанная микробная клетка-хозяин продуцирует 1-бутанол.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения 1-бутанола, включающему:

i) получение рекомбинантной микробной клетки-хозяина, содержащей по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует конверсию субстрата в продукт, выбранную из группы, состоящей из:

a) ацетил-CoA в ацетоацетил-CoA,

b) ацетоацетил-CoA в 3-гидроксибутирил-CoA,

c) 3-гидроксибутирил-CoA в кротонил-CoA,

d) кротонил-CoA в бутирил-CoA,

e) бутирил-CoA в бутиральдегид,

f) бутиральдегид в 1-бутанол;

где по меньшей мере одна молекула ДНК является гетерологичной указанной микробной клетке-хозяину; и

ii) контактирование клетки-хозяина из (i) со способным к брожению углеродным субстратом в условиях, при которых продуцируется 1-бутанол.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖА И ОПИСАНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящее изобретение может быть более полно понято из следующих подробного описания, чертежа и сопровождающих описаний последовательностей, которые являются частью настоящей заявки.

На фиг.1 представлен биосинтетический путь 1-бутанола. Стадии, обозначенные «а», «b», «c», «d», «e» и «f», представляют собой конверсии субстрата в продукт, описанные далее.

Следующие последовательности соответствуют 37 C.F.R. 1.821-1.825 («Требования, предъявляемые к патентным заявкам, содержащим описания нуклеотидных последовательностей и/или аминокислотных последовательностей - правила для последовательностей») и соответствуют стандарту ST.25 (1998) Всемирной организации интеллектуальной собственности (ВОИС) и условиям, которые необходимы для регистрации последовательностей EPO и PCT (правила 5.2 и 49.5(a-бис) и Раздел 208 и Приложение C Административной Инструкции). Символы и формат, использованные для характеристик нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, подчиняются правилам, изложенным в 37 C.F.R. §1.822.

Таблица 1 Сводная информация об идентификационных номерах генов и белков
Описание	SEQ ID NO:, нуклеиновая кислота	SEQ ID NO:, пептид
Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза thlA из Clostridium acetobutylicum ATCC 824	1	2
Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза thlВ из Clostridium acetobutylicum ATCC 824	3	4
Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза из Escherichia coli	128	129
Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза из Bacillus subtilis	130	131
Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза из Saccharomyces cerevisiae	132	133
3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназа из Clostridium acetobutylicum ATCC 824	5	6
3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназа из Bacillus subtilis	134	135
3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназа из Ralstonia eutropha	136	137
3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназа из Alcaligenes eutrophus	138	139
Кротоназа из Clostridium acetobutylicum ATCC 824	7	8
Кротоназа из Escherichia coli	140	141
Кротоназа из Bacillus subtilis	142	143
Кротоназа из Aeromonas caviae	144	145
Предполагаемая транс-еноил-СоА-редуктаза из Clostridium acetobutylicum ATCC 824	9	10
Бутирил-СоА-дегидрогеназа из Euglena gracilis	146	147
Бутирил-СоА-дегидрогеназа из Streptomyces collinus	148	149
Бутирил-СоА-дегидрогеназа из Streptomyces coelocolor	150	151
Бутиральдегиддегидрогеназа из Clostridium beijerinckii NRRL B594	11	12
Бутиральдегиддегидрогеназа из Clostridium acetobutylicum	152	153
Бутанолдегидрогеназа bdhB из Clostridium acetobutylicum АТСС 824	13	14
Бутанолдегидрогеназа bdhА из Clostridium acetobutylicum АТСС 824	15	16
Бутанолдегидрогеназа из Clostridium acetobutylicum	152	153
Бутанолдегидрогеназа из Escherichia coli	154	155

SEQ ID NO: 17-44 представляют собой нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемых для амплификации генов биосинтетического пути 1-бутанола.

SEQ ID NO: 45-72 представляют собой нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемых для секвенирования.

SEQ ID NO: 73-75 представляют собой нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемых для конструирования трансформационных векторов, описанных в примере 9.

SEQ ID NO: 76 представляет собой нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированного гена САС0462, обозначенного в настоящем описании как CaTER.

SEQ ID NO: 77 представляет собой нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированного гена EgTER, обозначенного в настоящем описании как EgTER(opt).

SEQ ID NO: 78 представляет собой нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированного гена ald, обозначенного в настоящем описании как ald (opt).

SEQ ID NO: 79 представляет собой нуклеотидную последовательность плазмиды pFP988.

SEQ ID NO: 80-127, 160-185 и 190-207 представляют собой последовательности нуклеиновых кислот праймеров клонирования, секвенирования или скрининг-ПЦР, использованные для клонирования, секвенирования или скрининга генов биосинтетического пути 1-бутанола, описанного в настоящем описании, и они более подробно описаны в таблицах 4 и 5.

SEQ ID NO: 156 представляет собой нуклеотидную последовательность кластера гена cscBKA.

SEQ ID NO: 157 представляет собой аминокислотную последовательность гидролазы сахарозы (CscA).

SEQ ID NO: 158 представляет собой аминокислотную последовательность D-фруктокиназы (CscK).

SEQ ID NO: 159 представляет собой аминокислотную последовательность пермеазы сахарозы (CscB).

SEQ ID NO: 186 представляет собой нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированного гена tery, описанного в примере 17.

SEQ ID NO: 187 представляет собой аминокислотную последовательность бутил-СоА-дегидрогеназы (ter), кодируемой кодон-оптимизированным геном tery (SEQ ID NO: 186).

SEQ ID NO: 188 представляет собой нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированного гена aldy, описанного в примере 17.

SEQ ID NO: 189 представляет собой аминокислотную последовательность бутиральдегиддегидрогеназы (ald), кодируемой кодон-оптимизированным геном aldy (SEQ ID NO: 188).

SEQ ID NO: 208 представляет собой нуклеотидную последовательность матричной ДНК, используемой в примере 14.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам получения 1-бутанола с помощью рекомбинантных микроорганизмов. Настоящее изобретение отвечает целому ряду торгово-промышленных потребностей. Бутанол является важным промышленным химическим продуктом с целым рядом применений, среди которых его потенциал в качестве топлива или добавки к топливу является чрезвычайно значимым. Являясь только четырехуглеродным спиртом, бутанол имеет энергосодержание, аналогичное таковому бензина, и может быть смешан с любым природным топливом. Бутанол предпочтителен в качестве топлива или добавки к топливу, поскольку при сгорании в стандартном двигателе внутреннего сгорания он приводит к образованию только СО₂ и небольшого количества или вовсе не приводит к образованию SO_x или NO_x. Кроме того, бутанол менее коррозийный, чем этанол, наиболее предпочтительная добавка к топливу на сегодняшний день.

В дополнение к его практичности в качестве биотоплива или добавки к топливу, бутанол имеет потенциал оказывать влияние на проблему распределения водорода в развивающейся индустрии тепловых элементов. В настоящее время проблемы безопасности, связанные с переносом водорода и распределением, ограничивают применение топливных элементов. Бутанол можно без труда преобразовать в его водородное состояние и можно распространять через существующие бензозаправочные станции в чистоте, требуемой либо для топливных элементов, либо для носителей.

Наконец, по настоящему изобретению бутанол получают из источников углерода растительного происхождения, что позволяет избежать отрицательного воздействия на окружающую среду, связанного со стандартными нефтехимическими способами получения бутанола.

Следующие определения и сокращения должны использоваться для интерпретации настоящей формулы изобретения и описания.

Используемый в настоящем описании термин «изобретение» или «настоящее изобретение» является неограничивающим термином и не предназначен для определения какого-либо единственного варианта осуществления данного конкретного изобретения, а охватывает все возможные варианты осуществления, как описано в настоящем описании и формуле изобретения.

«ABE» является сокращением для способа ацетон-бутанол-этанольного брожения.

Термин «биосинтетический путь 1-бутанола» означает каскад ферментативных реакций для получения 1-бутанола из ацетил-коэнзима А (ацетил-СоА).

Термин «ацетил-CoA-ацетилтрансфераза» означает фермент, который катализирует превращение двух молекул ацетил-СоА в ацетоацетил-СоА и коэнзим А (СоА). Предпочтительными ацетил-CoA-ацетилтрансферазами являются ацетил-CoA-ацетилтрансферазы с предпочтением субстрата (реакция в прямом направлении) для короткой цепи ацил-СоА и ацетил-СоА, и они классифицированы как Е.С. 2.3.1.9 [Номенклатура ферментов 1992, Academic Press, San Diego]; хотя ферменты с более широким диапазоном субстрата (E.С. 2.3.1.16) также будут эффективны. Ацетил-CoA-ацетилтрансферазы доступны из различных источников, например Escherichia coli (GenBank NO: NP_416728 (SEQ ID NO: 129), NC_000913 (SEQ ID NO: 128); аминокислотная последовательность NCBI (National Center for Biotechnology Information), нуклеотидная последовательность NCBI), Clostridium acetobutylicum (GenBank NO: NP_349476.1 (SEQ ID NO: 2), NC_003030 (SEQ ID NO: 1); NP_149242 (SEQ ID NO: 4), NC_001988 (SEQ ID NO: 3)), Bacillus subtilis (GenBank NO: NP_390297 (SEQ ID NO: 131), NC_000964 (SEQ ID NO: 130)) и Saccharomyces cerevisiae (GenBank NO: NP_015297 (SEQ ID NO: 133), NC_001148 (SEQ ID NO: 132)).

Термин «3-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназа» относится к ферменту, который катализирует превращение ацетоацетил-СоА в 3-гидроксибутирил-СоА. 3-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназы могут быть восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH)-зависимыми, с субстратным предпочтением для (S)-3-гидроксибутирил-СоА или (R)-3-гидроксибутирил-СоА, и классифицированы как Е.С. 1.1.1.35 и Е.С. 1.1.1.30 соответственно. Кроме того, 3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназы могут быть восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADHР)-зависимыми, с субстратным предпочтением для (S)-3-гидроксибутирил-СоА или (R)-3-гидроксибутирил-СоА, и классифицированы как Е.С. 1.1.1.157 и Е.С. 1.1.1.36 соответственно. 3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназы доступны из различных источников, например C.acetobutylicum (GenBank NO: NP_349314 (SEQ ID NO: 6), NC_003030 (SEQ ID NO: 5)), В.subtilis (GenBank NO: AAB09614 (SEQ ID NO: 135), U29084 (SEQ ID NO: 134)), Ralstonia eutropha (GenBank NO: YP_294481 (SEQ ID NO: 137), NC_007347 (SEQ ID NO: 136)) и Alcaligenes eutrophus (GenBank NO: AAA21973 (SEQ ID NO: 139), J04987 (SEQ ID NO: 138)).

Термин «кротоназа» относится к ферменту, который катализирует превращение 3-гидроксибутирил-СоА в кротонил-СоА и Н₂О. Кротоназы могут иметь субстратные предпочтения для (S)-3-гидроксибутирил-CoA или (R)-3-гидроксибутирил-CoA, и они классифицированы как E.C. 4.2.1.17 и E.C. 4.2.1.55 соответственно. Кротоназы доступны из различных источников, например E.coli (GenBank NO: NP_415911 (SEQ ID NO: 141), NC_000913 (SEQ ID NO: 140)), C.acetobutylicum (GenBank NO: NP_349318 (SEQ ID NO: 8), NC_003030 (SEQ ID NO: 6)), B.subtilis (GenBank NO: CAB13705 (SEQ ID NO: 143), Z99113 (SEQ ID NO: 142)) и Aeromonas caviae (GenBank NO: BAA21816 (SEQ ID NO: 145), D88825 (SEQ ID NO: 144)).

Термин «бутирил-CoA-дегидрогеназа» относится к ферменту, который катализирует превращение кротонил-СоА в бутирил-СоА. Бутирил-CoA-дегидрогеназы могут быть либо NADH-зависимыми, либо NADHP-зависимыми, и они классифицированы как E.С. 1.3.1.44 и E.C. 1.3.1.38 соответственно. Бутирил-CoA-дегидрогеназы доступны из различных источников, например C.acetobutylicum (GenBank NO: NP_347102 (SEQ ID NO: 10), NC_003030 (SEQ ID NO: 9)), Euglena gracilis (GenBank NO: Q5EU90 (SEQ ID NO: 147), AY741582 (SEQ ID NO: 146)), Streptomyces collinus (GenBank NO: AAA92890 (SEQ ID NO: 149), U37135 (SEQ ID NO: 148)) и Streptomyces coelicolor (GenBank NO: CAA22721 (SEQ ID NO: 151), AL939127 (SEQ ID NO: 150)).

Термин «бутиральдегиддегидрогеназа» относится к ферменту, который катализирует превращение бутирил-СоА в бутиральдегид с использованием NADH или NADPH в качестве кофактора. Бутиральдегиддегидрогеназы с предпочтением к NADH известны как E.C. 1.2.1.57 и доступны, например, из Clostridium beijerinckii (GenBank NO: AAD31841 (SEQ ID NO: 12), AF157306 (SEQ ID NO: 11)) и C.acetobutylicum (GenBank NO: NP_149325 (SEQ ID NO: 153), NC_001988 (SEQ ID NO: 152)).

Термин «бутанолдегидрогеназа» относится к ферменту, который катализирует превращение бутиральдегида в 1-бутанол с использованием либо NADH, либо NADPH в качестве кофактора. Бутанолдегидрогеназы доступны, например, из C.acetobutylicum (GenBank NO: NP_149325 (SEQ ID NO: 153), NC_001988 (SEQ ID NO: 152); примечание: этот фермент обладает действием и альдегид-, и алкогольдегидрогеназы; NP_349891 (SEQ ID NO: 14), NC_003030 (SEQ ID NO: 13) и NP_349892 (SEQ ID NO: 16), NC_003030 (SEQ ID NO: 15)) и E.coli (GenBank NO: NP_417484 (SEQ ID NO: 155), NC_000913 (SEQ ID NO: 154)).

Термин «факультативный анаэроб» относится к микроорганизму, который может расти и в аэробной, и в анаэробной среде.

Термин «углеродный субстрат» или «сбраживаемый углеродный субстрат» относится к источнику углерода, поддающемуся превращению в процессе обмена веществ организмами-хозяевами по настоящему изобретению, и определенным источникам углерода, выбранным из группы, состоящей из моносахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и одноуглеродных субстратов или их смесей.

Термин «ген» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который способен быть экспрессирован как специфический белок, при желании включающий регуляторные последовательности, предшествующие (5'-некодирующие последовательности) и последующие (3'-некодирующие последовательности) указанной кодирующей последовательности. «Нативный ген» означает ген, который встречается в природе, с его собственными регуляторными последовательностями. «Химерный ген» означает любой ген, который не является нативным геном, содержащий регуляторные и кодирующие последовательности, которые вместе не встречаются в природе. Соответственно химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, происходящие из одного и того же источника, но расположенные в порядке, отличном от того, который обнаружен в природе. «Эндогенный ген» относится к нативному гену при его природной локализации в указанном геноме организма. «Чужеродный» или «гетерологичный ген» означает ген, который обычно не обнаруживается в организме-хозяине, но который встроен в организм-хозяин посредством переноса гена. Чужеродные гены могут включать нативные гены, встроенные в ненативные организмы, или химерные гены. «Трансген» представляет собой ген, который был встроен в геном в результате процесса трансформации.

Используемый в настоящем описании термин «кодирующая последовательность» относится к последовательности ДНК, которая кодирует определенную аминокислотную последовательность. «Подходящие регуляторные последовательности» относятся к нуклеотидным последовательностям, располагающимся выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) от кодирующей последовательности, которые влияют на транскрипцию, процессинг РНК, или стабильность, или трансляцию связанной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать промоторы, лидерные последовательности для трансляции, интроны, последовательности распознавания для полиаденилирования, участок процессирования РНК, участок связывания эффектора и структуру типа «стебель-петля».

Термин «промотор» относится к последовательности ДНК, способной регулировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. В большинстве случаев кодирующая последовательность расположена в 3'-положении от последовательности промотора. Промоторы могут происходить полностью из нативного гена, или могут состоять из различных элементов, полученных из различных промоторов, обнаруженных в природе, или даже включать сегменты синтетической ДНК. Специалисту в уровне техники понятно, что различные промоторы могут направлять экспрессию гена в различных тканях или клеточных типах, или на разных этапах развития, или в ответ на различные условия окружающей среды или физиологические состояния. Промоторы, которые обеспечивают экспрессию гена в большинстве клеточных типов в большинстве случаев, обычно называются «конститутивными промоторами». Дополнительно признано, что поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не были полностью определены, фрагменты ДНК различной длины могут иметь идентичные промоторные активности.

Термин «функционально связанный» относится к ассоциации последовательностей нуклеиновых кислот на отдельном фрагменте нуклеиновой кислоты таким образом, что на функцию одной влияет другая. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности (то есть указанная кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем указанного промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в прямом или обратном направлении.

Используемый в настоящем описании термин «экспрессия» относится к транскрипции и стабильной аккумуляции смысловой (мРНК) или антисмысловой РНК, полученной из указанного фрагмента нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Экспрессия также может относиться к трансляции мРНК в полипептид.

Используемый в настоящем описании термин «трансформация» относится к переносу фрагмента нуклеиновой кислоты внутрь организма-хозяина, что приводит к генетически стабильному наследованию. Организмы-хозяева, содержащие указанные трансформированные фрагменты нуклеиновых кислот, называются «трансгенными», или «рекомбинантными», или «трансформированными» организмами.

Термины «плазмида», «вектор» и «кассета» относятся к дополнительному хромосомному элементу, зачастую несущему гены, которые не являются частью центрального метаболизма указанной клетки и обычно находятся в виде кольцевых двуцепочечных фрагментов ДНК. Такими элементами могут быть автономно реплицирующиеся последовательности, геномные интегрирующие последовательности, фаговые или нуклеотидные последовательности линейной или кольцевой, одно- или двуцепочечной ДНК или РНК, полученные из любого источника, в которых ряд нуклеотидных последовательностей объединен или рекомбинирован в уникальную конструкцию, которая допускает встраивание промоторного фрагмента и последовательности ДНК для выбранного генного продукта наряду с соответствующей 3'-нетранслируемой последовательностью внутрь клетки. «Кассета для трансформации» относится к специфическому вектору, включающему чужеродный ген и имеющему элементы в дополнение к указанному чужеродному гену, что облегчает трансформацию конкретной клетки-хозяина. «Экспрессионная кассета» относится к определенному вектору, включающему чужеродный ген и имеющему элементы в дополнение к указанному чужеродному гену, которые делают возможной усиленную экспрессию указанного гена в чужеродном хозяине.

Используемый в настоящем описании термин «вырожденность кода» относится к природе генетического кода, допускающей изменение указанной нуклеотидной последовательности без влияния на аминокислотную последовательность кодируемого полипептида. Квалифицированный специалист хорошо осведомлен о «статистическом отклонении от равномерности в использовании кодонов», проявляемом определенной клеткой-хозяином при использовании нуклеотидных кодонов для определения указанной аминокислоты. Поэтому при синтезировании гена для улучшенной экспрессии в клетке-хозяине желательно сконструировать указанный ген таким образом, чтобы его частота использования кодона приближалась к частоте предпочтительного использования кодона указанной клетки-хозяина.

Термин «кодон-оптимизированный», когда он относится к генам или кодирующим областям молекул нуклеиновых кислот для трансформации различных организмов-хозяев, относится к изменению кодонов в указанном гене или кодирующих областях указанных молекул нуклеиновых кислот для отображения типичного использования кодонов указанного организма-хозяина без изменения указанного полипептида, кодируемого указанной ДНК.

Используемые в настоящем описании стандартные технологии рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования хорошо известны в уровне техники и описаны Sambrook, J., Fritsch, E.F. и Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (в дальнейшем «Maniatis»); Silhavy, T.J., Bennan, M.L. и Enquist, L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); и Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc and Wiley-Interscience (1987).

Биосинтетический путь 1-бутанола

Микроорганизмы, утилизирующие углеводы, задействуют путь Эмбден-Мейергофа-Парнаса (EMP), путь Энтнера-Дудороффа и пентозофосфатный цикл в качестве центральных путей метаболизма для обеспечения энергии и клеточных предшественников для роста и поддержания. Указанные пути имеют главным образом промежуточное соединение глицеральдегид-3-фосфат, и в конечном счете пируват образуется непосредственно или в сочетании с путем ЕМР. Затем пируват трансформируется в ацетил-коэнзим А (ацетил-СоА) различными способами, в том числе в результате контактирования с пируватдегидрогеназным комплексом, пируват-формиатлиазой и пируват-ферредоксин оксидоредуктазой. Ацетил-СоА служит ключевым промежуточным звеном, например, при образовании жирных кислот, аминокислот и вторичных метаболитов. Указанные комбинированные реакции по превращению сахара в ацетил-СоА приводят к образованию энергии (например, аденозин-5'-трифосфат, АТФ) и восстановленных эквивалентов (например, восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, NADH, и восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат, NADPH). NADH и NADPH должны быть возвращены в повторный цикл для получения их окисленных форм (NAD⁺ и NADP⁺ соответственно). В присутствии неорганических акцепторов электронов (например, O₂, NO₃ ^- и SO₄ ^2-), указанные восстановленные эквиваленты можно использовать для увеличения энергетического пула; альтернативно, может быть образован восстановленный углеродный побочный продукт. Продукция этанола и 1-бутанола в результате указанного углеводного брожения является примером последнего.

Настоящее изобретение делает возможным получение 1-бутанола из источников углевода с помощью рекомбинантных микроорганизмов, обеспечивая законченный биосинтетический путь 1-бутанола из ацетил-СоА до 1-бутанола, как показано на чертеже. Указанный биосинтетический путь, как правило, отсутствующий в указанном микробном сообществе по причине отсутствия генов или отсутствия соответствующей генной регуляции, включает следующие превращения (конверсии) субстрата в продукт:

a) ацетил-CoA в ацетоацетил-CoA, катализируется, например, ацетил-CoA-ацетилтрансферазой;

b) ацетоацетил-CoA в 3-гидроксибутирил-CoA, катализируется, например, 3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназой;

c) 3-гидроксибутирил-CoA в кротонил-CoA, катализируется, например, кротоназой;

d) кротонил-CoA в бутирил-CoA, катализируется, например, бутирил-CoA-дегидрогеназой;

e) бутирил-CoA в бутиральдегид, катализируется, например, бутиральдегиддегидрогеназой;

f) бутиральдегид в 1-бутанол, катализируется, например, бутанолдегидрогеназой.

В указанном пути не требуется АТФ и продуцируется NAD⁺ и/или NADP⁺, таким образом, сохраняется равновесие с центральным путем метаболизма, в котором продуцировался ацетил-СоА. Способность природных организмов производить 1-бутанол посредством брожения существует редко и проявляется наиболее заметно у Clostridium beijerinckii и Clostridium acetobutylicum. Описана генная организация и генная регуляция для Clostridium acetobutylicum (L. Girbal и P. Soucaille, Trends in Biotechnology 216: 11-16 (1998)). Тем не менее, многие из указанных ферментативных действий связаны также с альтернативными путями, например использование углеводорода, окисление жирных кислот и метаболизм полигидроксиалканоата. Таким образом, в обеспеченном рекомбинантном пути из ацетил-СоА в 1-бутанол существует целый ряд возможностей для осуществления индивидуальных стадий реакций, и специалист в уровне техники будет способен использовать публично доступные последовательности для конструкции соответствующих путей. Список репрезентативного ряда генов, известных в уровне техники и пригодных для конструкции биосинтетического пути 1-бутанола, представлен ниже в таблице 2.

Таблица 2 Источники генов биосинтетического пути 1-бутанола
Ген	Ссылка на GenBank
ацетил-CoA-ацетилтрансфераза	NC_000913 Escherichia coli K12, полный геном gi|49175990|ref|NC_000913.2|[49175990]
	NC_001988 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 плазмида pSOL1, полная последовательность gi|15004705|ref|NC_001988.2|[15004705]
	NC_000964 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168, полный геном gi|50812173|ref|NC_000964.2|[50812173]
	NC_001148 Saccharomyces cerevisiae хромосома XVI, полная последовательность хромосомы gi|50593503|ref|NC_001148.3|[50593503]
	CP000017 Streptococcus pyogenes MGAS5005, полный геном gi|71852596|gb|CP000017.1|[71852596]
	NC_005773 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A, полный геном gi|71733195|ref|NC_005773.3|[71733195]
	CR931997 Corynebacterium jeikeium K411 полный геном gi|68262661|emb|CR931997.1|[68262661]
3-гидроксибутирил-CoA-дегидрогеназа	NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, полный геном gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
	U29084 Bacillus subtilis гены (mmgA), (mmgB), (mmgC) и цитрат синтазы III (mmgD), полная кодирующая последовательность, и ген (mmgЕ), частичная кодирующая последовательность gi|881603|gb|U29084.1|BSU29084[881603]
	NC_007347 Ralstonia eytropha JMP134 Raeut01_1, последовательность полного генома, полученная секвенированием методом «выстрела из дробового ружья», gi|45517296|ref|NZ_AADY01000001.1|[45517296]
	J04987 A.eutrophus гены бета-кетотиолазы (phbA) и ацетоацетил-CoA-редуктазы (phbВ), полная кодирующая последовательность gi|141953|gb|J04987.1|AFAKTLAACA[141953]
	NC_004129 Pseudomonas fluorescens Pf-5, полный геном gi|70728250|ref|NC_004129.6|[70728250]
	NC_000913 Escherichia coli K12, полный геном gi|49175990|ref|NC_000913.2|[49175990]
	NC_004557 Clostridium tetani E88, полный геном gi|28209834|ref|NC_004557.1|[28209834]
	NC_006350 Burkholderia pseudomallei K96243 хромосома 1, полная последовательность gi|53717639|ref|NC_006350.1|[53717639]
	NC_002947 Pseudomonas putida KT2440, полный геном gi|26986745|ref|NC_002947.3|[26986745]
кротоназа	NC_000913 Escherichia coli K12, полный геном gi|49175990|ref|NC_000913.2|[49175990]
	NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, полный геном gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
	Z99113 Bacillus subtilis полный геном (сегмент 10 из 21): с 1807106 до 2014934 gi|32468758|emb|Z99113.2|BSUB0010[32468758]
	D88825 Aeromonas caviae ген phaC для PHA-синтазы, полная кодирующая последовательность gi|2335048|dbj|D88825.1|[2335048]
	NC_006274 Bacillus cereus ZK, полный геном gi|52140164|ref|NC_006274.1|[52140164]
	NC_004557 Clostridium tetani E88, полный геном gi|28209834|ref|NC_004557.1|[28209834]
бутирил-CoA-дегидрогеназа	NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, полный геном gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
	AY741582 Euglena gracilis мРНК транс-2-еноил-CoA-редуктазы, полная кодирующая последовательность gi|58201539|gb|AY741582.1|[58201539]
	U37135 Streptomyces collinus ген кротонил-CoA-редуктазы (ccr), полная кодирующая последовательность gi|1046370|gb|U37135.1|SCU37135[1046370]
	AL939127 Streptomyces coelicolor A3(2) полный геном, сегмент 24/29 gi|24429552|emb|AL939127.1|SCO939127[24429552]
	AP006716 Staphylococcus haemolyticus JCSC1435, полный геном gi|68445725|dbj|AP006716.1|[68445725]
	NC_006274 Bacillus cereus ZK, полный геном gi|52140164|ref|NC_006274.1|[52140164]
	NC_004557 Clostridium tetani E88, полный геном gi|28209834|ref|NC_004557.1|[28209834]
бутиральдегиддегидрогеназа	AF157306 Clostridium beijerinckii штамм NRRL B593 гипотетический белок, альдегиддегидрогеназа (ald), ацилирующая коэнзим А, гены ацетоацетат:бутират/ацетат коэнзим А трансферазы (ctfA), ацетоацетат:бутират/ацетат коэнзим А трансферазы (ctfВ) и ацетоацетат декарбоксилазы (adc), полная кодирующая последовательность gi|47422980|gb|AF157306.2|[47422980]
	NC_001988 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 плазмида pSOL1, полная последовательность gi|15004705|ref|NC_001988.2|[15004705]
	AY251646 Clostridium saccharoperbutylacetonicum sol оперон, полная последовательность gi|31075382|gb|AY251646.1|[31075382]
бутанолдегидрогеназа	NC_001988 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 плазмида pSOL1, полная последовательность gi|15004705|ref|NC_001988.2|[15004705]
	NC_003030 Clostridium acetobutylicum ATCC 824, полный геном gi|15893298|ref|NC_003030.1|[15893298]
	NC_000913 Escherichia coli K12, полный геном gi|49175990|ref|NC_000913.2|[49175990]
	NC_003198 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18, полный геном gi|16758993|ref|NC_003198.1|[16758993]
	BX571966 Burkholderia pseudomallei штамм K96243, хромосома 2, полная последовательность gi|52211453|emb|BX571966.1|[52211453]
	Z99120 Bacillus subtilis полный геном (сегмент 17 из 21): с 3213330 до 3414388, gi|32468813|emb|Z99120.2|BSUB0017[32468813]
	NC_003366 Clostridium perfringens str. 13, полный геном gi|18308982|ref|NC_003366.1|[18308982]
	NC_004431 Escherichia coli CFT073, полный геном gi|26245917|ref|NC_004431.1|[26245917]

Микробные организмы-хозяева для получения 1-бутанола

Микробные организмы-хозяева для получения 1-бутанола могут быть выбраны из бактерий, цианобактерий, мицелиальных грибов и дрожжей. Указанный микробный организм-хозяин для получения 1-бутанола предпочтительно устойчив к 1-бутанолу, таким образом, выход продукта не ограничен токсичностью бутанола. Микробы, которые метаболически активны при высоких уровнях титра 1-бутанола, не известны в уровне техники. Несмотря на то что мутанты, устойчивые к бутанолу, были выделены из сольвентогенной Clostridia, в наличие имеется немного информации об указанной устойчивости к бутанолу других потенциально пригодных бактериальных штаммов. Большинство исследований по сравнению устойчивости к действию спирта у бактерий показывают, что бутанол более токсичен, чем этанол (de Cavalho et al., Microsc. Res. Tech. 64: 215-22 (2004), и Kabelitz et al., FEMS Microbiol. Lett. 220: 223-227 (2003)). Tomas et al. (J. Bacteriol. 186: 2006-2018 (2004)) сообщает, что выход бутанола в результате сбраживания в Clostridium acetobutylicum может быть ограничен токсичностью бутанола. Основным эффектом бутанола на Clostridium acetobutylicum является нарушение мембранных функций (Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 50: 1238-1243 (1985)).

Микробные организмы-хозяева, выбранные для получения 1-бутанола, предпочтительно устойчивы к 1-бутанолу и способны превращать углеводы в 1-бутанол. Критерии отбора подходящих микробных организмов-хозяев включают следующие: природная устойчивость к 1-бутанолу, высокая скорость утилизации глюкозы, возможность использовать генетические механизмы для манипуляций с геном и способность к генерированию стабильных хромосомных изменений.

Подходящие штаммы-хозяева с устойчивостью к 1-бутанолу можно определить в результате скрининга исходя из природной устойчивости указанного штамма. Указанная природная устойчивость микробов к 1-бутанолу может быть измерена посредством определения концентрации 1-бутанола, которая приводит к 50% ингибированию скорости роста (IC₅₀), при выращивании в минимальной среде. Значения IC₅₀ можно определить с использованием методов, известных в уровне техники. Например, представляющие интерес микробы можно выращивать в присутствии различных количеств 1-бутанола и скорость роста контролировать посредством измерения оптической плотности при 600 нанометрах. Время удвоения можно вычислить по логарифмической составной части кривой роста и использовать в качестве меры скорости роста. Полученная концентрация 1-бутанола, которая приводит к 50% ингибированию роста, может быть определена по графику зависимости процента ингибирования роста от концентрации 1-бутанола. Предпочтительно, указанный штамм-хозяин должен иметь IC₅₀ для 1-бутанола более приблизительно 0,5% вес./об.ъем.

Микробный хозяин для получения 1-бутанола также должен утилизировать глюкозу с высокой скоростью. Большинство микробов спосо