Средство, обладающее антидепрессантным, анксиолитическим, нейропротекторным и иммуностимулирующим действием

Средство, обладающее антидепрессантным, анксиолитическим, нейропротекторным и иммуностимулирующим действием

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается расширения сферы применения производных глутаминовой (глютаминовой) кислоты в виде гидрохлорида 3-фенилглутаминовой кислоты в качестве антидепрессантного, анксиолитического, нейропротекторного и иммуностимулирующего средства.

Современные социоэкономические условия отличаются обилием стрессовых ситуаций и характеризуются высокой распространенностью психоневрологических заболеваний, при этом неуклонно растет доля пограничных психических расстройств, сопровождающихся тревожно-депрессивной симптоматикой, когнитивным дефицитом, астено-невротическими проявлениями, снижением иммунитета, физической и умственной работоспособности. Многие из известных антидепрессантов обладают недостаточной клинической эффективностью, медленным развитием клинически значимого эффекта, низкими избирательностью и широтой терапевтического действия, достаточно высокой токсичностью, серьезными побочными эффектами, что в значительной мере ограничивает их использование в широкой медицинской практике и сужает область возможного применения. Кроме того, многие из высокоэффективных применяемых антидепрессантных средств, в частности трициклические, проявляют выраженное психоугнетающее действие, нарушают внимание и память, что снижает качество жизни и ограничивает широту их использования в клинике [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2008]. Данные тенденции диктуют необходимость поиска и разработки новых высокоэффективных и малотоксичных нейропсихотропных лекарственных препаратов с широким спектром активности, позволяющим осуществлять фармакологическую коррекцию совокупности симптомов психоневрологических заболеваний без полипрагмазии, безопасных при длительном применении, в том числе работающими лицами.

Одним из наиболее продуктивных путей поиска психотропных веществ является создание производных естественных нейромедиаторов, через системы которых психотропные препараты реализуют свои эффекты. Глутаминовая кислота является основным возбуждающим нейротрансмиттером в центральной нервной системе (ЦНС), присутствует в структурах головного мозга, участвует в регуляции его функций, включая высшие интегративные функции (поведение, условно-рефлекторная деятельность, эмоции, память), а также модулирует активность иммунной системы. Собственно глутаминовая кислота (α-аминоглутаровая кислота общей формулы НООС (СН₂)₂ (NH₂) СООН) применяется в медицине в качестве психотропного препарата и относится к фармакологическим группам: Другие нейротропные препараты; Ноотропы - Торговое название: Глутаминовая кислота, (МНН Глутаминовая кислота, Glutamic acid), выпускается в следующих лекарственных формах: таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, таблетки покрытые оболочкой ("Татхимфармпрепараты"), гранулы для приготовления суспензии для приема внутрь [Новости регистрации препаратов. 2-й квартал 2000. Препараты отечественного производства. Обзор. Докт. мед. наук Шустов Е.Б. //http://www.pharmindex.ru/navigator/reg_2_1.html]. Препарат оказывает ноотропное, противосудорожное действие. В медицинской практике глутаминовая кислота используется при лечении заболеваний ЦНС: эпилепсии (преимущественно малые припадки с эквивалентами), психозов (соматогенных, интоксикационных, инволюционных), реактивных состояний, протекающих с явлениями истощения, депрессии и др. [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2008]. Наиболее специфичным побочным эффектом глутаминовой кислоты является возбуждение различной степени выраженности, что ограничивает ее клиническое применение.

Вещество глутаминовая кислота не обладает собственно антидепрессантым и анксиолитическим действием, такого рода фармакологические эффекты для собственно глутаминовой кислоты не описаны.

Известно использование производного глутаминой кислоты в виде N-ацетил-альфа-глутаминовой кислоты в качестве компонента эффективного психотропного препарата ноотропного действия [Патент РФ №2068408 от 24.06.1992]. N-ацетил-L-глутаминовая кислота входит, в частности, в состав ноотропного препарата с психостимулирующей активностью нооклерин, для приема внутрь [Инструкция по применению препарата "Нооклерин" утвержденаная Фармакологическим комитетом Минздрава России 14.06.2001]. Препарат обладает ноотропным, церебропротекторным и психостимулирующим действием [Реестр Лекарственных Средств Российской Федерации //http://reles.ru/cat/tradefm/Nooclerin/2/].

Противопоказания: Повышенная чувствительность к компонентам препарата, инфекционные заболевания ЦНС, лихорадочные состояния, заболевания системы крови, психотические состояния, выраженные нарушения функции печени и почек, беременность (I триместр), период лактации. Антидепрессантные и анксиолитические эффекты нооклерина не описаны.

Известны основание N-(5-гидроксиникотиноил)-L-глутаминовой кислоты (нооглютил), обладающие противоинсультным, геропротекторным, ноотропным и противогипоксическим действием, и одно- и двухвалентные соли N-(5-гидроксиникотиноил)-L-глутаминовой кислоты (общей формулы (НО) C₆H₅N) (CONH) СН (СООХ) (СН₂)₂ COOY, где X=Y либо Na либо К или СаОН), отличающиеся наличием психотропных эффектов (антидепрессивного и анксиолитического) и нейропротекторной активностью [Патент РФ №2314293 от 31.07.2006].

Известно производное глютаминовой кислоты - пептид (общей формулы R NH СН(СООН)(СН₂)n СОХ, где n=1, 2; R=водород, низший ацил или низший алкил; X - гетероароматическая аминокислота); обладающий иммуномодулирующей активностью [Патент РФ №2142958 от 25.12.1997]. Тамже описывается препарат (лекарственное средство), обладающий иммуномодулирующей активностью, содержащий указанный пептид и служебные добавки.

Фармакологическая активность фенил-производных глутаминовой кислоты не описана.

Известными анксиолитическими препаратами являются производные бензодиазепинового ряда, в частности, диазепам, феназепам. Однако, наряду с анксиолитической активностью они обладают выраженными побочными эффектами - вызывают миорелаксацию, снижение мышечного тонуса, общее седативное действие, дневную сонливость, нарушение памяти, а при длительном применении - привыкание, лекарственную зависимость. Известным церебропротекторным средством является пирацетам, который имеет невысокую эффективность и побочные явления. Пирацетам может вызвать нарушение сна, повышение судорожной готовности, общее, неспецифическое возбуждение.

В медицине широко используют в качестве транквилизаторов производные гамма-аминомасляной кислоты (бутановой кислоты), в частности, гидрохлорид 3-фенил-4-гамма-аминомасляной кислоты под названием фенибут (общей формулы H₂N СН₂СН(С₆Н₆) СН₂ СООН·HCl), обладающий ноотропной активностью, оказывающим анксиолитическое действие [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2008]. Антидепрессантная активность фенибута не описана. Соли 4-амино-3-фенил-бутановой кислоты (общей формулы X·n (H₂N СН₂ СН (Ph) СН₂ СООН), где X - кислота (лимонная либо щавелевая либо янтарная, либо яблочная), n=3 либо 2), известные своей ноотропной активностью [Патент РФ №2220131 от 28.02.2002], обладают анксиолитическими и церебропротекторными свойствами [Патент РФ по заявке № от 2008152660 от 29.12.2008].

Принимая во внимание широту и физиологическую значимость нейромедиаторных аминокислот, в частности, производных глутаминовой. кислоты, поиск и создание на ее основе новых фармакологически активных структурных аналогов, с предполагаемым психотропным действием и возможностью терапевтического применения, перспективен.

Задача изобретения - получить эффективное малотоксичное средство на основе глутаминовой кислоты, обладающее выраженным антидепрессантным действием с высокой скоростью развития клинически значимого эффекта, анксиолитическим, нейропротекторным и иммуностимулирующим действием, а также ноотропными свойствами, расширить ассортимент подобных средств.

Поставленная задача реализуется предлагаемым средством, включающим производное глутаминовой кислоты: гидрохлорид 3 -фенилглутаминовой кислоты.

Впервые обнаружено, что гидрохлорид 3 - фенилглутаминовой кислоты обладает антидепрессантным, анксиолитическим, нейропротекторным и иммуностимулирующим действием. Сущность изобретения заключается в применении в качестве антидепрессантного, анксиолитического, нейропротекторного и иммуностимулирующего средства известного вещества - гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты общей формулы

При этом средство обладает комплексом биологически активных свойств, превышающих таковые или отсутствующие у исходного вещества, по сравнению с рядом известных лекарственных препаратов целевого назначения проявляет:

- в дозе 13 и 26 мг/кг выраженное антидепрессивное действие, не уступающее действию мелипрамина (15 мг/кг) и значительно превосходящее эффект коаксила (12,5 мг/кг) и флуоксетина (20 мг/кг);

- анксиолитическую активность, превышающую активность коаксила и афобазола (5 мг/кг) и сопоставимую с действием диазепама (1 мг/кг);

- умеренные активирующие свойства, сопоставимые с мелипрамином, нейропротекторный эффект не уступающий эффекту фенибута (25 мг/кг);

- в дозе 30 мг/кг стимулирующее влияние на клеточное и гуморальное звено первичного иммунного ответа, способствует усилению, лимфо-пролиферативных процессов в иммунокомптентных органах, обладая выраженным иммуностимулирующим действием.

Синтез гидрохлорида 3-фенилглутаминовой кислоты двухстадийный, включает взаимодействие 1,1-иметоксикарбонил-2-фенилэтена с ацетиламино-малоновым эфиром и последующий гидролиз в разбавленной (1:1) соляной кислоте образующегося промежуточного продукта диметил-2-ацетиламино-2,4-диметоксикарбонил-3-фенилглутароата [Кобзарева В.К., Дейко Л.И., Васильева О.С, Берестовицкая В.М., Беркова Г.А. Новый метод синтеза 3-фенилглутаминовой кислоты // ЖОХ. 1997. Т.33. Вып.8. с.1180-1181].

Пример получения гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты.

Первая стадия. К раствору метилата натрия, полученному из 3,9 мл метанола и 0,15 г (0,0065 моль) металлического натрия при перемешивании прибавляют 1,4 г (0,0065 моль) диэтилацетиламиномалоната и выдерживают смесь до полного растворения осадка. Затем порциями вносят раствор 1,43 г (0,0065 моль) 1,1-диметоксикарбонил-2-фенилэтена в 10 мл метанола, поддерживая температуру 0÷5°C. Реакционную массу выдерживают при перемешивании в течение одного часа и выливают на крошку льда с рассчитанным на натрий количеством соляной кислоты (1 мл) (рН~7): Кристаллический продукт отфильтровывают и получают 2 г (75%) диметил-2-ацетиламино-2,4-диметоксикарбонил-3-фенилглутароата. Вторая стадия. Раствор 2,46 г (0,0065 моль) диметил-2-ацетиламино-2,4-диметоксикарбонил-3-фенилглутароата в 60 мл разбавленной (1:1) соляной кислоты кипятят в течение 9 часов. Гидролизат упаривают при пониженном давлении. Остаток обрабатывают ацетоном. Кристаллический продукт отфильтровывают и получают 1,10 г (70%) гидрохлорида 3-фенилглутаминовой кислоты.

Синтезированный гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты имеет следующие физико-химические свойства. Температура плавления 186-188°C (ацетон-вода 1:1). ИК спектр (KBr), ν, см^-1: 1700-1720 (C=0); 3300-2650 (NH). Спектр ЯМР¹Н, (ДМСО-d₆), δ, м. д.: 2,68-3,15 к (CH₂COO); 4,08 м (CHCOO); 3,70 м (CH-Ar); 9,50 (NH₃ ⁺); 7,17-7,38 (С₆Н₅): Найдено, %: C 50,88; 50,84; Н 5,49; 5,50; N 5,35; 5,39 C₁₁H₁₄NO₄Cl. Вычислено, %: C 50,88; Н 5,43; N 5,39.

Острая токсичность средства гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты, оцениваемая по выживаемости белых мышей через 24 часа после введения средства исследовалась с использованием двух предполагаемых путей введения средства: парентерального (внутрибрюшинного) и энтерального (внутрижелудочного). Для расчета величины токсикологического показателя LD₅₀ использовали пробит-анализ выживаемости [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, под ред. Хабриева Р.У., 2005]. Усредненные значения показателя LD₅₀, мг/кг: при парентеральном введении порядка 800-900, при энтеральном введении более 3000 (различие значений LD₅₀ при двух путях введения, вероятно, обусловлено медленным или неполным всасыванием при энтеральном введении). Результаты позволяют классифицировать гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты как средство малотоксичное.

Далее приводятся примеры, иллюстрирующие специфическую активность гидрохлорида 3-фенилглутаминовой кислоты, обладающего психотропным эффектом антидепрессивного, анксиолитического, нейропротекторного действия и иммуностимулирующим действием.

Для демонстрации указанной фармакологической эффективности средства - гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты использованы установленные приемы выявления поведенческой активности животных; набором психофармакологических экспериментальных стандартных тестов (методик): «Открытое поле» (ОП); «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПК Л); «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ); «Экстраполяционного избавления» (ТЭИ); «Конфликтная ситуация по Вогелю» (КС); «Подвешивания мышей за хвост» (ПМХ); «Неизбегаемого принудительного плавания» по Порсолту (НПП) и другие, с учетом требований Фармакологического комитета Российской Федерации, изложенных в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». М.: Медицина. 2005, с применением статистических методов обработки (оценки) результатов исследования, которые позволяют оценить и силу фармакологической эффективности, и степень его селективности [Хаунина Р.А., Лапин И.П., 1976., Воронина Т.А., 1982; Гельман В.Я., Кременевская С.И., 1990; Pellow S. et al., 1985; Буреш Я., Бурещова О., Хьюстон Д.П., 1991. Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000; Бондаренко Н.А., 1992; Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2000; Porsolt R.D. et al., 1977]. Суть данного подхода - сравнительный анализ поведенческих эффектов изучаемых соединений у сопоставляемых групп животных. В работе были использованы белые беспородные крысы-самцы, рандомизированные по возрасту и массе, содержавшиеся в условиях лабораторного вивария, в течение не менее двух недель до начала эксперимента, на стандартном пищевом рационе, при свободном доступе к воде, при естественном световом режиме (содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (ГОСТ Р 51000.3-96 и ГОСТ Р 51000.4-96) и Приказу Минздрава России №267 от 19.06.2003 года «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, 1997 г.). Эксперименты проводились в одно и то же время суток. Контрольным животным в эквивалентном объеме вводили воду для инъекций. Приводимые в таблицах значения показателей представляют собой среднестатистическую оценку результатов измерения параметров с учетом принятых уровней достоверности (р<0,05; р<0,01).

Оценка эффективности гидрохлорида-3-фенилглутаминовой кислоты выполнялась сопоставлением с активностью наиболее эффективных лекарственных препаратов аналогичных направлений действия, применяемых в клинической практике:

афобазол - анксиолитик с легким стимулирующим (активирующим) эффектом, у препарата отсутствуют миорелаксантные свойства, негативное влияние на память и внимание;

диазепам - анксиолитик, обладает успокаивающим, снотворным, противосудорожным, миорелаксантным и амнестическим действием. Усиливает действие снотворных, наркотических, нейролептических, анальгетических препаратов;

мелипрамин - антидепрессант, обладает психостимулирующим действием;

тианептин (коаксил) антидепрессант, занимает промежуточное положение между седативными и стимулирующими антидепрессантами, не оказывает отрицательного влияния на память, сон и способность к концентрации внимания;

фенибут - препарат с ноотропным и анксиолитическим действием, обладает транквилизирующей активностью, уменьшает напряженность, тревогу, страх, улучшает сон. Удлиняет и усиливает действие снотворных, наркотических, нейролептических веществ;

фенотропил - ноотропный препарат с нейропротекторным, противосудорожным, анксиолитическим и антидепрессивным действие;

флуокситин (прозак) - антидепрессант, способствует улучшению настроения, уменьшает чувство страха и напряжения, устраняет дисфорию, не вызывает седативного эффекта.

Антидепрессантное действие

Пример 1. Исследуемое средство: гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты (далее и в таблицах обозначен как гидрохлорид 3-ФГК, либо как (исследуемое, предлагаемое) средство), вводился животным внутрибрюшинно, однократно в дозе, составляющей 1/10 от молекулярной массы (согласно [Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, под ред. Хабриева Р.У., 2005]), то есть 26 мг/кг, а также с двукратным уменьшением (13 мг/кг) и увеличением (52 мг/кг) и в дозе 80 мг/кг (составляющей 1/10 от LD₅₀, которую принято считать максимальной потенциально безопасной). Исследуемое средство, а также препараты сравнения разводились в 2%-ной крахмальной слизи, в эквивалентном объеме, непосредственно перед использованием, и вводились однократно за 45 мин до выполнения тестов и 14-дневным курсом (с последним введением за 45 мин до выполнения тестов) внутрижелудочно через зонд. Контрольные животные получали аналогичный раствор крахмальной слизи в эквивалентном объеме по аналогичной схеме. Результаты представлены в табл.1-3 Гидрохлорид 3-ФГК в дозе 26 мг/кг при однократном введении животным статистически значимо увеличивает латентный период до развития иммобильности и уменьшает суммарное время иммобилизации у животных; также статистически достоверно повышает количество прыжков у животных, что свидетельствует о выраженном антидепрессивном действии. При курсовом введении гидрохлорид 3-ФГК статистически значимо увеличивает латентный период до развития иммобильности и уменьшает суммарное время иммобилизации у животных, а также повышает количество прыжков, что указывает на антидепрессивное действие средства. Сопоставление антидепрессантной активности средства и препаратов сравнения аналогичного назначения показало, что в тесте принудительного плавания средство, как и препараты, глутафен, коаксил, флуоксетин и мелипрамин, оказывают выраженное антидепрессивное действие: статистически значимо увеличивали латентный период иммобилизации, количество прыжков и продолжительность активного плавания, а также достоверно уменьшали продолжительность иммобилизации у животных. При этом по влиянию на показатели теста НПП средство статистически значимо превосходит коксил и флуоксетин и не уступает мелипрамину. Средство статистически значимо превосходит по выраженности антидепрессивного эффекта такие антидепрессанты, как ингибитор обратного нейронального захвата серотонина - флуоксетин (прозак), и трициклический антидепрессант, усиливающий нейрональный захват серотонина, - тианептин (коаксил). Помимо того, в отличие от данных препаратов, не вызывает седации и нарушения скорости реакций, а наоборот, обладает активирующим эффектом и способностью повышать скорость ориентировочных реакций.

Заключение. Гидрохлорид. 3-фенилглутаминовой кислоты проявляет выраженную антидепрессантную активность как при курсовом, так и при однократном применении, наиболее выраженную в дозах 13 и 26 мг/кг. Антидепрессивное действие предлагаемого средства (26 мг/кг) значительно превосходит эффект коаксила (12,5 мг/кг) и флуоксетина (20 мг/кг), не уступает действию мелипрамина (15 мг/кг). Однако, в отличие от последнего, средство не нарушает памяти и внимания, а напротив, (как это следует из последующих примеров), проявляет ноотропные свойства (в условиях нарушения функций стрессорного и судорожного генеза способствует сохранению памяти). Кроме того, в отличие от мелипрамина средство обладает более широким спектром психотропного действия, включающим также выраженный анксиолитический эффект и нейропротекторную активность, что расширяет область его возможного клинического применения.

Анксиолитическое действие

Пример 2. Исследуемое средством дозировки вводились животным так же, как и в примере 1. Применены специфические тесты классической модели тревоги ПКЛ и КС (Вогеля). Результаты представлены в табл.4-5. В дозах 26 и 52 мг/кг средство достоверно увеличивало продолжительность пребывания крыс в светлых рукавах лабиринта, количество выходов в них и количество свешиваний с них, что является выраженным проявлением анксиолитической активности. При этом во всех использованных дозах средство статистически значимо увеличивало количество выходов в открытые рукава и суммарную двигательную активность (число переходов между рукавами) у животных, что говорит о наличии у него в данных дозах активирующего действия. В дозах 26, 52 и 80 мг/кг вещество достоверно уменьшало латентный период выхода крыс из центральной зоны, что может быть связано как с его активирующим действием и повышением локомоторной активности, так и с повышением скорости ориентировочных реакций. Средство в дозе 13 мг/кг не оказывало подобного эффекта - не влияло на время, проводимое животными в центральной зоне. Таким образом, в тесте ПКЛ средство по влиянию на поведение животных в широком диапазоне доз от 13 до 52 мг/кг проявляет выраженное анксиолитическое действие. В интервале доз от 26 до 80 мг/кг средство ускоряет ориентировочные реакции у животных. Во всех использованных дозах средство стимулирует двигательную активность у животных, проявляя активирующий эффект. В тесте КС (Вогеля) установлено, что в дозах 13 и 26 мг/кг средство достоверно снижало латентный период первого наказуемого взятия воды из поилки, в интервале доз от 26 до 80 мг/кг статистически значимо повышало количество наказуемых попыток утолить жажду, проявляя явные анксиолитические свойства. В тесте ПКЛ средство увеличивало количество заходов животных в открытые рукава, количество свешиваний с них, и, по влиянию на эти показатели, его действие сопоставимо с действием диазепама и афобазола, однако при этом время проведенное в открытых рукавах увеличивалось незначительно, что можно объяснить более высокой локомоторной активностью у животных, получавших данное средство, его активирующим действием. Латентный период выхода животных из центра, характеризующий скорость ориентировочных реакций, статистически значимо уменьшался под действием средства и, в меньшей степени, афобазола и коаксила. Двигательная активность у животных (суммарное, количество переходов между рукавами лабиринта) достоверно увеличивалась под действием как исследуемого средства, так и глутафена, афобазола и мелипрамина, что характеризует их активирующий эффект и статистически значимо уменьшалась под действием диазепама, что обусловлено его седативным действием. Таким образом, по воздействию средства на поведение животных в тесте ПКЛ можно сделать вывод о наличии анксиолитических свойств, сочетающихся с активирующим действием. В тесте КС (по Вогелю) анксиолитические свойства средства также подтвердились. У животных получавших средство отмечается статистически, значимо меньший латентный период первого наказуемого взятия воды из поилки и большее количество наказуемых попыток утолить жажду. При этом изучаемое средство проявляло анксиолитический эффект, сопоставимый с эффектом диазепама и статистически значимо превосходящий эффекты афобазола.

Заключение. Гидрохлорид 3-фенилглутаминовой кислоты проявляет анксиолитическое действие как при курсовом, так и при однократном применении, наиболее выраженное в дозе 26 мг/кг, а также умеренные активирующие свойства, сопоставимые с аналогичным эффектом мелипрамина (15 мг/кг). Анксиолитическая активность предлагаемого средства превышает активность коаксила (12 мг/кг) и афобазола (5 мг/кг) и сопоставима с действием диазепама (1 мг/кг).

Нейропротекторное действие

Нейропротекторное действие средства исследовалось в условиях нарушения функциональной активности ЦНС стрессорного и судорожного генеза. Острый эмоционально-болевой стресс моделировали путем подвешивания животных за дорсальную шейную кожную складку на высоте 1,5 м от пола на 24 часа (продолжительность подвешивания выбрана на основе литературных данных, указывающих на то, что за этот временной интервал достигается развернутая картина общего дезадаптационного процесса [Островский О.В., Дудченко Г.П., 1985]). Для предотвращения травмирования животных на бранши зажимов надевались резиновые наконечники. В качестве препаратов сравнения использовали нейропротекторы фенибут (50 мг/кг) и фенотропил (50 мг/кг), оказывающие выраженное стресспротекторное действие [Адаптогеннное действие ноотропных лекарственных средств при экспериментальном стрессе у животных. Ахапкина В.И. // ж.: Фарматека, №14, 2005. http://medi.ru/doc/310110.htm]. Формировались группы животных: контрольные - контроль 1 (интактные животные, не подвергавшиеся стрессированию в ходе экспериментов) и контроль 2 (контрольные животные, подвергавшиеся стрессу); подопытные получавшие исследуемое средство и препараты сравнения, подвергавшиеся действию стресса, (гидрохлорид 3-ФГК + стресс), (фенибут + стресс), (фенотропил + стресс). Изучаемое средство, препараты сравнения и 2%-ный раствор крахмальной слизи контрольным животным вводились однократно перорально профилактически за 45 мин до стрессирования. Изучаемое средство, препараты сравнения и физиологический раствор контрольным животным вводились однократно перорально профилактически за 45 мин до стрессирования. Моделирование хронического стресса путем депривации парадоксальной фазы сна [Воронина Т.А. и др., 2005; Ковальзон В.М., 2006; Jouvet et al, 1964] проводилось в ванной, заполненной водой, на поверхности которой находились площадки размером 6,0×6,0 см, выступающие над уровнем воды на 2 см. Животные помещались на площадки на 24 часа с предварительным введением исследуемых веществ. Спустя указанный интервал времени животных возвращали в индивидуальные клетки на 24 часа со свободным доступом к воде и корму, цикл повторяли 5 раз, общая продолжительность стрессирования 10 суток. Препараты сравнения, их дозы и путь введения были аналогичны использованным при моделировании острого стресса. Средство, препараты сравнения, раствор 2%-ной крахмальной слизи контрольным животным вводились профилактически за 45 мин перед каждым помещением на островки. Функциональная оценка влияния на выраженность психоневрологических стрессобусловленных нарушений у животных проводилась в стандартных психофармакологических тестах ОП, ПКЛ, УРПИ, ТЭИ, позволяющих оценить состояние спонтанной двигательной, ориентировочно-исследовательской активности, уровня эмоционального реагирования, а также когнитивных функции. Тесты ОП и ПКЛ выполнялись в интервале 60-120 мин после стрессирования животных. Тест УРПИ выполнялся в два этапа. Первое тестирование проводилось для выработки навыка пассивного избегания и формирования групп животных со сходными показателями латентного периода первого захода в темный отсек и количества заходов, то есть сходными параметрами обучаемости. Воспроизведение в тесте УРПИ осуществлялось в течение 60-120 мин после стресса для изучения сохранности функции памяти. Для подтверждения наличия антиамнестической активности исследуемых веществ был использован тест ТЭИ (обучение решению экстраполяционной задачи перед стрессированием и воспроизведение навыка в интервале 60-120 мин после окончания стрессирования). Поскольку при стрессе происходит активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), что приводит к повреждению клеточных мембран и снижению их устойчивости к повреждающим агентам [Куклей М.Л. и др., 1994; Перцов С.С., 2004], производился анализ влияния на резистентность эритроцитов методом кислотного гемолиза [Терсков И.А. и др., 1957]. Для измерения оптической плотности взвеси эритроцитов использовали фотоколориметр КФК-2 (светофильтр красный). Морфологическая оценка влияния гидрохлорида 3-ФГК и препаратов сравнения на морфосоматические проявления стресса, выполнялась путем определения выраженности «стрессорной триады» (гипертрофия надпочечников, инволюция лимфоидных органов, изъязвление слизистой желудка). Крысы подвергались эвтаназии введением тиопентала натрия в дозе 80 мг/кг, затем вскрывались, после чего извлекались надпочечники, тимус, селезенка и желудок. На торсионных весах проводилось взвешивание надпочечников, тимуса и селезенки с определением относительной массы в мг/100 г веса животного. Желудок вскрывался по большой кривизне и промывался, подсчитывалось число эрозий и язв на слизистой оболочке и определялась степень ее поражения (по шкале Перцова С.С, 1995).

Пример 3. Изучение нейропротекторного действия на модели острого стресса. Результаты представлены в табл. 6-9. Острый эмоционально-болевой стресс вызвал у крыс группы контроль 2 (стрессированных), по сравнению с животными группы контроль 1 (не стрессированных), выраженную дезорганизацию спонтанного индивидуального поведения: в тесте ОП растормаживание двигательной и ориентировочно-исследовательской активности, последний показатель повышался, главным образом, за счет увеличения количества стоек, что характеризует повышение уровня тревожности (Вальдман А.В., 1987). В тесте ПКЛ также отмечалось увеличение локомоторной активности у стрессированных крыс группы контроль 2, длительности латентного периода выхода из центра (животные больше времени затрачивали на принятие решения), что говорит о снижении скорости ориентировочных реакций (ухудшении когнитивной функции), предпочтение темных рукавов светлым (проявление тревожно-фобического состояния). Под действием стресса в группе контроль 2 отмечалось снижение устойчивости эритроцитов к кислотному гемолизу. В тестах УРПИ и ТЭИ отмечалось депримирующее влияние острого стресса на когнитивную и мнестическую функции, что проявлялось в уменьшении латентного периода первого захода в темный отсек и увеличении количества заходов в него в тесте УРПИ, увеличении латентного периода подныривания, в тесте ТЭИ на этапе постстрессорного воспроизведения рефлексов избегания у крыс группы контроль 2 по сравнению с группой контроль 1. Кроме того, у животных группы контроль 2 (стрессированные животные) была выявлена характерная стрессорная триада Селье: гипертрофия надпочечников, инволюция тимуса и селезенки, эрозивно-язвенное поражение слизистой оболочки желудка). Перечисленные изменения психоневрологического и морфосоматического статуса, а также стабильности мембран эритроцитов были статистически значимыми при сравнении групп контроль 2 и контроль 1. В тесте ПКЛ испытываемое средство (26 мг/кг), сопоставимое с фенибутом и фенотропилом по увеличению времени нахождения животных в открытых рукавах лабиринта по сравнению с группой контроль (в стрессе), способствовало снижению выраженности тревоги и страха, вызванных эмоционально-болевым стрессом. Помимо того, средство в равной степени с фенотропилом, статистически значимо снижало длительность латентного периода выхода из центра в тесте ПКЛ, т.е. увеличивало скорость ориентировочных реакций у животных по сравнению со стрессированным контролем, и превосходило фенибут по влиянию на данный показатель. Восстановление скорости ориентировочных реакций (одной из составляющих когнитивной функции) под действием средства, фенибута и фенотропила говорит об улучшении когнитивной функции у животных в постстрессорном периоде, являясь компонентом ноотропного и нейропротекторного действия указанных веществ. В тесте УРПИ средство, как и фенибут (50 мг/кг) и фенотропил (50 мг/кг), статистически значимо снижали число животных в группе, зашедших в темный отсек и увеличивали латентный период первого захода в него, то есть подавляли амнезирующий эффект острого стресса и способствовали улучшению когнитивных функций: проявляя ноотропные и нейропротекторные свойства. В тесте ТЭИ-средство сопоставимо с фенибутом и, как в тесте УРПИ, способствовало сохранению памяти у животных, подвергшихся острому стрессу, то есть проявляло ноотропные и нейропротекторные свойства. При изучении влияния на морфосоматический статус исследуемое средство достоверно увеличивало, массу лимфоидных органов (тимуса и селезенки) по сравнению с группой контроль (в стрессе), тем самым косвенно повышая имунную защиту организма, снижение которой провоцируется стрессом. При моделировании кислотного гемолиза эритроцитов у стрессированных животных, получавших средство, а также фенибут и фенотропил, по сравнению с показателем группы контроль (в стрессе), отмечалось значительно большее время до полного разрушения эритроцитов и более низкая интенсивность гемолиза, что указывает на меньшее повреждение их клеточных мембран в условиях стрессобусловленной интенсификации ПОЛ. Указанный эффект средства сопоставим по выраженности с эффектом фенибута и фенотропила, указывая на наличие антиоксидантных свойств.

Пример 4. Изучение нейропротекторного действия на модели хронического стресса. Результаты представлены в табл.10-13. Хронический стресс, вызвал у группы контроль 2 психоневрологические, а также морфосоматические нарушения, аналогичные наблюдавшимся при остром стрессе, однако более выраженные. Испытываемое средство незначительно увеличивало длительность нахождения животных в открытых рукавах и незначительно уменьшало латентный период выхода из центра лабиринта, по сравнению с группой контроль 2, тогда как после моделирования острого стресса под действием средства отмечалось более выраженное улучшение данных показателей. Такого рода различия во влиянии вещества на указанный показатель при моделировании острого и хронического стресса говорит в пользу более сильного повреждающего действия последнего (для выбранных моделей). В тесте УРПИ у хронически стрессированных крыс, получавших средство, а также препараты сравнения, отмечалось уменьшение выраженности постстрессорного нарушения когнитивных функций: увеличение латентного периода первого захода в темный отсек и уменьшение числа животных в группе, посетивших его. Изучаемое средство по выраженности ноотропного эффекта в тесте УРПИ при хроническом стрессе, не уступало препарату сравнения фенибуту, но было менее активным, чем фенотропил. В тесте ТЭИ при воспроизведении навыка, после хронического стресса у животных, получавших средство и препараты позитивного контроля отмечалось снижение времени, затрачиваемого на решение, экстраполяционной задачи по сравнению со стрессированным контролем 2. Таким образом, из результатов тестов УРПИ и ТЭИ, следует вывод, что средство (26 мг/кг) способствует сохранению памяти у животных, подвергшихся хроническому стрессу, то есть проявляет ноотропные и нейропротекторные свойства. Протективное влияние средства на когнитивную функцию животных, подвергавшихся хроническому стрессу, не уступало по выраженности фенибуту (50 мг/кг), а по некоторым показателям и фенотропилу (50 мг/кг). Помимо указанного, после хронического стресса у животных группы контроль (в стрессе) отмечалось статистически значимое уменьшение массы тела. Средство, как и фенибут и фенотропил, препятствовало обусловленному стрессом падению массы тела животных, по сравнению с группой контроль 2, однако в меньшей степени, чем при остром стрессе. Средство также препятствовало стрессобусловленной интенсификации кислотного гемолиза эритроцитов: сопоставимо с фенибутом и фенотропилом уменьшало интенсивность и увеличивало продолжительность разрушения эритроцитов.

Пример 5. Изучение нейропротекторного действия в условиях нарушения функциональной активности ЦНС, вызванного судорожным синдромом. Нарушение функций центральной нервной системы у животных вызывали моделированием генерализованного судорожного приступа путем введения пикротоксина подкожно в область шейного отдела спины в дозе 2,5 мг/кг [Воронина Т.А., Неробкова Т.Н., 2000]. Формировались группы животных: контрольные - контроль 3 (интактные животные, не подвергавшиеся моделированию судорог в ходе экспериментов) и контроль 4 (контрольные животные, у которых вызывали