Питательная среда для культивирования дрожжей

Питательная среда для культивирования дрожжей

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области микробиологической диагностики, а в частности к культивированию и идентификации клинически релевантных дрожжей, а более конкретно, дрожжей различных видов, принадлежащих к роду Candida.

Предшествующий уровень техники

В патенте США № 4144133 описано использование желчи быка, очищенного сапонина и субстрата для детектирования фермента фенолоксидазы, которые облегчают идентификацию патогенных грибов, а в частности Candida albicans и Cryptococcus neoformans. Однако этот метод не позволяет культивировать, идентифицировать и дифференцировать все клинически или экологически релевантные виды Candida.

В патенте Японии JP2003310298, Komatsu Osamu, описан метод дифференциации Candida albicans и Candida tropicalis от других грибов с использованием субстрата X-glc (Х-галактозидазы). Специфичность этого субстрата не дает гарантии надежной дифференциации всех клинически или экологически релевантных видов Candida.

В патенте 4030980, Beckford, O. A. и сотрудниками был описан аппарат для выделения и идентификации дрожжей клинического происхождения с использованием нескольких биохимических тестов и культуральных сред для идентификации видов Candida среди других микроорганизмов. Этот аппарат и способ его применения имеют следующие основные недостатки, а именно сложность изготовления такого устройства, сложность посева этих микроорганизмов на каждую чашку и необходимость выделения колоний, а также другие недостатки. Наиболее серьезным недостатком является то, что чашки для биохимических тестов не содержат достаточного количества соответствующих питательных веществ для роста микроорганизмов Candida, тогда как идентификацию осуществляют путем наблюдения множества биохимических реакций, а поэтому атипическая реакция в одной из таких чашек может приводить к ошибочной идентификации.

В патенте Великобритании GB 730763 описана культуральная среда для выделения и идентификации микроорганизмов рода Candida, рецептура которой включает неорганическую соль висмута и сульфит натрия в комбинации с отверждающим агентом. Эта среда включает растворимый углевод, пируват натрия, глицин, органический фосфат и дрожжевой экстракт. Такая культуральная среда имеет ряд технологических недостатков, а именно:

- она не обеспечивает снабжение микроорганизмов всеми питательными веществами, необходимыми для обильного и быстрого роста всех релевантных видов Candida, поскольку она содержит всего лишь один источник витаминов, а в частности дрожжевой экстракт, в котором содержание минералов, а в частности магния, является недостаточным для эффективной активации сложной ферментной системы этих микроорганизмов;

- кроме того, эта среда содержит лишь один источник энергии, а именно пируват натрия, который является недостаточным для обеспечения равномерного, быстрого и обильного роста различных микроорганизмов Candida;

- эта среда не позволяет дифференцировать различные виды микроорганизмов Candida друг от друга;

- присутствие одного лишь глицина не позволяет обеспечить доставку достаточного количества азота, необходимого для синтеза аминокислот, белков и ферментов, требуемых для быстрого и обильного роста микроорганизмов вида Candida.

Jesús Ruiz-Aragón и сотрудниками (Assessment of a new CHROMOagar Candida medium for presumptive identification of yeasts; Revista de Diagnystico Biolуgico. V.52(1), 2003) было проведено сравнение новой среды CHROM M со средами CHROM OR и CHROM R (Beckton Dickinson). В таблице 1 указанной публикации показано, что среда CHROM OR не позволяет дифференцировать релевантные виды Candida друг от друга. В случае среды CHROM R не все релевантные виды могут быть в достаточной степени дифференцированы, а в среде CHROM M микроорганизмы нескольких видов обнаруживали одинаковую или похожую окраску. Авторы данной публикации указывают, что результаты могут быть более надежными только после 48-часового инкубирования. Кроме того, они пришли к выводу, что среда CHROM M не является достаточно эффективной для идентификации дрожжей различных видов, поскольку она является менее чувствительной, требует большего времени инкубирования для образования колоний и не позволяет осуществлять дифференциацию некоторых клинически релевантных видов, таких как Candida tropicalis и Candida parapsilosis.

В патенте Соединенных Штатов № 5449612 описан метод идентификации штаммов Candida albicans и Torupsis glabrata с использованием хромогенных субстратов, состоящих из моноаминокислот или пептидов, без выделения идентифицируемого штамма. В состав такой среды входит циклогексимид, ингибирующий рост некоторых видов Candida, кроме Candida albicans, то есть компонент, который ограничивает диагностические возможности этого варианта среды. Добавление антибактериальных веществ, таких как гентамицин, снижает стабильность среды после ее приготовления, а поэтому такая среда не может храниться в течение длительного периода времени. Кроме того, развитию хромогенных реакций также препятствует хлорамфеникол.

Кроме того, питательная основа, используемая в настоящем изобретении в качестве источников азота (азотистые основания дрожжей, неопептон, протеозо-пептон, бакто-пептон и дрожжевой экстракт), взятые отдельно или в комбинации друг с другом, не могут обеспечивать поступления достаточного количества витаминов и минералов, макро- и микроэлементов, необходимых для начального роста Candida.

В патенте Соединенных Штатов № 5534415 описана селективная дифференциальная культуральная среда для роста и детектирования Candida albicans. Главным элементом культуральной среды является питательная основа, подвергающаяся метаболизму дрожжами, то есть хромогенный или флуорогенный субстрат, который может гидролизоваться ферментом гексозаминидазой, присутствующей в Candida albicans, и, по меньшей мере, одно соединение, содержащее гексозаминидазу, которое активирует этот фермент. Компонентами, действующими как источник азота для данной среды, являются пептоны, содержащиеся в количестве от 0,01 до 40 г/л, такие как, например, мясной пептон, соевый пептон и пептонные смеси, а также дрожжевой экстракт, содержащийся в количестве от 0,01 до 40 г/л. Эти азотные соединения, сами по себе, не обеспечивают поступление всех питательных элементов и витаминов, необходимых для обильного начального роста микроорганизмов Candida; и, кроме того, они не гарантируют развитие явно выраженных хромогенных реакций с интенсивным окрашиванием в первые часы роста микроорганизмов Candida.

Включение в препарат источников углерода в концентрациях, указанных авторами, например, таких как глюкоза, ацетат, лактат, аминобутират и т.п. или их смесей, может быть осуществлено только в комбинации с хромогенным субстратом конкретного типа, поскольку он должен конкурировать с ферментативной активностью Candida и в свою очередь должен ограничивать возможность включения других хромогенных или флуорогенных субстратов, используемых для идентификации или дифференциации других видов Candida. Таким источником углерода является глюкоза, которая должна подавлять или ослаблять глюкозидазную активность. В состав данной среды входят такие буферы, как фосфаты, трис, HEPES и цитраты в количестве, достаточном для доведения рН до значения, близкого к 7, что благоприятствует идентификации только микроорганизмов вида Candida albicans, но не других видов Candida, представляющих интерес с точки зрения санитарии и экологии.

В среду могут быть добавлены и другие активаторы, такие как соли магния, марганца и/или кальция в количествах, варьирующихся в пределах от 0 до 10 ммоль/л.

В состав среды входят усилители клеточной проницаемости, такие как соли желчных кислот, дезоксихолат натрия, полиоксиэтиленгликоль, эфиры алкилфенола, сложные эфиры сорбитана или жирных кислот в концентрации, составляющей от 0 до 5 г/л. Некоторые из этих веществ, например соли желчных кислот, в высокой степени ингибируют рост микроорганизмов вида Candida, даже Candida albicans.

В данную среду были также добавлены ингибиторы грамположительных и грамотрицательных бактерий, такие как гентамицин, пенициллин и т.п. Большинство из этих веществ не обладают термостабильностью и должны быть быстро приготовлены и использованы. Кроме того, приготовленные среды, готовые для использования в чашках Петри, должны храниться в холодильнике, но не слишком долго, например в течение 2-30 дней.

В соответствии с представленным описанием можно использовать теллурит, молибдат или их смеси, которые также в высокой степени ингибируют рост микроорганизмов Candida.

Тем не менее, следует отметить, что другими явными недостатками различных сред, описанных в вышеупомянутом изобретении, являются те, что даже после 24-часового инкубирования не все колонии Candida albicans обнаруживают яркую окраску. Для развития интенсивной окраски большинству колоний Candida albicans требуется более 48 часов, а другие виды Candida вообще не дают окраску (таблицы II и III оригинала).

Некоторые авторы сообщали об использовании растительных экстрактов в различных целях для повышения роста или улучшения дифференциации микроорганизмов вида Candida.

Zia U. Khan и сотрудниками (Tobacco Agar, a New Medium for Differentiating Candida dubliniensis from Candida albicans, J. Clin. Microb., v. 42(10):4796-4798, 2004) был использован агар из семян подсолнечника для культивирования Candida dubliniensis. Этими авторами также было описано использование в культуральной среде экстракта из листьев табака и никотина. Но ни один из используемых экстрактов не может обеспечить поступления достаточного количества соответствующих витаминов и сахаров для роста релевантных микроорганизмов вида Candida.

Ни одна из вышеуказанных сред не позволят осуществлять соответствующую дифференциацию всех видов. И наконец, такие дифференциация и идентификация основаны не только на различии в окраске, но также и на морфолигических свойствах этих колоний, а именно на образовании хламидоспор, а поэтому средний специалист в данной области нуждается в интерпретации полученных результатов.

Dostál и сотрудниками, 2003, было описано использование культуральной среды, содержащей коровий гемоглобин, дрожжевой экстракт и бромфеноловый синий для детектирования протеолитической активности Candida. (Dostál J., Hamal P., Pavlicková L., Soucek M., Ruml T., Pichova I., Huskova-H O. Simple Method for Screening Candida Species Isolates for the Presence of Secreted Proteinases: A Tool for the Prediction of Successful Inhibitory Treatment. J. Clin. Microbiol. 2003, Feb., 41 (2):712-716.) Основным недостатком такой среды является то, что гемоглобин позволяет обнаруживать только аспарто-протеазную активность, наблюдающуюся у всех видов, а поэтому он не может быть использован для дифференциации микроорганизмов друг от друга. Кроме того, гемоглобин нуждается в фильтрации, и добавлять его следует в асептических условиях, что затрудняет проведение данной процедуры. К другим недостатками можно отнести необходимость растворения индикатора в этаноле; крайне низкий pH среды (4-4,5), который не является оптимальным для стимуляции роста дрожжей; необходимость инкубирования при температуре 30°С (также не являющейся оптимальной) и продолжительность детектирования протеолитической активности, которая может занимать от 5 до 7 дней.

Bramono K. и сотрудниками, 2006, были проведены исследования различных ферментативных активностей микроорганизмов Candida, а в частности протеиназной, липазной и α-глюкозидазной активности в минимальных средах, дефицитных по питательным элементам. (Bramono K., Yamazaki M., Tsuboi R. and Ogawa H. Comparison of Proteinase, Lipase and α-Glucosidase Activities from the Clinical Isolates of Candida Species. Jpn. J. Infect. Dis., v. 59, 73-76, 2006.) Этими авторами была обнаружена значительная внеклеточная протеиназная активность в Candida albicans, Candida parapsilosis и Candida tropicalis. Однако такая активность была связана с гидролизом белка бычьей сыворотки (альбумина), который является источником азота, необходимого для роста микроорганизмов, и не играет какой-либо роли как средство для идентификации и дифференциации, поскольку эта активность также присутствует и у других видов, хотя и в меньшей степени. Добавление альбумина в качестве маркера протеолитической активности приводит к снижению стабильности среды. Липолитическая активность была индуцирована с использованием Tween 80, который является единственным источником углерода, используемым в этой среде. Такая активность была значительно выше у Candida tropicalis, Candida albicans и Candida parapsilosis.

α-Глюкозидазная активность была протестирована путем добавления 0,6% мальтозы в минимальную среду и использования п-нитрофенил-α-D-глюкопиранозида. Оптическую плотность считывали на спекрофотометре. Полученные результаты подтвердили, что Candida tropicalis, Candida albicans и Candida parapsilosis обладают наивысшей ферментативной активностью в жидкой минимальной среде. Такую реакцию невозможно обнаружить невооруженным глазом, и для считывания и интерпретации результатов необходимо использовать лабораторное оборудование.

Целью вышеупомянутой работы было проведение базовых исследований ферментативной активности Candida в условиях низкого содержания питательных элементов, но при этом не преследовалось каких-либо целей идентификации или дифференциации видов микроорганизмов.

Asmaa Al Mosaid и сотрудниками (Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Staib Agar and Caffeic Citrate Agar, J. Clin. Microb., v. 39(1), 323-327, 2001) была описана идентификация патогенных Candida dubliniensis в двух культуральных средах. В одной из этих сред использовали водный экстракт семян Guizotia abyssinica с добавлением глюкозы и креатинина. В другой среде использовали дрожжевой экстракт, глюкозу, сульфат аммония, цитрат железа(III) и кофеиновую кислоту. Ни одна из вышеупомянутых сред не может обеспечивать начальный рост Candida, что обусловлено, главным образом, тем фактом, что эти среды не содержат достаточного количества витаминов, азотсодержащих веществ и углеводов, необходимых для стимуляции быстрого и обильного роста микроорганизмов всех видов Candida.

Тот же автор, в своей работе “Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Pal's Agar” (J. Clin. Microb., v. 41(10): 4787-4789, 2003) проводил сравнение среды, в которой использовался агар Пэлса (Pal's), полученный из обессоленного экстракта семян подсолнечника, с агаром Стайба (Staib). В обоих случаях идентификация и дифференциация Candida были достигнуты после инкубирования в течение 48-72 часов. Эта работа позволяет сделать выводы, аналогичные выводам, сделанным ранее в отношении недостатков сравниваемых сред.

Venitia M. C. и сотрудниками (New Chromogenic Agar Medium for the Identification of Candida spp. J. of Virology, v.68(7): 3622-3627, 2002) была описана новая культуральная среда для идентификации видов Candida с использованием декстрозного агара Сабуро, в который был добавлен хромогенный субстрат для детектирования глюкозаминидазной активности Candida albicans и Candida dubliniensis. Эту среду сравнивали со средой, содержащей агар «Agar Candida ID» (BioMérieux) и агар «CHROMagar Candida» (CHROMOagar Company Ltd.). Результаты такого сравнения показали, что агар «Candida ID Agar» не позволяет дифференцировать штаммы Candida tropicalis от штаммов Candida kefyr. Этот агар также не позволяет дифферецировать Candida guilliermondii от первых двух видов. Хромогенная агаровая среда позволяла идентифицировать только Candida albicans.

Эта новая среда является дефицитной по витаминам и микроэлементам, необходимым для обильного роста микроорганизмов видов Candida. Глюкоза является единственным источником углеводов и энергии в данной среде; а грибной пептон, сам по себе, не обеспечивает поступление других питательных элементов, необходимых для культивирования большинства видов.

Аналогичным образом, культуральная среда CLED, питательный агар, агар LAB Lemco, агар для подсчета колоний в стандартных чашках и дрожжевой экстракт с агаром не дают удовлетворительных результатов по причинам, указанным выше.

Основным недостатком всех культуральных сред, исследуемых в вышеупомянутой работе, включая новую среду, является низкая стабильность их готовых форм в чашках Петри, которая сохраняется только в течение максимум 6 недель, что обусловлено, главным образом, лабильной природой некоторых используемых субстратов и реагентов. В этой связи, наибольший интерес представляет агар Candida ID Agar, который необходимо инкубировать в темноте в соответствии с инструкциями производителя.

И наконец, следует отметить, что все агары, а именно CDA Agar, Candida ID Agar и Candida CHROMOagar, не позволяют эффективно дифференцировать штаммы и/или виды Candida друг от друга. В частности, виды Candida albicans варьируются по своей окраске, от зеленого до пурпурно-синего и бирюзово-синего, что вызывает затруднения в идентификации Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaneae, Candida parapsilosis, Candida pelliculosa, Candida rugosa и Candida tropicalis. В агаровой среде Candida ID Agar, некоторые виды Candida трудно отличить от других видов дрожжей из-за их окраски.

Введение нового хромогенного субстрата в агар из кукурузной муки, в картофельный агар с декстрозой и в рисовый агар не облегчало идентификацию или дифференциацию видов Candida. Это позволяет сделать вывод, что ни один из источников растительного происхождения, традиционно используемых в этих средах, не стимулирует вступление метаболитов в различные метаболические циклы тестируемых видов Candida и что ни одна из хромогенных или флуорогенных реакций, используемых в настоящее время в комбинации с такими питательными элементами, не облегчает выделение, дифференциацию или идентификацию микроорганизмов любых клинически и экологически релевантных видов Candida.

Описание сущности изобретения

Объектом настоящего изобретения является композиция культуральной среды, подходящая для селективного выделения, дифференциации и одновременной идентификации грибов различных видов, а в частности рода Candida.

Новизна настоящего изобретения состоит в том, что состав (композиция) питательной среды включает смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта в количестве, составляющем от 20 до 30 г/л. Указанная смесь на 50-67% состоит из экстракта сладкого картофеля и на 33-50% - из дрожжевого экстракта или на 33-50% из томатного экстракта.

В настоящее время отсутствуют какие-либо сообщения об использовании экстракта сладкого картофеля в культурах микроорганизмов видов Candida, который, как было неожиданно обнаружено, дает благоприятный эффект при его включении в культуральную среду в качестве питательной основы.

В другом своем новом аспекте настоящее изобретение включает: объединение смеси экстракта сладкого картофеля и дрожжевого или томатного экстракта с другими источниками азота, а предпочтительно, с глицином в количестве 0 до 3 г/л, с бактериальным пептоном в количестве от 0 до 5 г/л и с продуктом ферментативного гидролиза казеина в количестве от 0 до 5 г/л, где общее количество этих источников азота в питательной среде составляет в пределах от 0 до 13 г/л; и получение новой комбинации источников азота, ранее не описанной в научной литературе.

Комбинация вышеуказанных питательных элементов с ингибиторами грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, присутствующими в питательной среде, отличается от всех других комбинаций, описанных в литературе, относящейся к культивированию микроорганизмов Candida. Указанные ингибиторы, описанные в прототипе и являющиеся составной частью объекта настоящего изобретения, представлены в количествах от 0 до 10 г/л и, предпочтительно, выбраны из налидиксовой кислоты, взятой количестве от 0 до 0,05 г/л, экстракта чайной розы в количестве от 0 до 0,05 г/л, дезоксихолата натрия в количестве от 0 до 0,5 г/л, сульфита натрия в количестве от 0 до 3 г/л, цитрата аммоний-висмута в количестве от 0 до 5 г/л и хлорида тетрафенилтетразолия в количестве от 0 до 0,05 г/л.

Эта комбинация также является новой, так как стимуляторы микробного роста, выделенные из сладкого картофеля, никогда ранее не использовались в комбинации с вышеупомянутыми ингибиторами, и такое ингибирование ранее не могло быть достигнуто без использования лабильных веществ, затрудняющих рост Candida.

В этой композиции, впервые в культуральную среду, в которой присутствуют микроорганизмы Candida, добавляют налидиксовую кислоту в количестве от 0 до 0,05 г/л в целях ингибирования роста грамотрицательных бактерий. Ранее это не могло быть осуществлено из-за того, что указанный антибиотик оказывает ингибирующее действие на грибы этого вида. Однако такое добавление стало возможным благодаря его использованию в комбинации с магниевой солью (сульфатом магния), которая, как было неожиданно обнаружено, подавляет ингибирующее действие налидиксовой кислоты на Candida.

Другим новым аспектом настоящего изобретения является комбинация веществ, позволяющая осуществлять идентификацию различных видов Candida по изменению их окраски и/или интенсивности флуоресцении, появлению зон и морфологии колоний, а также по изменению свойств среды, содержащей питательные элементы, поступающие из экстракта сладкого картофеля.

Эти вещества, объединяемые со смесью экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта, выбирают из хромогенных и флуорогенных субстратов, используемых для детектирования ферментативной активности.

Впервые была получена комбинация, состоящая из группы хромогенных и/или флуорогенных субстратов и маркеров протеолитической активности, предназначенных для детектирования ферментативной активности микроорганизмов рода Candida, проводимого одновременно с селективным выделением этих микроорганизмов из клинических образцов или образцов окружающей среды, в присутствии активаторов этих реакций, об использовании которых в этих целях ранее не сообщалось, например, таких как трегалоза или мальтоза в количествах от 0 до 10 г/л.

Впервые детектирование α-глюкозидазной активности в данной композиции агаровой культуральной среды осуществляли по хромогенным или флуорогенным реакциям в целях дифференциации или идентификации видов Candida, а в частности Candida albicans, Candida tropicalis и Candida parapsilosis. Для этой цели был введен метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозид в количестве до 0,1 г/л.

Аналогичным образом, в предшествующих работах не сообщалось о включении в среду для культивирования дрожжей, а в частности дрожжей рода Candida, хромогенных и/или флуорогенных субстратов, используемых в целях идентификации фосфолипазной активности таких видов, как Candida albicans, Candida tropicalis и Candida parapsilosis. В случае настоящего изобретения аммониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата была включена в количествах, составляющих до 0,1 г/л.

Впервые в результате такого объединения группы субстратов была достигнута неожиданно высокая эффективность дифференциации всех клинически релевантных видов Candida. В частности, Candida albicans идентифицировали по его активностям, а именно по фосфолипазной активности (определенной с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата), α-глюкозидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида), гексозаминидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактопиранозида и 5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида) и L-пролин-аминопептидазной активности (определенной с использованием гидробромида L-пролин-7-амидо-4-метил-кумарина и пара-нитроанилина L-пролина); Candida tropicalis идентифицировали по его фосфолипазной активности (определенной с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата) и α- и β-глюкозидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида, 5-бром-4-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида и 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида); Candida kefyr идентифицировали по его β-глюкозидазной активности (определенной с использованием 5-бром-4-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида и 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида), а также по его протеолитической активности; Candida parapsilosis идентифицировали по его фосфолипазной активности (определенной с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата), α-глюкозидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида) и L-пролин-аминопептидазной активности (определенной с использованием гидробромида L-пролин-7-амидо-4-метил-кумарина и L-пролин-паранитроанилина); Candida krusei и Candida glabrata идентифицировали по их белой окраске (мутной и блестящей соответственно), появляющейся в результате отсутствия в микроорганизмах этих двух видов ферментативной активности.

Другим новым элементом настоящего изобретения является включение маркера протеолитической активности, которая наблюдается только в Candida kefyr. В этом случае неожиданно было обнаружено, что казеин сухого сепарированного молока в количестве до 10 г/л гидролизуется только этим микроорганизмом, но не микроорганизмами других видов.

Неожиданно было обнаружено, что включение в данную композицию мальтозы или трегалозы в присутствии других источников углерода приводит к заметному увеличению интенсивности хромогенной реакции (появлению окраски) колоний. Этот эффект противоречит общепринятой практике промышленного продуцирования колоний, обычно осуществляемого с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов в среде, в которую, по существу, не добавляют сахара или других источников углерода, аналогичных, по своей природе, субстратам, во избежание резкого снижения рН, а значит, и снижения интенсивности хромогенной реакции, или во избежание снижения интенсивности окраски колоний, вызываемого другими конкурирующими механизмами, посредством которых эти микроорганизмы потребляют сахар в наиболее доступной форме, а поэтому в меньшей степени подвергают метаболизму хромогенный субстрат.

Аналогичным образом, уникальной является комбинация группы хромогенных и/или флуорогенных субстратов с другими индикаторами или красителями, источниками углерода и органическими и неорганическими солями, присутствующими в питательной среде в количестве от 0 до 26 г/л, такими как глицерин в количестве от 0 до 25 мл/л, бромкрезоловый пурпурный в количестве от 0 до 0,04 г/л, бромтимоловый синий в количестве от 0 до 0,08 г/л и сульфат магния в количестве от 0 до 0,5 г/л.

Комбинация pH-регулирующих веществ в количестве от 0 до 5 г/л, при котором некоторые из них действуют как активаторы ферментов, например, такие как фосфаты, а предпочтительно, монофосфат калия (от 0 до 1 г/л) и дифосфат калия (от 0 до 4 г/л), при рН среды, регулируемым путем добавления буферов, предпочтительно, 3-морфолинопропансульфоновой кислоты (3-морфолин-пропансульфоновой кислоты), также известной, как MOPS (от 0 до 0,5 г/л), становится уникальной в результате комбинированного действия этих компонентов вместе с микро- и макроэлементами, присутствующими в экстракте сладкого картофеля, которые, как было неожиданно обнаружено, функционируют как буферы и поддерживают рН в пределах, благоприятных для всех видов Candida.

Таким образом, неожиданно было обнаружено, что при использовании композиции, описанной в настоящем изобретении, наблюдается усиление стимуляции роста всех видов Candida (в среднем на 113%), по сравнению с традиционными средами, даже если такие среды приготавливают без использования каких-либо ингибиторов, например декстрозный агар Сабуро, который представляет собой превосходную среду, обычно используемую для стимуляции роста грибов.

Такое открытие не является очевидным и не может быть сделано, исходя из предшествующих работ, в которых утверждается, что ингибиторы бактерий, вообще говоря, ингибируют до некоторой степени рост релевантных видов микробов. Таким образом, в общих чертах, при вычислении коэффициентов восстановления микроорганизмов на селективных средах и сравнении таких коэффициентов с коэффициентами, полученными на специальных средах в отсутствие ингибиторов, было обнаружено, что с использованием указанных селективных сред число колоний снижается и их морфология ухудшается.

Питательная среда также включает агар в количестве от 13 до 15 г/л, используемый для обеспечения развития морфологических свойств, которые являются типичными для колоний различных видов Candida, а также для наблюдения хромогенных или биохимических реакций в среде, таких как образование прозрачных зон.

Такая уникальная питательная среда также состоит из дистиллированной или деионизованной воды, в которой растворены другие твердые или жидкие компоненты в количествах от 35 до 50 г/л. pH корректируют до значений в предалах от 6,0 до 6,8.

Впервые с помощью такой питательной среды клинически или экологически релевантные виды Candida могут быть одновременно и селективно выделены, идентифицированы и дифференцированы за такое короткое время, как 24-48 часов.

При этом следует подчеркнуть, что питательная среда с добавлением указанных субстратов позволяет легко создать новую комбинацию морофлогических и биохимических средств для идентификации видов Candida.

Главным признаком новизны и главным преимуществом этой композиции для выделения и дифференциации видов грибов является то, что она позволяет одновременно выделять и идентифицировать значительно большее число видов Candida, чем это сообщалось в предшествующих работах, а в частности, впервые может быть идентифицировано 94% клинически релевантных видов Candida, а именно Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr и Candida parapsilosis, помимо Candida krusei.

Новая питательная среда имеет следующие преимущества:

- эта питательная среда обеспечивает обильный рост различных клинически или экологически релевантных видов Candida, поскольку она содержит питательные вещества широкого ряда, поступающие из экстракта сладкого картофеля и из объединенного с ним дрожжевого экстракта или томатного экстракта. Такой обильный рост может наблюдаться даже после инкубирования в течение лишь 24 часов, при этом для наблюдения характерных морфологических свойств этих колоний нет необходимости ждать более чем 48 или 76 часов;

- комбинация экстракта сладкого картофеля с дрожжевым экстрактом или с томатным экстрактом обеспечивает присутствие подходящих уровней макро- и микроэлементов, витаминов, а в частности, комплекса С и В, а также других водорастворимых экстрагируемых веществ, активирующих метаболические пути различных видов Candida и их специфической ферментативной активности, которая в свою очередь стимулирует стандартные хромогенные и флуорогенные реакции и реакции разложения субстрата в течение максимум 24-36 часов. Такая активация позволяет включать несколько биохимических маркеров в конечную композицию среды в целях осуществления одновременной идентификации различных видов Candida, проводимой в одну стадию;

- особым преимуществом настоящего изобретения является восстановление релевантных видов Candida, в среднем, более чем на 110%, по сравнению с культуральными средами, не содержащими ингибиторов и специально разработанными для культивирования грибов;

- эта питательная среда может быть легко приготовлена, не требует проведения сложных процедур добавления и применения специальной техники инокуляции;

- идентификацию различных видов и штаммов Candida осуществляют визуально с учетом различий в окраске колоний и культуральной среды, образования прозрачных зон вокруг этих колоний и, наконец, основных морфологический признаков колоний (края и поверхность). Для получения такой культуральной среды и интерпретации результатов не требуется специально обученного или квалифицированного персонала;

- поступление питательных веществ из смеси экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта приводит к образованию питательной среды, которая позволяет выделять, восстанавливать, дифференцировать и идентифицировать колонии Candida за одну стадию, не прибегая к применению методов и средств, обычно используемых для выделения колоний;

- аналитическая чувствительность и чистота культуральной среды обусловлены тем фактом, что осуществляемая на ней идентификация не зависит от группы биохимических индикаторов или маркеров, а зависит лишь от ферментативных реакций, которые являются типичными для различных видов, а также от очень хорошо определенных морфологических свойств, которые не допускают получения неоднозначных или вариабельных результатов при выявлении различных штаммов какого-либо определенного вида;

- с использованием хромогенных компонентов новой композиции и их комбинаций с сепарированным молоком были получены новые формы такой среды, позволяющие проводить дифференциацию или идентификацию релевантных видов Candida в присутствии более чем одного ферментного маркера, который в свою очередь значительно повышает чуствительность и точность диагностики по сравнению с ранее используемыми методами;

- комбинация экстракта сладкого картофеля с дрожжевым экстрактом или томатным экстрактом обеспечивает поступление в новую культуральную среду значительного количества витаминов, а в частности витаминов A, B1, B5, B6, B12 и C, доставляемых такими экстрактами, которые являются метаболитами, благоприятствующими обильному росту различных видов Candida;

- введение экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта, кроме того, обеспечивает присутствие различных углеводов, которые могут удовлетворять все потребности микроорганизмов различных видов. Поэтому для обеспечения необходимых условий культивирования микроорганизмов различных видов необязательно вводить другие углеводы. Это также облегчает идентификацию и дифференциацию различных видов микроорганизмов, исходя их способности разлагать субстраты, состоящие из углеводов или содержащие группы, имитирующие эти углеводы;

- в этой питательной среде, помимо других микроэлементов, поставляемых источниками, из которых приготовлена данная смесь экстрактов, а в частности сладкого картофеля, обеспечивается нужное содержание железа, кальция, фосфора, магния, калия и т.п. Поэтому, в данном случае, для выделения или идентификации видов Candida не требуется введения других солей, используемых в качестве питательных добавок. Кроме того, также не требуется введения питательных добавок, используемых для активации ферментативных реакций, позволяющих дифференцировать виды Candida с помощью биохимических и/или хромогенных и флуорогенных тестов. Добавление веществ этого типа в новую питательную среду требуется только в том случае, когда такие дополнительные добавки необходимы для продуцирования очень быстрых реакций от скудного посевного материала или при очень низких концентрациях дрожжей в образцах;

- интенсивность хромогенной и/или флуорогенной реакций для идентификации различных видов микроорганизмов в данной среде значительно выше, чем интенсивность таких реакций в других культуральных средах, описанных в предшествующих работах, что обусловлено эффектом усиления, достигаемого путем добавления в данную композицию трегалозы или мальтозы в ранее указанных количествах;

- комбинация смеси экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта вместе с другими источниками азота, такими как глицин, ферментативный гидролизат казеина или бактериальный пептон, обсуждаемые выше, обеспечивает доступность различных форм азота (в виде амина, аминокислоты, пептида, полипептида и белка), которые могут удовлетворять различным потребностям культивируемых микроорганизмов различных видов на ранних стадиях клеточного развития, а поэтому такие колонии могут достигать полного развития за меньший период времени. С другой стороны, такие вспомогательные добавки обеспечивают сохранение колоний в чашках Петри в течение еще более длительного периода времени;

- питательная среда не содержит веществ, которые, по своей природе, могут затруднять прохождение биохимических, хромогенных или флуорогенных реакций, а в данном случае такими веществами являются циклогексимид, хлорамфеникол, гентамицин или родамин, либо вещества, которые могут препятствовать прохождению каскада метаболических реакций при специфическом взаимодействии “фермент-субстрат”, либо вещества, которые окрашивают колонии, что затрудняет детектирование развития окраски или появления флуоресценции;

- композиция культуральной среды не включает термолабильные антибактериальные вещества, ингибирующие рост грамотрицательных или грамположительных микроорганизмов, либо дрожжей или плесени других типов, но может включать комбинации более стабильных веществ, таких как налидиксовая кислота, дезоксихолат натрия, сульфит натрия, цитрат аммония и/или экстракт чайной розы, которые, в конечном счете, повышают стабильность полученной питательной среды, готовой для ее использования в чашках Петри;

- с другой сторон