Варианты эритропоэтина

Варианты эритропоэтина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новым эндогенным вариантам эритропоэтина (EPO) и их применению для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с повреждением ткани вследствие смерти клеток (апоптоза, некроза) и воспалением, в частности, для нейрозащиты, например, лечения острого (например, инсульта) и хронического заболевания (например, амиотрофического бокового склероза, ALS) нервной системы.

Уровень техники

Апоплексический удар (инсульт) является нарушающим трудоспособность заболеванием, которое поражает более чем 400000 человек в год в Соединенных Штатах и является третьей наиболее распространенной причиной смерти в Соединенных Штатах. Кроме того, половина неврологических стационарных пациентов имеет связанные с инсультом проблемы. Предполагается, что при существующих тенденциях это количество повысится до одного миллиона в год к 2050 году. При суммарном рассмотрении непосредственных расходов (по уходу и лечению) и косвенных расходов (в связи с потерей трудоспособности) в случае апоплексических ударов, апоплексические удары создали бремя 43,3 миллиарда долларов в год только для населения Соединенных Штатов. Приблизительно 1/3 пациентов умирает в первые три месяца, 1/3 остается с тяжелыми нарушениями трудоспособности, и только 1/3 выздоравливает с приемлемым исходом. В 1990 году цереброваскулярные заболевания были второй основной причиной смерти во всем мире, убивающей более 4,3 миллионов людей во всем мире. Таким образом, на основании перспективы здоровья общества апоплексический удар (инсульт) является одним из наиболее заслуживающих внимания заболеваний.

Апоплексический удар характеризуется неожиданной потерей кровоснабжения зоны головного мозга, приводящей к соответствующей потере неврологической функции. Также называемый цереброваскулярным приступом (инсультом) или синдромом удара, апоплексический удар является неспецифическим термином, включающим в себя гетерогенную группу патофизиологических причин, в том числе тромбоз, эмболию и кровоизлияние. Апоплексические удары классифицируются в настоящее время как геморрагические или ишемические. Острый ишемический апоплексический удар относится к ударам, вызываемым тромбозом или эмболией, и является причиной 80% всех апоплексических ударов.

Ишемические апоплексические удары происходят из-за блокады артерий, которые снабжают кровью головной мозг, наиболее часто в разветвлениях внутренних сонных артерий. Такая блокада обычно происходит, когда часть сгустка крови (тромба) или отложения жиров (атеромы) вследствие атеросклероза отрывается (становясь эмболом), перемещается с кровотока и откладывается в артерии, которая снабжает кровью головной мозг. Сгустки крови могут образовываться при разрывании отложения жиров в стенке артерии. Разрывание такого отложения жиров может также происходить при замедлении кровотока большим отложением жиров, уменьшающим протекание крови. Кровь, которая течет медленно, имеет большую вероятность коагуляции. Таким образом, риск образования тромбов и блокирования суженной артерии является высоким. Сгустки крови могут также образовываться в других зонах, например, в сердце или на клапане сердца. Апоплексические удары, вызванные такими сгустками крови, являются наиболее частыми вскоре после операции на сердце и среди людей, которые имеют нарушение клапана сердца или аномальный ритм сердца (аритмию), в частности, фибрилляцию предсердий. При некоторых нарушениях, таких как избыток эритроцитов (полицитемия), риск сгустков крови также увеличивается, так как кровь загущается.

Ишемический инсульт может также происходить, если кровоток к головному мозгу уменьшается, как это может происходить, когда человек теряет много крови или имеет очень высокое кровяное давление. Изредка ишемический инсульт встречается, когда кровоток к головному мозгу нормальный, но кровь не содержит достаточного количества кислорода. Нарушения, которые уменьшают содержание кислорода в крови, включают в себя тяжелую анемию (недостаточность эритроцитов), асфиксию и отравление монооксидом углерода. Обычно повреждение головного мозга в таких случаях распространяется (диффундирует), и возникает кома. Ишемический инсульт может встречаться, если воспаление или инфекция сужает кровеносные сосуды, снабжающие головной мозг. Подобным образом, такие лекарственные средства как кокаин и амфетамины, могут вызвать спазм артерий, который может привести к сужению артерий, снабжающих головной мозг, до такой степени, что возникает апоплексический удар (инсульт).

Головной мозг требует глюкозы и кислорода для поддержания метаболизма и функции нейронов. Недостаточная доставка кислорода к головному мозгу приводит к гипоксии, а ишемия происходит из недостаточного мозгового кровообращения. Последствия церебральной ишемии зависят от степени и продолжительности уменьшенного мозгового кровообращения. Нейроны могут переносить ишемию в течение 30-60 минут. Если кровоток в ишемическую зону не восстанавливается, происходит ряд метаболических процессов. Нейроны становятся истощенными в отношении АТФ и переключаются на анаэробный гликолиз, гораздо менее эффективный путь. Накапливается лактат, и внутриклеточный рН уменьшается. Без достаточной подачи АТФ ионные насосы в плазматической мембране нарушаются. Полученный приток натрия, воды и кальция в клетку вызывает быстрое набухание нейронов и глиальных клеток. Деполяризация мембраны также стимулирует массивное высвобождение аминокислот глутамата и аспартата, обе из которых действуют в качестве возбуждающих нейротрансмиттеров в головном мозге. Глутамат дополнительно активирует натриевые и кальциевые ионные каналы в мембране нейронных клеток, а именно, хорошо охарактеризованный N-метил-D-аспартатный (NMDA) кальциевый канал. Избыточный приток кальция в клетку вызывает нарушенную активацию большого диапазона ферментных систем (протеаз, липаз и нуклеаз). Эти ферменты и продукты их метаболизма, такие как свободные радикалы кислорода, повреждают мембраны клеток, генетический материал и структурные белки в нейронах, приводя, в конечном счете, к смерти клеток нейронов (Dirnagl, U. et al. (1999) Trends Neurosci. 22: 391-397).

Апоплексические удары начинаются неожиданно, развиваются быстро и вызывают смерть ткани головного мозга в пределах минут - дней. В ишемическом головном мозге обычно различают два объема тканей: сердцевину повреждения (инфаркта) и окружающую зону, известную как ишемическая полутень - недостаточно перфузируемую и метаболически нарушенную границу, окружающую безвозвратно поврежденную сердцевину. Сердцевина и полутень характеризуются двумя различными типами смерти клеток: некрозом и апоптозом (который называют также запрограммированной смертью клеток или задержанной смертью нейронных клеток). Тяжелый дефицит перфузии (кровотока) в сердцевине вызывает распад метаболических процессов, клеточной подачи энергии и гомеостаза ионов, что заставляет клетки терять их целостность в пределах минут. Таким образом, острый некроз клеток и тканей преобладает в сердцевине. В полутени некоторая остаточная перфузия сохраняется в коллатеральных сосудах, которые могут быть не способны поддерживать полный функциональный метаболизм, но предотвращают немедленную структурную дезинтеграцию. Однако со временем (часы - несколько дней) изменение клеточного гомеостаза заставляет умирать все больше и больше клеток, и объем инфаркта увеличивается. Таким образом, полутень должна рассматриваться как ткань, связанная с риском во время созревания инфаркта. В этой области каскады сигналов апоптоза и воспалительных сигналов играют важную роль. Полутень может первоначально составлять 50% объема, который будет заканчиваться в виде инфаркта. Механизмы, которые приводят к задержанной смерти клеток, обеспечивают мишени для специфической нейрозащитной терапии в областях головного мозга, пораженных ишемией, но все еще являющихся жизнеспособными.

Терапевтические возможности пока являются крайне неутешительными: тромболиз при помощи rtPA, единственная терапия с доказанной эффективностью в большом клиническом испытании (NINDS) является эффективным только во временном окне 3 часов, что ограничивает его применение только небольшим количеством пациентов с ишемическим инсультом. Другими словами, наряду с базовой поддерживающей терапией, в настоящее время более чем 95% инсультов не могут лечиться конкретно. Это находится в резком противоречии с нашим знанием в отношении базовой патофизиологии этого заболевания, которое возникло на протяжении последнего десятилетия. В частности, экстенсивное знание было накоплено по механизму паренхимного повреждения головного мозга и эндогенной нейрозащиты, а также функциональной и структурной реорганизации.

Недавно внимание было сфокусировано на потенциальной терапевтической роли эндогенных белков головного мозга, обладающих нейрозащитными свойствами. ЕРО, гликопротеиновый гормон, продуцируемый первично клетками эндотелия перитубулярных капилляров почки, который является членом семейства гормонов роста/пролактоновых цитокинов (Zhu Y. аnd D'Andrea A.D.: (1994) Curr. Opin. Hematol. 1: 113-118), является подающим надежды кандидатом. Хотя ЕРО был сначала охарактеризован и широко известен теперь в связи с его ролью в качестве гемопоэтического гормона, детектирование ЕРО и его рецептора (EPOR) в ткани головного мозга грызунов и человека, а также в культивируемых нейронах и астроцитах, расширило поиск в отношении других биологических функций ЕРО.

В головном мозге паракринная ЕРО/(Еро-R)₂-система существует независимо от эндокринной системы зрелого эритропоэза; нейроны экспрессируют (Epo-R)₂, а астроциты продуцируют ЕРО (Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Prass et al. (2003) Stroke 34, 1981-1986). Было продемонстрировано in vitro и in vivo, что ЕРО является сильным ингибитором нейронного апоптоза, индуцируемого ишемией и гипоксией (Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Bernaudin, M., et al. (1999) J Cereb Blood Flow Metab. 19: 643-51; Morishita, E., et al. (1997) Neuroscince, 76: 105-16). Несколькими группами сообщалось, что добавление ЕРО к нейронным культурам защищает против гипоксии и токсичности глутаминовой кислоты (Henn F.A: and Braus D.F. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249: 48-56, Vogeley K. et al. (2000) Am. J. Psychiatry 157: 34-39) и уменьшает неврологическую дисфункцию в моделях инсульта грызунов (Brines M.L. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 10526-10531 и Bernaudin et al. (1999) J. Cereb. Blood Flow Metab. 10: 643-651). Многообещающие результаты этих экспериментов были подтверждены в исследованиях на человеке, в которых было показано, что ЕРО-терапия для острого инсульта является безопасной и может быть полезной (Eherenreich H. et al. (2002) Mol. Medicine 8: 495-505) и WO 00/35475 А2. Эти клеточные и, более конкретно, нейрозащитные свойства ЕРО привели к дополнительному исследованию в этой области для подтверждения этих открытий в большем испытании, и применение ЕРО в настоящее время предложено также и в другом показании, в том числе, например, в случае шизофрении (Ehrenreich H et al. (2004) Molecular Psychiatry 9: 42-54 и WO 02/20031 А2).

Для применения ЕРО с целью предотвращения повреждения ткани гемопоэтическая активность часто не требуется и может быть вредной, если вводят большие количества ЕРО для лечения или уменьшения эффектов индуцированного гипоксией или ишемией повреждения тканей. Таким образом, были предприняты попытки создания вариантов ЕРО, которые проявляют только клеткозащитное свойство, но не гемопоэтические свойства. US 2003/0130197 описывает пептидные миметики ЕРО для лечения нейродегенеративных нарушений, которые не имеют гомологию последовательности с природно-встречающимся ЕРО или его фрагментами. US 6531121 описывает асиалоэритропоэтин, который генерируют полным десиалилированием рекомбинантного ЕРО, который показал увеличенную способность пересечения барьера эндотелиальных клеток и имел уменьшенную гемопоэтическую активность. Было также показано, что карбамилированный эритропоэтин (СЕРО) также обнаруживает тканезащитное действие, но не имеет эритропоэтического действия (Leist et al. (2004) Science 305: 239-242 и WO 2005/025606 А1.

Наконец, было показано, что 17-мерный пептид ЕРО ингибировал смерть клеток двух нейронных клеточных линий, SK-N-MC и NS20Y (Campana W.M. et al. (1998) Int. J. Mol. Medicine 1: 235-241), не имея в то же самое время гемопоэтической активности. Однако требовался 1 нг/мл этого пептида ЕРО для индукции того же самого антиапоптотического эффекта, который вызывали 100 пг/мл рекомбинантного ЕРО (rhEPO) в клетках NS20Y и 400 пг/мл rhEPO в клетках SK-N-MC. При кажущейся средней молекулярной массе rhEPO приблизительно 66000 г/моль (рассчитанная молекулярная масса равна приблизительно 33000 г/моль, но не включает в себя массу олигосахаридных остатков, содержащихся в rhEPO) и приблизительно 1900 г/моль пептида ЕРО, концентрации 1,52 пмоль/л и 6,06 пмоль/л, соответственно, rhEPO и 1 нмоль/л пептида ЕРО индуцировали одинаковый уровень защитного для клеток действия. Таким образом, пептид ЕРО является в 650-165 раз менее активным, чем rhEPO в предупреждении смерти клеток. Из этих цифр видно, что область ЕРО, содержащаяся в этом 17-мере, не играет главную роль в функции защиты клеток ЕРО. Таким образом, все варианты ЕРО, которые имеют уменьшенную гемопоэтическую активность, известные в предыдущем уровне техники, страдают от недостатка, заключающегося в том, что они не являются природно-встречающимися, так как они либо потеряли их природное гликозилирование, либо являются искусственными укорочениями и/или они имеют значительно уменьшенную клеткозащитную активность в сравнении с rhEPO. Таким образом, существует потребность в известном уровне техники в обеспечении производного ЕРО, которое является близким к природно-встречающемуся ЕРО и которое имеет такую же или лучшую тканезащитную активность, что и rhEPO, но меньшую гемопоэтическую, в частности, эритропоэтическую активность или полной отсутствие этой активности.

Эта проблема решена обеспечением новых вариантов ЕРО, которые, как было обнаружено, встречаются в природе в ткани человека и мыши (в головном мозге, в почке) и которые обнаруживают клеткозащитную активность, сходную или лучшую относительно rhEPO, но которые не проявляют какой-либо значимой гемопоэтической активности.

Сущность изобретения

В одном аспекте данное изобретение относится к кодирующему вариант ЕРО полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере зрелую форму полипептидов, названных hs3, h1-4, h1-5, hs4, h1-1, h2-1, mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющих расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22, соответственно;

(b) полинуклеотидов, имеющих кодирующую последовательность, показанную в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21, кодирующую по меньшей мере зрелую форму этого полипептида;

(c) полинуклеотида, кодирующего гуманизированную версию полипептидов mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющую расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:14, 16, 18, 20 и 22;

(d) полинуклеотидов, кодирующих полипептид, содержащий слияние аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:24, 26, 28 и 30, на N-конце аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:32, 34, 36 и 38;

(е) полинуклеотидов, содержащих слияние полинуклеотидных последовательностей, выбранных из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:23, 25, 27 и 29, 5' (слева) относительно полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:31, 33, 35 и 37;

(f) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(е), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(g) полинуклеотидов, кодирующих фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(f), где в указанном фрагменте 1-10 аминокислотных остатков делетированы на N-конце и/или С-конце и/или 1-10 аминокислот делетированы на N-конце и/или С-конце границы сплайсинга в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(h) полинуклеотидов, которые являются по меньшей мере на 50% идентичными полинуклеотиду по любому из (а)-(g) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности; и

(i) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(h) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

Следующим аспектом данного изобретения является гомолог кодирующего вариант эритропоэтина (ЕРО) полинуклеотида, из других высших эукариотических видов.

Следующим аспектом данного изобретения является кодирующий вариант ЕРО полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих полипептид варианта ЕРО, который содержит N-концевую часть полноразмерного ЕРО, в том числе спираль А, и который лишен по меньшей мере одного фрагмента из следующих:

(i) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот между спиралью А и спиралью В;

(ii) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 аминокислот спирали В;

(iii) фрагмента из по меньшей мере 2 аминокислот, предпочтительно 3, 4, 5 или 6 аминокислот между спиралью В и спиралью С;

(iv) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 аминокислот спирали С;

(v) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 аминокислот между спиралью С и спиралью D; и/или

(vi) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 спирали D;

где указанный вариант имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(b) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(с) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

В предпочтительном аспекте полинуклеотидом данного изобретения является ДНК, геномная ДНК или РНК.

В другом аспекте данное изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид данного изобретения. Предпочтительно, полинуклеотид, содержащийся в этом векторе, функционально связан с регуляторными последовательностями экспрессии, делающими возможной экспрессию в прокариотических и/или эукариотических клетках-хозяевах.

Другим аспектом этого изобретения является клетка-хозяин, генетически сконструированная с полинуклеотидом данного изобретения или вектором данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является трансгенное животное, не являющееся человеком, содержащее полинуклеотид данного изобретения, вектор данного изобретения и/или клетку-хозяина данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является способ получения полипептида варианта ЕРО, кодируемого полинуклеотидом данного изобретения, предусматривающий: культивирование клетки-хозяина данного изобретения и извлечение полипептида, кодируемого указанным полинуклеотидом.

В предпочтительном варианте осуществления способ данного изобретения дополнительно предусматривает стадию модификации указанного варианта ЕРО, где эта модификация выбрана из группы, состоящей из окисления, сульфатирования, фосфорилирования, добавления олигосахаридов или их комбинаций.

Другим аспектом этого изобретения является способ получения клеток, способных экспрессировать по меньшей мере один из вариантов ЕРО, предусматривающий генетическое конструирование клеток in vitro с вектором данного изобретения, где указанный полипептид (указанные полипептиды) варианта ЕРО кодируется (кодируются) полинуклеотидом данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом данного изобретения или получаемую по способу данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является антитело, специфически связывающееся с полипептидом данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотид данного изобретения, вектор данного изобретения, клетку-хозяина данного изобретения, полипептид данного изобретения и/или антитело данного изобретения и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Другим аспектом этого изобретения является применение полинуклеотида данного изобретения, вектора данного изобретения, клетки-хозяина данного изобретения, полипептида данного изобретения для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, связанного с повреждением ткани вследствие смерти клеток, например, апоптоза или некроза, а также воспалением.

В предпочтительном применении данного изобретения смерть клеток индуцирована ишемией, гипоксией, бактериальной инфекцией, вирусной инфекцией, индуцирована аутоиммунологическим, травматическим, химическим (например, метаболическим, токсическим) образом или индуцирована излучением.

В предпочтительном применении данного изобретения этим состоянием является острое нейродегенеративное/нейровоспалительное нарушение или хроническое нейродегенеративное/нейровоспалительное нарушение, острое или хроническое нарушение сердца (например, инфаркт миокарда), легкого (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких), почки (например, гломерулонефрит), печени (например, хроническая печеночная недостаточность) или поджелудочной железы (например, панкреатит) или указанное состояние ассоциировано с трансплантацией органа (например, почки или печени) или клеток (например, стволовых клеток).

Предпочтительно, острое нейродегенеративное и/или нейровоспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из церебральной ишемии или инфаркта, в том числе эмболической окклюзии и тромботической окклюзии, реперфузии после острой ишемии, перинатального гипоксического-ишемического повреждения, остановки сердца, внутричерепного кровоизлияния, субарахноидального кровоизлияния и внутричерепных повреждений (например, травмы ЦНС), повреждений спинного мозга, внутрипозвоночных повреждений, «whiplash shaken» - синдрома младенцев, инфекционного энцефалита (например, герпетического энцефалита), менингита (например, бактериального), головной боли (например, мигрени).

Предпочтительно, хроническое нейродегенеративное/нейровоспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из деменций (например, болезни Альцгеймера, сосудистых деменций), болезни Пика, диффузного заболевания организма Леви, прогрессирующего супрануклеарного паралича (синдрома Стила-Ричардсона), рассеянного склероза, множественной системной атрофии (в том числе синдрома Шай-Драгера), хронических эпилептических состояний, ассоциированных с нейродегенерацией, заболеваний двигательных нейронов, дегенеративных атаксий, кортикальной базофильной дегенерации, комплекса Гуама амиотрофического бокового склероза (ALS)-деменции Паркинсона, подострого склерозирующего панэнцефалита, болезни Хангтингтона, болезни Паркинсона, синуклеинопатий, первичной прогрессирующей афазии, стриатонигральной дегенерации, заболевания Махадо-Джозефа/спинально-церебеллярной атаксии типа 3 и оливомостомозжечковых дегенераций, болезни Жиля де ла Туретта, бульбарного и псевдобульбарного паралича, спинномозговой и спинально-бульбарной мышечной атрофии (болезни Кеннеди), первичного бокового склероза, семейной спастической параплегии, болезни Верднига-Хоффмана, болезни Кугельберга-Веландера, болезни Тея-Сакса, болезни Зандхоффа, семейной спастической болезни, спастического парапареза, прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии, семейной вегетативной дисфункции (синдрома Райля-Дея), полиневропатий (например, диабетической, алкогольной-токсической полиневропатии, синдрома Гийена-Барре, хронической воспалительной димиелинизирующей полиневропатии), вызываемых прионами заболеваний, привыкания, аффективных нарушений (например, депрессии), шизофренических нарушений, синдрома хронической усталости, хронической боли (например, боли нижней части спины).

В предпочтительном применении данного изобретения этим состоянием является старение.

В предпочтительном применении данного изобретения лекарственное средство вводят до или после возникновения указанного состояния.

Подробное описание изобретения

Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, обычно понимаемое специалистом с обычной квалификацией в области, к которой относится данное изобретение. В случае противоречия, будут предпочтительными определения данного изобретения. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя в применении на практике или в испытании данного изобретения могут быть также использованы способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном объеме. Материалы, способы и примеры, описанные здесь, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Данное изобретение основано на неожиданном наблюдении, что в нейронной ткани экспрессируются варианты ЕРО, и определении, что эти варианты защищали нейроны от повреждения, индуцированного лишением кислорода и глюкозы, но не обнаруживали гемопоэтической активности. Это поведение делает их подходящими для применения в качестве терапевтических веществ в ситуациях, в которых гемопоэтическая функция ЕРО не требуется или является вредной. Таким образом, первым аспектом данного изобретения является кодирующий вариант ЕРО полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере зрелую форму полипептидов, названных hs3, h1-4, h1-5, hs4, h1-1, h2-1, mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющих расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22, соответственно;

(b) полинуклеотидов, имеющих кодирующую последовательность, показанную в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21, кодирующую по меньшей мере зрелую форму этого полипептида;

(c) полинуклеотида, кодирующего гуманизированную версию полипептидов mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющую расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:14, 16, 18, 20 и 22;

(d) полинуклеотидов, кодирующих полипептид, содержащий слияние аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:24, 26, 28 и 30, на N-конце, предпочтительно непосредственно, т.е. без каких-либо промежуточных аминокислот, аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:32, 34, 36 и 38;

(е) полинуклеотидов, содержащих слияние полинуклеотидных последовательностей, выбранных из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:23, 25, 27 и 29, 5' (слева), предпочтительно непосредственно 5' (слева), т.е. без каких-либо промежуточных полинуклеотидов, относительно полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:31, 33, 35 и 37;

(f) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(е), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(g) полинуклеотидов, кодирующих фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(f), где в указанном фрагменте 1-10 аминокислотных остатков делетированы на N-конце и/или С-конце и/или 1-10 аминокислот делетированы на N-конце и/или С-конце границы сплайсинга в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(h) полинуклеотидов, которые являются по меньшей мере на 50% идентичными полинуклеотиду по любому из (а)-(g) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности; и

(i) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(h) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

Данное изобретение относится также к кодирующему пептид варианта ЕРО полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, названные ha, hAma, hAmE, hA-10 и ha-транспортной последовательностью, имеющих расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:50, 51, 52, 53 и 61, соответственно;

(b) полинуклеотидов, имеющих кодирующую последовательность, показанную в SEQ ID NO:55, 56, 57, 58 и 60, кодирующую по меньшей мере зрелую форму этого полипептида;

(c) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(b), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(d) полинуклеотидов, кодирующих фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(b), где в указанном фрагменте 1-10 аминокислотных остатков делетированы на N-конце и/или С-конце и/или 1-10 аминокислот делетированы на N-конце и/или С-конце границы сплайсинга в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(е) полинуклеотидов, которые являются по меньшей мере на 50% идентичными полинуклеотиду по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности; и

(i) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

В следующем аспекте полинуклеотиды данного изобретения содержат гомологи вариантов ЕРО данного изобретения, полученные из других высших эукариотических видов, в частности, из млекопитающих, более предпочтительно, из приматов, не являющихся человеком; из грызунов, например, крысы или морской свинки; жвачных, например, коровы; или овцы; лошади; свиньи; кролика; собаки или кошки, которые имеют клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеют гемопоэтической активности. В данном контексте, термин гомолог относится к полинуклеотиду, кодирующему вариант ЕРО, происходящий из другого вида, который содержит по существу такую же делецию, что и полинуклеотиды, соответствующие SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 55, 56, 57, 58 или 60. Предполагается, что делеция полинуклеотида является по существу той же самой, если она включает в себя делецию полинуклеотидов, кодирующих полипептид, который является гомологичным соответственно делетированным полипептидам в полипептидах варианта ЕРО, соответствующих SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 50, 52, 53 или 61. Критерии для определения гомологии между двумя пептидными последовательностями являются хорошо установленными. Для этой цели могут использоваться такие программы, как BLAST. Предполагается, что делеция является по существу той же самой, если она включает в себя на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 55, 56, 57, 58 или 61 больше или меньше нуклеотидов, чем соответствующая делеция в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21, которые также изображены на фиг. 2 и 3.

Следующим аспектом данного изобретения является кодирующий вариант ЕРО полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих полипептид варианта ЕРО, который содержит N-концевую часть полноразмерного ЕРО, в том числе спираль А, и который лишен по меньшей мере одного фрагмента из следующих:

(i) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот между спиралью А и спиралью В;

(ii) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 аминокислот спирали В;

(iii) фрагмента из по меньшей мере 2 аминокислот, предпочтительно 3, 4, 5 или 6 аминокислот между спиралью В и спиралью С;

(iv) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 аминокислот спирали С;

(v) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 аминокислот между спиралью С и спиралью D; и/или

(vi) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 спирали D;

где указанный вариант имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(b) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(с) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

В этом контексте, спирали А, В, С и D полипептида ЕРО являются районами, гомологичными соответствующим районам спиралей А, В, С и D полноразмерного ЕРО из мыши и человека, представленных на фиг.4. В данной области хорошо известно, как определить гомологии между двумя полипептидными последовательностями, и любой квалифицированный в данной области специалист будет способен сопоставить конкретную полипептидную последовательность ЕРО, например, из другого вида, и определить соответствующее положение спиралей А, В, С и D в этом полипептиде ЕРО. Предпочтительно, полинуклеотид варианта ЕРО получен из высшего эукариотного организма, в частности, млекопитающего или птицы. Предпочтительными млекопитающими являются люди, приматы, не являющиеся человеком; грызуны, например, крыса, морская свинка; жвачные, например, корова; или овца; лошадь; свинья; кролик; собака или кошка. Известны большое количество таких кодирующих полноразмерный ЕРО полинуклеотидов из различных видов, в том числе, без ограничения, кошки