Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью

Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью

Реферат

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективных средств профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты различной локализации).

Применяемый в нашей стране антикоагулянт прямого типа действия нефракционированный гепарин (НФГ) является полисахаридом с молекулярной массой 2-40 кДа, в среднем 15 кДа, и обладает рядом нежелательных побочных эффектов (остеопорозы, тромбоцитопении, повышение функциональной активности тромбоцитов, геморрагические осложнения). С целью разработки новых антикоагулянтных средств, лишенных побочных эффектов гепаринов, получают сульфатированные полисахариды (СП) растительного происхождения (выделенные из водорослей, лишайников, грибов, высших растений), а также выделенные из тканей морских беспозвоночных, членистоногих или млекопитающих [Mayer A.M.S., Rodriguez A.D., Berlinck R.G.S., et al. Marine pharmacology in 2003-4: marine compounds with anthelminthic, antibacterial, anticoagulant, antifungal, antiinflammatory, antimalarial, antiplatelet, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the cardiovascular, immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action. // Comp Biochem Physiol С Toxicol Pharmacol. - 2007, N.4. Vol.145. - P.553-581; Yoona S.J., Yub M.A., Pyunb Y.R., et al. The nontoxic mushroom Auricularia auricula contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated by antithrombin // Thrombosis Research. - 2003. Vol.112. P.151-158; Shen W.Z., Zhou R.F., Wang X.F., Ding Q.L., Wang H.L. Antithrombotic mechanisms of holothurian glycosaminoglycan extracted from sea cucumber Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. // 2006. - N.9. - Vol.27. P.579-83; Jayakumar R., Nwe N., Tokura S., Tamura H. Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials // International Journal of Biological Macromolecules. - 2007. - N.40. P.175-181]. Для придания молекулам полисахаридов необходимых свойств их деполимеризуют [Noti С., Seeberger P. Chemical approaches to define the structure-activity relationship of heparin-like glycosaminoglycans. // Chemistry & Biology. - 2005. - V.12. N 7. P.731-756], в них встраивают функциональные группы [Yang J., Du Y., Huang R., et al. The structure - anticoagulant activity relationships of sulfated lacquer polysaccharide. Effect of carboxyl group and position of sulfation // International Journal of Biological Macromolecules. - 2005. N.36. - P.9-15], объединяют (конъюгируют) с молекулами других полисахаридов [Du J., Zhang S., Sun R., Zhang L. Novel polyelectrolyte carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles for drug delivery. I. Physicochemical characterization of the carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles. // Biopolymers. - 2005. - V.78, N 1. P.1-8]. Структура макромолекулы полисахарида играет важную роль при проявлении антикоагулянтной активности (АА). Так, под действием модифицированного аргинином хитозана (конъюгат хитозан - аргинин) происходят конформационные изменения молекулы тромбина [Liu W.G., Zhang J.R., Cao Z.O., Xu F.Y., Yao К.D. A chitosan-arginine conjugate as a novel anticoagulation biomaterial. // J. Mater Sci Mater Med. - 2004. N11. Vol.15. - P.1199-203]. Введение функциональных групп для получения химически модифицированного N-propanoyl-, N-hexanoyl-сульфата хитозана, и сульфата хитозана, содержащего кватернизованные атомы азота, приводит к увеличению АА [Huang R., Du Y., Yang J., Fan L. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate. // Carbohydr Res. - 2003. N.6. - Vol.14, - P.483-489]. При изменении положительного заряда поверхности полимерного биоматериала на основе хитозана с боковыми цепями из полиэтиленгликоля и гексанала на нейтральный или отрицательный при введении SO₃ ^- групп, снижается адгезия тромбоцитов и возрастает биосовместимость с кровью, которая положительно коррелирует с содержанием полиэтиленгликоля внутри полимера [de Vasconcelos С.L., Bezerril P.M., dos Santos D.E.S., Dantas T.N.С. Effect of molecular weight and ionic strength on the formation of polyelectrolyte complexes based on poly(methacrylic acid) and chitosan. // Biomacromolecules. - 2006. N.7. - P.1245-1252].

Препятствиями для широкого внедрения антикоагулянтов на основе полисахаридов микробного и животного происхождения или их модификаций являются либо их малодоступность, дороговизна, сложности, связанные с последующей химической модификацией и очисткой целевого соединения, либо недостаточная биологическая совместимость.

Большей части указанных недостатков лишены полисахариды растительного происхождения и, прежде всего, целлюлоза - доступные и биосовместимые, они представляют собой прекрасную основу для создания новых антикоагулянтных средств. Поскольку сульфаты целлюлозы являются полусинтетическими аналогами распространенных в природе сульфатированных полисахаридов, а синтез сульфатированных производных целлюлозы экономически оправдан, активно разрабатываются методы их получения, исследуются их свойства.

Известны работы, посвященные исследованию производных целлюлозы в качестве антикоагулянтов крови [Dedgumjorn А.С., Toyoda H., Woo E. Effect of (1→3)-and (1→4)-linkages of fully sulfated polysaccharides on the ir anticoagulant activity // Carbohydrate Research V.337. - 2002. P.925-933]. Отмечено, что наиболее перспективны в этом отношении производные, содержащие сильные электроотрицательные группы - сульфатные, сульфонатные, фосфатные, что предполагает механизм действия, связанный с кооперативным электростатическим комплексообразованием между белковыми телами крови и производным целлюлозы.

Для введения в структуру целлюлозы сульфатных групп используют различные методы: этерификацию целлюлозы серной кислотой и ее смесями с алифатическими спиртами [Петропавловский Г.А., Крунчак М.М. Сернокислые эфиры целлюлозы (сульфатцеллюлоза) // ЖПХ. - 1967. -Т.38. - №10. - С.2209-2220], сульфатирование серным ангидридом в присутствии пиридина, N,N-диметилформамида (ДМФА) и других органических оснований; реакции переэтерификации ацетатов и формиатов целлюлозы триоксидом серы или хлорсульфоновой кислотой в гомогенной среде органического растворителя [Fhilipp В., Wagenknecht W., Nehls I. Untersuhungen zur sulfatirung von celluloseformiat im vergleich zu cellulose acetat unter homogen reaktionbedingungen // Cellulose chem. and tech. -1990. - 24. - P.667-678]. Описан метод гомогенного сульфатирования целлюлозы в среде N,N-диметилформамида, который состоит в обработке набухшей в этом растворителе целлюлозы газообразным оксидом азота (V) и в последующей обработке полученного гомогенного раствора газообразным оксидом серы (IV). После выделения и очистки получают сульфаты целлюлозы с высокой степенью замещения [Schuldt U., Wagenknecht W., Richter A. Electrosorption of sodium cellulose sulfates with different substitution patterns // Cellulose. - 2002. - №9. - P.271-282].

Для использования в качестве антикоагулянтов крови значительный интерес представляют также смешанные эфиры целлюлозы, содержащие помимо сульфатной группы дополнительные функциональные группы (ацетатную, карбоксильную, аминную и другие). Способы получения таких производных, как правило, включают несколько стадий [Miyamoto К., Shimizu P., Tokita M. Adhesion of 3-carboxymethyl-cellulose-6-sulfate to extra domain A-containing fibronectin: development of ligands for cryogel removal // J. Artif. Organs - 2002. - V.5. P.132-135; Baumann H. Exclusive and complete introduction of aminogroups and thier N-sulfo and N-carboxymethyl groups into the 6-position cellulose with out the use of protecting groups // Carbohydrate Research. - 2002. N.337. - P.1297-1307].

Исходным материалом для синтеза сульфатов целлюлозы тем или иным способом с дополнительными заместителями или без служат различные структурные модификации целлюлозы - хлопковая волокнистая целлюлоза со степенью полимеризации от 800 и выше [Richter A., Klemm D. Regioselective sulfation of trimethylsilyl cellulose using different SO₃-complexes // Cellulose. - 2003. N.10. - P.133-138], а в последнее время также микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) [Ardisone S., Dioguardi F.S., Mussini Т., et al. Microcrystalline cellulose powders: structure, surface feature sand water sorption capability // Cellulose. - 1999. - N 6. - P.57-69] и прочие порошковые формы целлюлозы (ПЦ), получаемые из целлюлозы хлопка, древесины или другого сырья тем или иным способом.

Задачей настоящего изобретения является получение эффективных средств профилактики и лечения тромботических состояний на основе порошковых форм целлюлозы, выделенной из различного сырья растительного происхождения.

Технический результат состоит в том, что в структуру целлюлозной макромолекулы вводятся сульфатные группы, либо сульфатные группы совместно с карбоксиметильными, либо амидоэтильными, либо фосфатными группами в различном соотношении, но со степенью замещения по сульфатным группам (CЗ_S) не менее 1.0, в этом и состоит технический результат.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования целлюлозного материала, согласно изобретению в качестве такового используются порошковые формы целлюлозы со степенью полимеризации от 250 и ниже, выделенные из растительного сырья, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель Х=Н, -SO₃ ^-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат карбоксиметилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, согласно изобретению перед реакцией сульфатирования натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают моногидратом n-толуолсульфокислоты в эквимолярном соотношении карбоксиметильная группа - n-толуолсульфокислота в безводном N,N-диметилформамиде, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель X=Н, -SO_3-, CH₂COO^-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат амидоэтилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, согласно изобретению перед реакцией сульфатирования проводят активацию цианоэтилцеллюлозы в растворе N,N-диметилформамида, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель Х=Н, -SO₃, CH₂CH₂CONH₂, при этом сульфатирование осуществляют в растворе N,N-диметилформамида.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат фосфата целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозного сырья, согласно изобретению реакционная смесь включает от 2 до 8 моль воды на моль целлюлозы, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель X=Н, -SO₃, PO(ONa)₂ либо RO-PO(ONa)₂, где R - целлюлоза, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

Ближайшим к заявляемому способу получения сульфатированных полисахаридов с указанной степенью замещения или выше является способ, предложенный для синтеза трисульфатов курдлана [Yoshida Т., Yasuda Y., Mimura T. Synthesis of curdlan sulfates having inhibityory effects in vitro against AIDS viruses HIV-1 and HIV-2 // Carb. Res. - 1995. V.276, - P.425-436]. По этому способу готовят сульфатирующую смесь прибавлением ClSO₃H (33.2 моль) к сухому пиридину (80 см³). После чего вносят курдлан (3.1 моль). Реакционную смесь термостатируют при 100°С в течение часа. Затем охлаждают и прибавляли избыток 10%-ного NaOH. Полисахарид осаждают ацетоном, выделяют и очищают методом диализа.

В отличие от описанного способа, для получения сульфатов порошковой целлюлозы (СЦ) нами предлагаются следующие условия проведения реакции: порошковую целлюлозу диспергируют в сухом пиридине и термостатируют при 100°С в течение часа для активации полимера. Затем к реакционной смеси при охлаждении до 0-5°С прибавляют 1-6 моль ClSO₃H в расчете на моль элементарного звена целлюлозы в зависимости от желаемой степени сульфатирования получаемой СЦ. Также нами предлагается использовать меньший избыток пиридина (40-60 см³ на 1.0 г целлюлозы, в зависимости от вида ПЦ). Наконец, предлагается использовать следующий температурный режим проведения реакции: 100°С в течение первого часа, затем 1 ч при 90°С и в течение последнего часа - 80°С.

Известно несколько методов получения сульфатов карбоксиметлцеллюлозы (СКМЦ) (СКМЦ). В работе [Miyamoto К., Shimizu P., Tokita M. Adhesion of 3-carboxymethyl-cellulose-6-sulfate to extra domain A-containing fibronectin: development of ligands for cryogel removal // J. Artif. Organs -2002.- V.5. P. 132-135] описан метод получения СКМЦ исходя из СЦ. По нему, карбоксиметилирование СЦ, синтезированного тем или иным способом, осуществляют монохлоруксусной кислотой в среде воды и изо-пропилового спирта в присутствии гидроксида натрия, при температуре 60°С. Недостатком этого метода является затруднения в карбоксиметилировании СЦ с большой степенью сульфатированияя, т.к. с увеличением СЗ_s в препаратах СЦ, при последующем карбоксиметилировании нарастают процессы взаимоотталкивания одноименно заряженных сульфатных и монохлорацетатных групп. Среди других недостатков метода следует отметить процессы отщепления сульфатных групп, возможные в условиях такого алкилирования СЦ.

Способ одновременного введения сульфатной и карбоксиметильной группы в структуру целлюлозы предложен авторами работы [Тимохин И.М., Прокофьева М.В. и др. Получение и свойства некоторых смешанных эфиров целлюлозы // Химия и технология производных целлюлозы. Владимир, 1971, с.223-227]. Для этого предлагается использовать обработку целлюлозы смесью монохлоруксусной и фторсульфоновой кислот в присутствии щелочи. Реакция осуществляется в водной среде. По этому способу получены препараты СКМЦ со степенью замещения по сульфатным группам до 0.7, по карбоксиметильным группам до 0.9. Однако недостатком метода является дороговизна и токсичность фторсульфоновой кислоты.

Ближайший к заявляемому способ получения СКМЦ предложен авторами работы [Vogt S., Heinze T. Preparation of carboxymethylcellulose sulfate of high degree of substitution // Carbohydrate Research. 1995. V.266. P.315-320]. По нему сульфатированию КМЦ предшествует стадия активации, которая состоит в обработке КМЦ-Na безводной n-толуолсульфоновой кислотой в N,N-диметилацетамиде в течение 30 минут при 60°С. В результате чего реакционная смесь гомогенизируется. Далее вносят сульфатирующий агент - SO₃, или ClSO₃H. Реакцию ведут в гомогенном растворе при комнатной температуре в течение часа.

Недостатками этого способа являются использование дорогой и неудобной в обращении безводной n-толуолсульфоновой кислоты, а также процессы деструкции целлюлозных макроцепей в присутствии сульфатирующих агентов и образующихся продуктов реакции.

В отличие от описанного способа, нами предлагается использовать вместо безводной n-толуолсульфоновой кислоты ее более доступный, дешевый и удобный в обращении моногидрат.Отличительной особенностью предлагаемого способа также является замена N,N-диметилацетамида на N,N-диметилформамид, что позволяет осуществить гомогенную этерификацию в более мягких условиях, значительно снижая тем самым процессы деструкции, т.к. сульфатирующим агентом в этом случае служит комплекс N,N-диметилформамид - ClSO₃H, образующимся in situ. Существенно и то, что N,N-диметилформамид является доступным, недорогим растворителем.

Сульфаты целлюлозы, содержащие в структуре макромолекулы дополнительно амидные группы - сульфат амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ) были впервые получены нами сульфатированием цианэтилцеллюлозы и последующим мягким омылением CN-групп. Для сульфатирования использовали препараты цианэтилцеллюлозы, полученные обычными методами. Высокое сродство препаратов цианэтилцеллюлозы к органическим растворителям позволяет осуществлять сульфатирование в ДМФА при гомогенном составе реакционной среды. Раствор препарата цианэтилцеллюлозы со CЗ_CN=0.36 в ДМФА может быть получен после перемешивания и кратковременного нагревания. Сульфатирование осуществляли хлорсульфоновой кислотой при комнатной температуре. Через час обработки был получен сульфат цианэтилцелюлозы со CЗ_s=0.79. Увеличение продолжительности реакции до 2-3 ч приводит к препаратам со степенью замещения около 1.30. Непосредственно после окончания реакции выделяли полупродукт - сульфат цианэтилцеллюлозы, омылением CN-групп которой получали САЭЦ. Омыление цианэтиловых групп осуществляли в щелочной среде (рН=10) в присутствии пероксида водорода. При такой обработке цианэтильные группы количественно омылялись до амидных и, частично, до карбоксиэтильных. По данным потенциометрического титрования, содержание карбоксиэтильных групп в препаратах САЭЦ не превышает 5-10% от количества цианэтильных групп.

Получение смешанного эфира целлюлозы, содержащего одновременно сульфатные и фосфатные группы, - сульфата фосфата целлюлозы (СФЦ) осуществляли по разработанному нами одностадийному методу. По структуре и свойствам СФЦ является аналогом известных водорастворимых ионогенных эфиров целлюлозы, содержащих сильные электроотрицательные группы (сульфатные, сульфонатные, фосфатные), например сульфатов или фосфатов целлюлозы.

Ближайшим соединением аналогичного с СФЦ функционального состава является сульфатированный фосформаннан, получение которого описано в работе [Yu G., Gunay N.S., Linhardt R.J. et al. Preparation and anticoagulant activity of the phosphosulfomannan PI-88 // European Journal of Medicinal Chemistry - 2002. V.37. P.783-791]. Авторами произведено сульфатирование экзополисахарида микробиологического происхождения PI-88, содержащего фосфатные группы. Полученные препараты фосфорсульфоманнана содержат одновременно сульфатные и фосфатные группы и обладают высокой антикоагулянтной активностью.

Ближайшими способом этерификации целлюлозы с целью получения сульфатированных эфиров целлюлозы, содержащих дополнительные (ацетатные) группы, является метод, предложенный в патенте [Пат. Евраз. РСТ/ЕР2006/060626]. По данному методу целлюлозу этерифицируют смесью, включающей хлорсульфоновую кислоту и ангидрид (или хлорангидрид) уксусной кислоты в безводном N,N-диметилформамиде (ДМФА). Исходная гетерогенная реакционная смесь гомогенизируется в процессе реакции. После выделения и очистки получают препараты со степенью замещения по сульфатным группам до 1.0.

Ближайший метод-аналог фосфорилирования целлюлозы описан авторами [Петропавловский Г.А., Котельникова Н.Е. Дегидратация и фосфорилирование целлюлозы оксидом фосфора (5) в среде диметилформамида // Cellulose chemistry and technology 1985. - N.19. P.591-600]. По этому методу хлопковую микрокристаллическую целлюлозу обрабатывают раствором оксида фосфора (V) в безводном ДМФА при 70°С. Получают не растворимый в воде фосфат целлюлозы с содержанием фосфора до 7% в виде преимущественно дву- и трехзамещенных фосфатных групп.

Принципиальным отличием предлагаемого метода от сходных методов сульфатирования целлюлозы в гомогенных условиях в среде N,N-диметилформамида является получение в результате этерификации сульфата целлюлозы, содержащего дополнительные (фосфатные) группы, а также обязательная добавка воды в процессе приготовления этерифицирующей смеси. Отличием предлагаемого метода от метода фосфорилирования раствором Р₂О₅ в ДМФА, кроме прочего, является получение водорастворимого продукта с низким содержанием двух- и трехзамещенных фосфатных групп. К достоинствам метода относится также возможность получения полифункционального производного целлюлозы в одну стадию.

Нами предлагается способ одностадийного получения СФЦ, состоящий в следующем. Посредством одностадийной этерификации порошковой или волокнистой целлюлозы раствором оксида фосфора (V) и хлорсульфоновой кислоты (в различных мольных соотношениях) в N,N-диметилформамиде с содержанием воды 2 моль на 1 моль Р₂О₅ при температуре 30-70°С и продолжительности реакции 1-3 ч.

Получение СЦ

Пример 1. Сульфат целлюлозы (СЦ)

Образец порошковой целлюлозы (1.00 г; 6.17 ммоль), высушенный до постоянной массы при 103°С, суспендировали в пиридине при 0°С. Охлаждая и интенсивно перемешивая реакционную смесь, в нее по каплям вносили хлорсульфоновую кислоту (1-4 моль в пересчете на моль ангидроглюкозных единиц). После термостатирования в течение 1 ч при 100°С реакцию продолжали в течение 1 ч при 90°С и затем 1 ч при 80°С. Продукт отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали 20 см³ ацетона и растворяли в 50 см³ 4%-ного NaOH. Образовавшуюся натриевую соль сульфата целлюлозы (СЦ-Na⁺) осаждали 100 см этанола, промывали водно-этанольной смесью от неорганических солей и сушили в вакууме [Du J., Zhang S., Sun R., Zhang L. Novel polyelectrolyte carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles for drug delivery. I. Physicochemical characterization of the carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles. // Biopolymers. - 2005. - V.78, N 1. P.1-8].

ИК спектр: 1240 см^-1 (полоса средней интенсивности, асимметричные колебания S=O); в области 810 см^-1 (интенсивная полоса поглощения, валентные колебания -C-SO₃ ^-); широкая полоса в области 3400 см^-1 (колебания связи -ОН). ЯМР ¹³С спектр: химические сдвиги 102.2, 73.71, 76.1, 79.6, 77.4 и 60.1 м.д. (C₁-С₆). Сигнал 66.4 м.д. (C-6S), для высокозамещенных образцов СЦ все -ОН группы при С₆ замещены. Химические сдвиги 81.5 и 77.1 м.д. указывают на сульфатирование по С₂ и С₃ атому соответственно.

Пример 2. Сульфат карбоксиметилцеллюлозы (СКМЦ)

Высушенный до постоянной массы образец КМЦ-Na (1.0 г) суспендировали в 10 см³ ДМФА. При интенсивном перемешивании и охлаждении до 5°С добавляли безводную n-толуолсульфоновую кислоту (1.0-2.0 моль в пересчете на моль карбоксильной группы полимера) и термостатировали 0.5 ч при 60°С. Затем колбу с сильно набухшим полимером охлаждали до 0°С, добавляли по каплям хлорсульфоновую кислоту (2.0 моль в пересчете на моль мономерного звена) и термостатировали от 3 до 5 ч. Для выделения полимера к охлажденной реакционной смеси прибавляли 20 см³ безводного ацетона. Осадок отфильтровывали, обрабатывали водным раствором гидроксида натрия. Из полученного раствора этанолом осаждали СКМЦ-Na⁺, полимер отделяли, промывали водно-этанольной смесью для очистки от неорганических солей и сушили в вакууме при 60°С.

ИК-спектр СКМЦ-Na⁺: 1626 см^-1 (υ_СОО ^-), 1240 см^-1 (υ_SO2), 814 см^-1 (υ_SO). ЯМР-¹³С спектр (в D₂O): химические сдвиги 61.6 (С₆), 75.3 (С₅), 79.8 (С₄), 76.1 (С₃), 74.7 (С₂), 102.8 (C₁), 179.3 (-СН₂-СООН), 71.8 (СН₂ при С₆), 72.8 и 68.1 (C-2S и C-6S).

Пример 3. Сульфат цианоэтилцэллюлозы (СЦЭЦ) и амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ)

Для сульфатирования цианэтилцеллюлозы (CЗ_CN=0.36) 1.0 г образца растворяли в 10 см³ ДМФА и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Колбу с сильно набухшим и частично растворившимся полимером охлаждали до 0°С, по каплям прибавляли хлорсульфоновую кислоту (2.0 моль в пересчете моль мономерного звена) и термостатировали при 20°С. По окончании реакции, охлаждая и перемешивая, реакционную смесь нейтрализовали насыщенным раствором ацетата натрия в этаноле. Осажденный полупродукт отделяли на фильтре, растворяли в 20 см³ раствора 3%-ного Н₂О₂ при рН=10. Гидролиз нитрильных групп проводили в течение суток при комнатной температуре, после чего полимер осаждали этанолом (100 см³), отделяли на стеклянном фильтре и очищали диализом на целлофановых мембранах. Полученную Na⁺-соль САЭЦ осаждали этанолом (150 см³), отделяли, промывали водно-этанольной смесью, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60°С.

ИК спектр САЭЦ-Na⁺ 1626 см^-1 (υ_CONH «амид 1»), 1240 см^-1 (υ_SO2), 814 см^-1 (υ_SO).

ЯМР ¹³С спектр (в D₂O): сигнал для С₆ отсутствует; 74.3 (С₃), 73.5 (С₂), 103.8-102.2 (С₁); δ178.5 (-C₂H₄-CONH₂); 36.9 и 37.5 (αСН₂ и βСН₂ при CONH₂), 83.8 и 68.6 (C-2S и С-6S). В области 70-73 м.д. может также находится сигнал C-3S.

Пример 4. Сульфат фосфата целлюлозы (СФЦ-Na⁺)

1.00 г коммерческой микрокристаллической целлюлозы или ПЦ, полученной кислотно-катализируемым гидролизом волокнистой целлюлозы, выделенной из хлопка или древесины, суспендировали в 10 см³ сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см³ ДМФА с содержанием 1.2% мас. воды растворяли 0.88 г Р₂О₅ при охлаждении. К полученной смеси по каплям прибавляли 1.43 г ClSO₃H, обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0-5°С. Раствор оставляли на 5-6 ч, после чего вносили к набухшей целлюлозе, реакционную массу перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50°С. По истечении этого строка, гомогенную реакционную смесь диспергировали в 250 см³ холодного ацетона. Осадок отфильтровывали, диспергировали в 100 см³ холодной воды и нейтрализовали 4%-ным NaOH по фенолфталеину. Полученный раствор диализовали на целлофановых мембранах против дистиллированной воды (до отрицательной реакции на сульфат-ионы); полимер осаждали этанолом и сушили в вакууме при 60°С.

Получали водорастворимый смешанный эфир целлюлозы с содержанием фосфора 6.0% и серы 9.0%, представляющий собой порошок белого цвета.

Пример 5.

К 1.00 г порошковой целлюлозы (полученной частичным кислотным гидролизом волокон беленой целлюлозы лиственных пород древесины) прибавляли 30 см³ сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см³ ДМФА с содержанием 1.2% мас. воды растворяли 0.88 г Р₂О₅ при охлаждении. К полученной смеси по каплям прибавляли 1.43 г ClSO₃H, обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0-5°С. Полученный раствор оставляли на 5-6 ч, после чего вносили к набухшей целлюлозе, реакционную массу перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50°С. Дальнейшую обработку вели, как в примере 1.

Получали водорастворимый смешанный эфир целлюлозы с содержанием фосфора 8,0% и серы 9.6%, представляющий собой порошок белого цвета.

ИК спектр СФЦ-Na⁺ 814 см^-1 (υ_SO), 1240 см^-1 (υ_SO2); в области 1250-1235 см^-1 также возможно поглощение фосфатных групп (υ_P=O для групп, включенных и не включенных в водородную связь). Полоса в области 1640 см^-1 может быть соотнесена с валентными колебаниями связи Р=О, -ОН, кроме того, в этой области поглощает сорбированная вода. ЯМР ¹³С спектр (в D₂O): сигналы для С6 и С2 отсутствуют; 74.7 (С3), 103.6-101.7 (С1); 83.4 и 67.8 (C2_S и C6_S). В области 81-83 м.д. может также находиться сигнал С3_P. Сигналы ядер углерода C1, C2, С3 дополнительно расщеплены на дуплеты в результате спин-спинового взаимодействия с фосфором (J_POC=4.0-6.0 Гц). ЯМР ³¹Р спектр СФЦ-Na⁺ (в D₂O,):δ 2,4.

Влияние модифицированных образцов целлюлозы СЦ, СКМЦ, САЭЦ и СФЦ (Табл. 1-4) на изменение времени свертывания плазмы крови человека исследовали в коагулологических тестах активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам" (влияние на активность фактора Ха) [Колмен Р.У. Нарушения реакций образования тромбина. М., Медицина, 1988, с.175-208]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIa, aIIa) и антифактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 5-го Международного стандарта нефракционированного гепарина (NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 6.

К смеси 0.06 см³ плазмы и 0.06 см³ аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли растворы модифицированной целлюлозы в конечных концентрациях 0.01-2.50 мкг/см³. Через 3 мин инкубации добавляли 0.05 мл 0.025 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов. В таблице 5 показаны специфические антитромбиновые активности исследованных образцов модифицированной целлюлозы.

Пример 7.

К смеси 0.025 см³ плазмы и 0.05 см³ раствора смеси фактора Ха (НПО "Ренам") и фосфолипидов добавляли растворы модифицированной целлюлозы в конечных концентрациях 0.0022-2.6700 мкг/ см³. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0.05 см³ 0.035 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов. В таблице 5 показаны специфические анти-Ха активности исследованных образцов модифицированной целлюлозы.

Образцы модифицированной целлюлозы демонстрировали антитромбиновую активность от 2.8 до 118.5 ЕД/мг. Активность против фактора Ха составила 0.14-32.9 ЕД/мг. Особенно перспективными антикоагулянтами являются образцы СЦ 4, СЦ 5, СЦ 6, которые показывали антитромбиновую активность более 70 ЕД/мг. Образцы СФЦ отличаются тем, что демонстрируют отношение активностей aXa/aIIa более 2. У используемых в настоящее время в клинической практике прямых антикоагулянтов - низкомолекулярных гепаринов - отношение активностей aXa/aIIa составляет 1.5-3.5 [Kishimoto T.K., Viswanathan К., Ganguly T., Elankumaran S., et al. Contaminated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system // N. Engl. J Med. - 2008. N.358. Vol.23. - P.2457-2467].

Контроль чистоты исходных веществ и анализ продуктов реакции осуществляли с использованием следующих методов: ИК спектры записывали на спектрометре "Prestige-21", в таблетках KBr. Спектры ЯМР ¹³С полученных веществ записывали на спектрометре "Bruker DRX-300" (300 МГц) в D₂O. Элементный анализ образцов (определение серы) в сульфатированных производных целлюлозы осуществляли на приборе ЕА-1110 фирмы «СЕ instruments».

Таблица 1
Условия и результаты сульфатирования ПЦ
Образец	Исходный препарат	Сульфатирующий агент	Растворитель	Мольное соотношениеа	Температура, °С	Время реакции, ч	CЗS
СЦ1	МКЦ	SO3/Pyr	Пиридин	3	50	3	0.24
СЦ2	МКЦ	SO3/Pyr	Пиридин	3	б	3	0.74
СЦ3	МКЦ	SO3/Pyr	Пиридин	3	в	3	1.28
СЦ4	ПЦ	SO3/Pyr	Пиридин	2	в	3	1.30
СЦ5	ПЦ	SO3/Pyr	Пиридин	3	в	3	1.63
СЦ6	ПЦ	SO3/Pyr	Пиридин	4	в	3	2.95
а - ангидроглюкозная единица: сульфатирующий агент, моль/моль; б - 1 ч 90°С, 2 ч 80°С; в - 1 ч 100°С, 1 ч 90°С, 1 ч 80°С

Таблица 2
Условия и результаты сульфатирования КМЦ
Образец	СЗСООН	Экв. ClSO3H на мономерное звено КМЦ	CЗS
СКМЦ 1	0.97	2	0.48
СКМЦ 2	0.97	2	1.01
СКМЦ 3	0.97	3	1.50
СКМЦ 4	1.53	2	0.60

Таблица 3
Условия и результаты сульфатирования цианэтилцеллюллозыа
Образец	CЗCN	Продолжительность реакции, мин	CЗS
САЭЦ-1	0.14	60	0.75
САЭЦ-2	0.14	120	0.83
САЭЦ-3	0.14	180	0.87
САЭЦ-4	0.36	60	0.79
САЭЦ-5	0.36	120	1.29
САЭЦ-5	0.36	180	1.37
а - 2 моль ClSO3H на ангидроглюкозную единицу
б - Определение методом ГПХ, средняя молекулярная масса основной фракции, элюент 0.15 M NaCl

Таблица 4
Результаты этерификации целлюлозы смесью Р2О5 - ClSO2OH - ДМФА-вода
Образец	Исходный материал	Соотношение ClSO3H:P2O5, моль/моль	Содержание S, %	Содержание Р, %	Выход Na-соли (% к массе целлюлозы)
СФЦ 1	МКЦ	2	9.0	6.0	152
СФЦ 2	ПЦ	2	9.6	8.0	140
СФЦ 3	ПЦ	2	10.0	7.5	н/о
СФЦ 4	МКЦ	3	11.1	7.0	142
СФЦ 5	ПЦ	3	12.6	8.8	164

Таблица 5
Специфические антикоагулянтные активности образцов модифицированной целлюлозы
Шифр образца	Анти-IIa, ЕД/мг	Анти-Ха, ЕД/мг	aXa/aIIa
СЦ 3	27.8±6.2	7.5±3.0	0.27
СЦ 4	118.5±6.9	23.3±2.1	0.20
СЦ 5	77.9±5.5	20.3±1.9	0.26
СЦ 6	86.5±5.2	32.9±3.7	0.38
СКМЦ 2	4.1±0.7	0.43±0.09	0.10
САЭЦ 4	6.0±1.8	0.14±0.07	0.02
САЭЦ 6	22.2±4.1	3.4±0.5	0.15
СФЦ 1	4.5±1.9	19.6±1.6	4.38
СФЦ 3	5.6±2.1	11.9±1.1	2.12
СФЦ 4	12.6±3.4	9.6±0.9	0.76
СФЦ 5	2.8±1.8	31±17	11.0

1. Сульфатированное производное целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования целлюлозного материала, отличающееся тем, что в качестве такового используются порошковые формы целлюлозы со степенью полимеризации от 250 и ниже, выделенные из растительного сырья, преобладающая молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру где заместитель Х - Н, -SO₃ ^-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

2. Сульфатированное производное целлюлозы - сульфат карбоксиметилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, отличающееся тем, что перед реакцией сульфатирования натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают моногидратом n-толуолсульфокислоты в безводном N,N-диметилформамиде в эквимолярном соотношении карбоксиметильная группа - n-толуолсульфокислота в безводном N-диметилформамиде, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру где заместитель Х - Н, -SO₃ ^-, СН₂СОО^-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

3. Сульфатированное производное целлюлозы - сульфат амидоэтилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, отличающееся тем, что перед реакцией сульфатирования проводят активацию цианоэтилцеллюлозы в растворе N,N-диметилформамида, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру где заместитель Х - Н, -SO₃, CH₂CH₂CONH₂, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

4. Сульфатированное производное целлюлозы - сульфат фосфата целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозного сырья, отличающееся тем, что реакционная смесь включает от 2 до 8 моль воды на моль целлюлозы, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру где заместитель Х - Н, -SO₃, PO(ONa)₂ либо RO-PO(ONa)₂, где R - целлюлоза, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.