Полифункциональный энтеросорбент

Полифункциональный энтеросорбент

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области использования природных сорбентов, в частности к новому энтеросорбенту на основе шунгитсодержащего природного минерального сырья, обладающего высокими сорбционными свойствами в отношении широкого спектра токсических веществ, а также проявляющего свойства антибактериального средства, и может быть использовано в ветеринарии для увеличения привесов, сохранности поголовья и резистентности сельскохозяйственных животных и птицы, а также для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц.

Известны энтеросорбенты на основе лигнина, например (RU 2234931, 2002.07.29), (RU 2084236, 1996.02.20). Они обладают рядом недостатков, заключающихся в наличие побочных эффектов применения лигнина и лигнинсодержащих продуктов.

Описан способ получения энтеросорбента на основе активированных углеродных волокон, обработанный связующим, в качестве которого используют крахмальный гель (RU 2027437, 1995.01.27). Недостатком данной разработки является использование частиц углеродных волокон, имеющих длину на уровне миллиметров, такие частицы имеют резко пониженную сорбционную емкость по сравнению с частицами, имеющими наноразмеры. Эффективность углерода как сорбента практически полностью исчезает, если эти углеродные частицы покрывать крахмалом. При попадании в желудочно-кишечный тракт крахмал растворяется, при этом одновременно десорбируется с крахмала большинство компонентов.

Известен углеродминеральный сорбент СУМС-1 (RU 2143946, 2001.01.10) для различного назначения, в том числе для медицины в качестве гемосорбента, энтеросорбента и др., одним из недостатков которого является содержание токсичных и канцерогенных веществ в углероде после сжигания.

Большое значение имеют сорбенты на основе кремнийсодержащего природного минерального сырья. Известен энтеросорбент-шивыртуин, изготовленный из кремнеземсодержащего сырья, содержащий суммарно 60-80% клиноптилолита и монтмориллонита, а также примеси кварца и биотита (RU 2122868, 10.12.1998). Энтеросорбент проявляет сорбционную активность в отношении микроорганизмов, ослабляет диффузию токсинов, стимулирует миграцию лейкоцитов в рану. Из выявленных недостатков существенны для хирургии поглощение витамина D, кроме того, шивыртуин способствует росту грибов рода Candida в просвете пищеварительного тракта, что нивелируется добавлением соответствующих препаратов (нистатин или леворин).

Имеется описание сорбента на основе кремнеземсодержащего минерального сырья, содержащего осадочную опал-кристобалитовую породу, содержащую не более 15 мас.% глинистых минералов группы монтмориллонита и не более 10 мас.% минералов группы слюд (RU 2319488, 20.03.2008). Заявителем патента установлено, что содержание глин группы монтмориллонита в энтеросорбенте не должно превышать 15 мас.%, так как минералы данной группы обладают высокой набухаемостью в жидкостях, и при их содержании выше 15% возникают трудности при энтеросорбции через зонд. Содержание минералов группы слюд должно быть ограничено 10 мас.%, так как при стандартной степени помола сырья (0,1-1 мм) края слюдяных пластинок оказываются достаточно острыми, что может вызвать различные проблемы в организме.

Наиболее близким к заявляемому изобретению и на этом основании выбранный в качестве прототипа является полифункциональный сорбент Полисорб ВП, используемый в ветеринарии, представляющий собой высокочистый (не менее 92% основного вещества) высокодисперсный кремнезем, который производится в Челябинской области [Справочник. Ветеринарные препараты в России. T.1 /Под ред. Кленова И.Ф. и др. // ООО «Сельхозиздат», Москва - 2004. - С.526-527]. Размер частиц не более 0,090 мм, удельная поверхность не менее 150 м²/г. В просвете желудочно-кишечного тракта Полисорб ВП связывает и выводит из организма эндогенные и экзогенные токсические вещества различной природы, включая микроорганизмы и микробные токсины, антигены, кормовые аллергены, соли тяжелых металлов, радионуклеотиды.

Целью данного изобретения является создание нового высокоэффективного полифункционального энтеросорбента, расширяющего ассортимент известных энтеросорбентов и обладающего высокими сорбционными свойствами в отношении широкого спектра токсических веществ, а также проявляющего антибактериальные и антиоксидантные свойства.

Технический результат изобретения - высокие сорбирующие возможности in vivo в отношении широкого спектра токсических веществ предложенного энтеросорбента, который также проявляет антибактериальные и антиоксидантные свойства.

Технический результат достигается применением заявленного энтеросорбента из природного шунгитсодержащего минерального сырья с содержанием углерода от 3,998% до 55,1% масс. и оксида кремния от 15,1% до 70% масс, со средним медианным размером частиц энтеросорбента 15,0*10^-6 м, в качестве добавки в рацион кормления сельскохозяйственных животных и птиц (цыплят-бройлеров, кур-несушек, свиней и крупно-рогатого скота) из расчета 0,1-1,0% масс. на вес корма.

Шунгитсодержащее минеральное сырье представляет собой докембрийские горные породы с силикатной минеральной основой, насыщенные углеродным (шунгитовым) веществом в некристаллическом состоянии, подразделяемые на малоуглеродистые шунгитсодержащие (до 5% углерода), среднеуглеродистые шунгитистые (5-25% углерода) и высокоуглеродистые шунгитовые (25-80% углерода) (Сидоренко С.А., Сидоренко А.В. Органическое вещество в осадочно-метаморфических породах докембрия. М., 1975).

Заявляемый энтеросорбент получают следующим образом.

Подготовленную руду шунгитосодежащего минерального сырья различного происхождения измельчают, фракцию размером не более 45,0*10^-6 м отделяют, нагревают при температуре от 100 до 200°С в течение 10-60 минут и охлаждают до температуры окружающей среды.

Готовый продукт представляет собой мелкодисперсный порошок со средним медианным размером 15,0*10^-6 м, физико-химические свойства которого приведены в таблице 1.

Измельчение минерального сырья до более мелкого состояния приводит к агломерации частиц и, как следствие, изменению структуры и свойств энтеросорбента. Более крупные частицы энтерособента, хотя и проявляют сорбционные свойства, но уступают заявляемым по степени эффективности.

Таблица 1
Физико-химические свойства заявленного энтеросорбента
Наименование показателя	Значение
Внешний вид	Порошок от темно-серого до черного цвета
Массовая доля углерода в свободном состоянии, % масс.	4,0-80,0
Массовая доля двуокиси кремния, % масс.	15,0-70,0
Содержание водорастворимых веществ, %	0.1-5
Насыпная плотность, кг/м3	500-800
Истинная плотность кг/м3	2500-2550
Потери при прокаливании, %	0.1-5
pH водной вытяжки	6-9
Адсорбция дибутилфталата*, см3/100 г согласно ГОСТ 7885-86	30-35
Адсорбция метиленового синего*, г/100 г согласно ГОСТ 4453-74	15
Массовая доля остатка на сите после мокрого просева No 0045, %, менее	0,08

Относится к 4 классу опасности по ГОСТ 12.1.001-76.

Введение энтеросорбента в рацион кормления сельскохозяйственных животных и птицы (цыплят-бройлеров, кур-несушек, свиней и крупного рогатого скота) из расчета 0,1-1,0% масс. на вес корма положительно влияет на физиологические показатели животных.

Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать заявленное изобретение.

Пример 1

Шунгитсодержащее минеральное сырье из Зажогинского месторождения в количестве 250 кг с содержанием углерода 25.3% масс. и оксида кремния 37.2% масс. размером менее 5*10^-3 м после предварительного удаления влаги и мусора измельчают в мельнице в течение одного часа. Продукт измельчения количественно из мельницы подается в воздушный классификатор струей осушенного воздуха на разделение, частицы более 45,0*10^-6 м в количестве 5 кг возвращаются в мельницу на доизмельчение. Образовавшуюся в количестве 245 кг в час мелкодисперсную фракцию размером не более 45,0*10^-6 м подают в термическую печь, обеспечивающую равномерный прогрев минерального сырья при температуре 200°С в течение 10 минут, после чего продукт охлаждается в теплообменном устройстве до температуры окружающей среды.

Пример 1А

Пример 1А проводят в условиях примера 1, но после классификатора отбирают и подают в термическую печь продукт измельчения, размеры частиц которого не более 100*10^-6 м.

Пример 1Б

Пример 1Б проводят в условиях примера 1, но после классификатора отбирают и подают в термическую печь продукт измельчения, размеры частиц которого не более 10*10^-6 м.

При термообработке происходит заметная агломерация частиц с образованием крупных кусков неправильной формы увеличенного размера.

Размеры агломерированных частиц менее 300*10^-6 м.

Пример 2

Пример 2 проводят в условиях примера 1, но используют шунгитсодержащее минеральное сырье из месторождения Текели-коксуйской зоны с содержанием углерода 3,998% масс., оксида кремния 69,93% масс. и термическую обработку отделенной фракции проводят в течение 60 минут при температуре 100°С.

Пример 2А

Пример 2А проводят в условиях примера 2, но после классификатора отбирают и подают в термическую печь продукт измельчения, размеры частиц которого не более 100*10^-6 м.

Пример 3

Пример 3 проводят в условиях примера 1, но используют шунгитсодержащее минеральное сырье Зажогинского месторождения с содержанием углерода 55.1% масс., оксида кремния 15.1% масс.

Пример 3А

Пример 3А проводят в условиях примера 3, но после классификатора отбирают и подают в термическую печь продукт измельчения, размеры частиц которого не более 100*10^-6 м.

Пример 4

Применение энтеросорбента для цыплят-бройлеров

Опыт проводят на цыплятах-бройлерах кросса «ИЗА» при клеточном методе содержания птицы. В суточном возрасте формируют контрольную и опытную группы.

Энтеросорбент, полученный по примеру 1, вводят в кормовую смесь опытной группы путем постепенного перемешивания в бункерах в количестве 0,1% от рациона или 1 г на 1 кг корма. Период кормления и выращивания цыплят-бройлеров составляет 42 дня.

Контрольной группе скармливают корм в том же объеме и того же состава, что и опытной, но без добавления к рациону композиционного энтеросорбента.

Для оценки состояния поголовья опытной и контрольной групп учитывают следующие показатели: весовые - взвешиванием молодняка и выведением среднего живого веса; ежедневный контроль сохранности; иммунобиохимические показатели крови цыплят при забое.

Результаты анализов показателей взвешивания приведены в таблице 2.

Таблица 2
Динамика клинико-физиологических показателей
Показатели	Группы цыплят
опытная	контрольная
Количество голов в группе	42000	42000
Живая масса цыплят, г
- на момент начала кормления (т.е. суточный возраст)	37,3±0,12	37,3±0,13
- через 7 дней	140±1,0	123±1,0
- через 14 дней	396±1,6	376±1,6
- через 28 дней	1150±2,4	998,5±2,2
- через 42 дня	2000	1700
Сохранность, %	99,2	97,3
Среднесуточный прирост, г	46,7	39,5
Затраты корма за период выращивания на 1 кг прироста, кг (конверсия)	1,58	1,70

Как видно из представленных данных, показатель живой массы цыплят в опытной группе больше по сравнению с контролем уже через неделю от начала кормления и продолжает оставаться большим на протяжении всего периода кормления. Увеличен показатель сохранности цыплят-бройлеров (99,2% по сравнению с контрольным 97,3%), а также показатель среднесуточного прироста (46,7 г для опытной группы, 39,5 г для контрольной). При этом уменьшены затраты корма за период выращивания на 1 кг прироста (конверсия) - 1,58 кг для опытной группы против 1,70 кг для контрольной.

Результаты анализов биохимического состава крови цыплят-бройлеров при забое приведены в таблице 3.

Таблица 3
Биохимический состав крови цыплят-бройлеров перед забоем
Показатели	Группы цыплят
С применением энтеросорбента	Без применения энтеросорбента
Биохимические показатели
Общий белок, г %	4,8±0,3	4,3±0,25
Резервная щелочность, об.%, СО	45,6±0,06	39,6±0,06
Кальций, мг %	17,9±0,8	16,6±0,9
Фосфор, мг %	4,9±0,5	4,2±0,4
Показатели естественной резистентности
Бактерицидная активность сыворотки крови, %	52,63±2,13	47,80±2,14
Лизоцимная активность сыворотки крови, %	18,71±0,56	16,90±1,15
Фагоцитарная активность, %	49,33±2,25	46,14±2,27
Иммуноглобулины, ед.	5,02±0,56	4,07±0,56

Данные таблицы 3 показывают, что разница биохимического состава крови и естественной резистентности контрольной и опытной группы доказывает, что заявленная кормовая добавка стимулирует естественную резистентность организма цыплят.

Таким образом, показано, что введение энтеросорбента из расчета 0,5 % на кг корма в качестве добавки к рациону цыплят-бройлеров оказывает ощутимый эффект для стимулирования энергии роста, увеличения сохранности и резистентности птицы.

Пример 5

Применение энтеросорбента для кур-несушек.

Опыт проводят при клеточном методе содержания птицы кросса «Hi-line». Формируют контрольную и опытную группы.

Энтеросорбент, полученный по примеру 2, вводят в кормовую смесь опытной группы путем постепенного перемешивания в бункерах в количестве 0,5% от рациона. Период наблюдения кур-несушек составляет 150 дней.

Контрольной группе скармливают корм в том же объеме и того же состава, что и опытной, но без добавления к рациону энтеросорбента.

Для оценки состояния поголовья опытной и контрольной групп учитывают следующие показатели: яйценоскости, сохранности и привеса кур-несушек, которые приведены в таблице 4.

Таблица 4
Показатели яйценоскости, сохранности и привеса кур-несушек при наблюдении в течение 150 дней
Показатели	Группа кур-несушек
опытная	контрольная
Количество голов	21000	21000
Яйценоскость, %, шт. яиц в день на количество дней
- через 10 дней -	0,79±0,07	0,78±0,07
- через 25 дней	0,85±0,09	0,80±0,09

- через 50 дней	0,92±0,05	0,82±0,05
- через 75 дней	0,95±0,04	0,85±0,04
Средний привес кур-несушек, г,
до кормления	1202	1185
после кормления (через 150 дней)	1305	1250
Сохранность за 150 дней, %	98,3	95,2

Как видно из представленных данных, показатель яйценоскости в опытной группе по сравнению с контролем увеличился уже через 10 дней добавления к рациону заявленного энтеросорбента (0,79 против 0,78), продолжал превышать контрольный на протяжении всего эксперимента и через 75 дней достиг разницы в 10%.

Увеличен показатель сохранности кур-несушек (98,3% по сравнению с контрольным 95,2%), а также показатель яйценоскости.

Пример 6

Применение энтеросорбента для свиней

Опыт проводят на свиньях породы крупная белая 100-110 дневного возраста. Энтеросорбент, полученный по примеру 3, вводят в кормовую смесь опытной группы путем постепенного перемешивания в бункерах в количестве 0,2% от рациона. Контрольной группе скармливают корм в том же объеме и того же состава, что и опытной, но без добавления к рациону энтеросорбента.

Показатели увеличения веса приведены в таблице 6.

Таблица 6
Показатели увеличения веса свиней
Показатели	Контрольная группа	Опытная группа
Количество животных в группе, голов	30	30
Средний вес до начала ввода, кг	31,3±0,6	32,5±0,2
Кратность ввода в сутки	3 раза	3 раза
Средний вес через 30 суток после применения, кг	44,2±0,3	47,6±0,28
Среднесуточный привес, кг	0,432	0,503

Как видно из представленных данных, в момент начала испытаний показатели среднего веса опытной и контрольной групп были практически одинаковыми, а через 30 дней применения энтеросорбента показатель среднего веса в опытной группе больше по сравнению с контролем на 3,4 кг (47,6±0,28 кг для опытной группы, 44,2±0,3 кг для контрольной), среднесуточный привес для опытной группы на 71 г больше, чем в контроле (0,503 и 0,432 кг соответственно).

Пример 7

Изучение эффективности энтеросорбента для лечения диареи телят

Опыт проводят на телятах в возрасте 3-12 дней.

Больных животных по принципу аналогов разделяют на 2 группы по 20 телят в каждой. Телятам опытной группы для лечения диареи применяют энтеросорбент, полученный по примеру 2, из расчета 1,0% масс. на вес корма, контрольной группе препарат не давали, только корм.

За животными как опытной, так и контрольной групп ведут ежедневное наблюдение, учитывая клиническое состояние, аппетит, сроки выздоровления. Выздоровевшими считают животных, у которых в течение 10 суток с начала лечения исчезли клинические признаки заболевания, и не наблюдались рецидивы. Результаты приведены в таблице 7.

Таблица 7
Показатель эффективности энтеросорбента для лечения диареи телят
Показатели	Без энтеросорбента	С энтеросорбентом
Количество животных в группе	20	20
Кратность введения в сутки (раз)	2	2
Срок применения (дней)	-	7
Срок выздоровления (дней)	-	3
Выздоровевших (гол.)	17	19
Лечебная эффективность, %	85%	95%

Установлено, что применение энтеросорбента в опытной группе вызвало улучшение общего состояния животных с последующим выздоровлением на 2-3 сутки лечения. Лечебная эффективность энтеросорбента составила 95% в сравнении с контрольной, где препарат не задавали.

Пример 8

Определение эффективности заявленного энтеросорбента в качестве сорбента микотоксинов из организма птицы

Опыт проводят в птицеводческом хозяйстве, в котором произошла вспышка микотоксикозов, - корма на момент проведения эксперимента уже содержали микотоксины, образовавшиеся при условиях неправильного хранения.

Исследования проводят на цыплятах-бройлерах кросса «ИЗА». В суточном возрасте формируют контрольную и опытную группы по 42000 голов каждая.

В рацион бройлеров опытной группы вводят с суточного возраста до забоя энтеросорбент, полученный по примеру 1, в количестве 0,1% на кг корма в качестве добавки к рациону. Энтеросорбент вводят в кормовую смесь в кормоцехах птицефабрик путем постепенного перемешивания в бункерах.

Для отслеживания динамики изменения содержания микотоксинов в тканях птицы (печени, желудка и его содержимого, а также фекалиях), при заселении и при забое, из контрольной и опытной групп отбирают пробы путем безвозвратного изъятия по 20 голов птиц из каждой группы. Определение содержания микотоксинов соответствуют нормативно-технической документации (для афлотоксина B1 - ГОСТ 30711-2001, для Т2-токсина - Методические указания по определению содержания Т-2 токсина в биологических тканях и экстрактах (Утверждены 27 декабря 1989 г.) (Антонов Б.И., Яковлева Т.Ф., Дерябина В.И. Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические. - М.: Агропромиздат, 1991, стр.146), для зеараленона Ф-2 - Методика определения микотоксина Ф-2 (зеараленона) в органах и тканях животных (Утверждена 31 мая 1987 г.) (Антонов Б.И., Яковлева Т.Ф., Дерябина В.И. Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические. - М.: Агропромиздат, 1991, стр.151), для охратоксина - Методика определения охратоксина А в органах и тканях животных (Утверждена 10 апреля 1984 г.) (Антонов Б.И., Яковлева Т.Ф., Дерябина В.И. Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические. - М.: Агропромиздат, 1991, стр.153).

Полученные усредненные (с 20 голов) результаты изменения содержания микотоксинов представлены в таблице 5.

Содержание различных микотоксинов в образцах, взятых у контрольной и опытной групп при заселении, было примерно одинаково, это можно объяснить тем, что птица обеих групп была взята из одного выводка; корма в начале опытов тоже были идентичны.

Данные таблицы 8 показывают, что содержание микотоксинов во внутренних органах контрольной группы цыплят достоверно выше по сравнению с опытной группой, получавшей энтеросорбент в качестве кормовой добавки. Увеличение же микотоксинов в содержимом желудка и фекалиях опытной группы наглядно показывает, что минеральное сырье связывает токсины в желудке и беспрепятственно выводит их из организма птиц. Приведенные результаты однозначно свидетельствуют о том, что введение энтеросорбента в корма цыплят-бройлеров оказывает ощутимый эффект в выведении микотоксинов из организма.

Пример 9

Определение эффективности заявленного энтеросорбента в качестве сорбента нитратов и нитритов из организма птицы

Опыт проводят на цыплятах-бройлерах кросса «ИЗА». В суточном возрасте по принципу пар-аналогов формируют контрольную и опытную группы (n=40).

Обе группы подвергают затравке нитратом натрия (NaNO₃) из расчета 50 мг NaNO₃ на кг корма трижды в течение периода жизни птицы.

Опытной группе, начиная с заселения, скармливают заявленный энтеросорбент, полученный по примеру 2, который добавляют в кормовую смесь методом ступенчатого перемешивания из расчета 0,5% на кг корма.

При забое (через 42 суток) отбирают пробы печени и мышечной ткани. Методы отбора проб и подготовка их к испытанию соответствуют нормативно технической документации (ГОСТ 9792-73), их проводят в соответствии с методиками, прошедшими государственную сертификацию ГОСТ 29300-92 (ИСО 3091-75) для нитрата, ГОСТ 29299-92 (ИСО 2918-75) для нитрита.

Полученные усредненные с 40 голов результаты для контрольной и опытной групп представлены в таблице 9.

Таблица 9
Содержание нитратов и нитритов в органах цыплят-бройлеров
№ п/п	Наименование пробы органа	Нитриты	Нитраты
Контрольная группа (усредненные результаты, полученные с 40 голов), мг/кг
1	Мышечные ткани	7±0,34	Не обнаружено
2	Печень	22,04±0,47	Не обнаружено
Опытная группа (усредненные результаты, полученные с 40 голов) мг/кг
1	Мышечные ткани	3,56±0,56***	Не обнаружено
2	Печень	5,32±0,17***	Не обнаружено
Примечание: Данные достоверны по сравнению с контрольной группой: * - P≤0,05, ** - Р≤0,01, *** - Р≤0,001

Данные таблицы 9 показывают, что содержание нитратов и нитритов в опытной группе достоверно меньше, чем в контрольной, введение энтеросорбента в рацион цыплят-бройлеров позволяет снизить содержание: в мышечной ткани: нитритов почти в 2 раза, в печени - в 4 раза, содержание нитратов в обеих группах обнаружено не было. Это объясняется тем, что в организме птиц нитраты нестабильны и быстро переходят в нитриты.

Пример 10

Определение эффективности заявленного энтеросорбента в качестве сорбента тяжелых металлов из организма птицы

Опыт проводят на цыплятах-бройлерах кросса «ИЗА». В суточном возрасте формируют контрольную и опытную группы по 20 голов каждая.

Обе группы подвергают одновременной затравке ацетатом свинца в дозе 30 мг на 1 кг корма и ацетатом кадмия в дозе 3 мг на 1 кг корма. Корма предварительно обрабатывают 10%-ными растворами ацетатов данных тяжелых металлов, приготовленными на дистиллированной воде. Таким образом, затравку производят каждый раз, как задают корма.

Опытная группа, начиная с заселения, получает энтеросорбент, полученный по примеру 2, из расчета 0,2% на кг корма в качестве добавки к рациону.

После забоя птицы (через 42 суток) отбирают пробы мышечной и костной тканей и определяют содержание свинца и кадмия. Методы отбора проб и подготовка их к испытанию соответствует нормативно-технической документации (ГОСТ 26929-94); их проводят согласно Методическим указаниям по атомно-абсорбционным методам определения токсических элементов в пищевых продуктах 01-19 (47-11-92). Анализ объектов исследования на содержание тяжелых металлов проводят методами, сертифицированными метрологической службой Госстандарта РФ: для свинца (ГОСТ 26932-86), для кадмия - (ГОСТ 26933-86). Исследования органов и тканей птицы на содержание тяжелых металлов проводят на атомно-абсорбционном спектрометре (ГОСТ 30178-96). Полученные результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10
Содержание тяжелых металлов в мышечной и костной тканях цыплят-бройлеров контрольной и опытной групп
Группа	Показатель
Белые мышцы	Красные мышцы	Костная ткань
Cd (мкг/г)	Pb (мкг/г)	Cd (мкг/г)	Pb (мкг/г)	Cd (мкг/г)	Pb(мкг/г)
контрольная	0,252±0,055	0,481±0,121	0,264±0,054	0,712±0,141	1,247±0,411	5,523±,954
опытная	0,004±0,06**	0,125±0,081**	0,006±0,040**	0,179±0,156**	0,087±0,043**	0,265±0,139
Примечание: Данные достоверны по сравнению с контрольной группой: * - Р≤0,05 ** - Р≤0,01 *** - Р≤0,001

Данные таблицы 10 показывают, что содержание кадмия и свинца в опытной группе достоверно меньше, чем в контрольной, введение в рацион цыплят-бройлеров предложенного энтеросорбента позволяет снизить содержание тяжелых металлов:

в белых мышцах: кадмия в 82,6 раз, свинца - 3,7 раз;

в красных мышцах: кадмия в 4 раза, свинца - 4,9 раз;

в костной ткани: кадмия в 16,6 раз, свинца - 20,4 раз.

Пример 11

Определение антиоксидантных свойств заявленного энтеросорбента

Антиоксидантные свойства заявленного энтеросорбента исследуют по его влиянию на процессы перекисного окисления липидов. О степени интенсивности процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по накоплению вторичных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [Гончаренко, М.С. Метод оценки перекисного окисления липидов / М.С.Гончаренко, A.M.Латинова // Лабораторное дело. - 1985. - №1. - с.60-61].

Опыты проводят на белых крысах. Перед постановкой опытов животных выдерживают на двухнедельном карантине. Подопытным утром однократно дают полнорационный корм из питомника Федерального государственного учреждения Федерального центра токсикологической и радиационной безопасности животных (г.Казань). Воду задают по мере убывания. Подопытные и контрольные группы животных формируют по принципу аналогов. В течение всего опыта животные находились в одинаковых условиях содержания и кормления.

Для экспериментальных исследований используют Т-2 токсин как один из широко распространенных и наиболее опасных микотоксинов. Для оценки эффективности заявленного энтеросорбента используют в качестве препарата сравнения энтеросорбент «Полисорб» производство «ПОЛИСОРБ», Россия.

Опыт провят на 50 самцах нелинейных белых крыс, животных делят на 5 групп по 10 штук:

1 группа - биологический контроль, в течение всего периода опыта получала «чистый» комбикорм, не содержащий микотоксинов;

2 группа - животные в течение всего периода опыта получали «чистый» комбикорм, не содержащий микотоксинов, смешанный с заявляемым энтеросорбентом в количестве 5 г/кг корма;

3 группа - животным задавали «токсичный» корм, контаминированный микотоксином Т-2 (1,0 мг/кг корма);

4 группа - животные получали «токсичный» корм, контаминированный микотоксином Т-2 (1,0 мг/кг корма), смешанный с энтеросорбентом «Полисорб» в количестве 5 г/кг корма;

5 группа - животные получали «токсичный» корм, контаминированный микотоксином Т-2 (1,0 мг/кг корма), смешанный с заявляемым энтеросорбентом, полученным по примеру 2, в количестве 5 г/кг корма.

Заявляемый сорбент был взят в максимальной дозе (5 кг/т корма, согласно инструкции по применению). Для того, чтобы была доза введения одинаковой, в таком же количестве был взят сравниваемый сорбент «Полисорб».

Длительность эксперимента - 10 суток.

Потребление крысами корма и воды во всех группах не различались. Выживаемость во всех группах составила 100%.

На десятые сутки отбирают кровь для исследований путем декапитации у десяти крыс из каждой группы. О степени интенсивности процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по накоплению вторичных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Для исследования отбирают 1,5 мл крови с гепарином. Центрифугированием (5 мин, 3000 об/мин) отделяют плазму от форменных элементов крови. Далее проводят анализ на содержание ТБК-активных продуктов отдельно в плазме и в эритроцитах. Для этого эритроцитарную массу отмывают дважды 10 мл изотонического раствора. После отмывки эритроциты осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Отмытые эритроциты гемолизируют в дистиллированной воде в соотношении 1:5. Для исследований отбирают 0,3 мл плазмы и 0,3 мл гемолизата, к которым добавляют по 2,4 мл H₂SO₄ и 0,3 мл 10% фосфорно-вольфрамовой кислоты, тщательно перемешивают. Через 10 минут образовавшийся осадок отделяют центрифугированием про 3000 об/мин. Супернатант отбрасывают, а полученный осадок промывают дважды 1 мл воды, растворяют в 3 мл воды, добавляют 1 мл свежеприготовленного водного раствора тиобарбитуровой кислоты в уксусной кислоте (80 мг тиобарбитуровой кислоты растворяют при нагревании в 5 мл H₂O и 5 мл ледяной уксусной кислоты). Цветную реакцию проводят в закрытых химических пробирках при 96°С. Реакцию прекращают через 60 мин, охлаждая пробы в холодной воде. Для удаления мутности перед спектрофотометрированием пробы центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин. Оптическую плотность измеряют на спектрометре СФ-26 при длине волны 532 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В качестве контроля используют дистиллированную воду. Расчет количества малонового диальдегида (МДА) проводят с учетом разведения по формуле С=Е/έ, где Е - оптическая плотность пробы, έ - молярный коэффициент инстинкции, равный 1,56×10^-5 моль^-1/см^-1, С - концентрация МДА, выраженная в мкмолях на 1 мл плазмы и на 1 мл эритроцитарной массы. Значения МДА в плазме и эритроцитах суммируют.

Результаты исследований представлены в таблице 11.

Таблица 11
Содержание малонового диальдегида (×10-5 моль-1 см-1) в крови крыс групп 1-5 через 10 суток
Группы	Показатель
1	0,784
2	0,724
3	0,971
4	0,892
5	0,823

Регистрируют закономерное увеличение содержания малонового диальдегида (МДА) в крови крыс 3-5 групп, получавших «токсический» корм, по сравнению с группами 1 и 2 контроля.

Так, в группе 3 на 10 сутки увеличение содержания МДА по сравнению с контрольной (1) группой составило 23,8%, в группе 4 - на 13,8%, в группе 5 - на 5,0%. В то же время во второй группе наблюдали снижение содержания МДА на 7,65%. Это свидетельствует о более выраженном неспецифическом антиоксидантном действии энтеросорбента в сравнении с Полисорбом.

Содержание малонового диальдегида в крови крыс 4 и 5 групп довольно близки, хотя в 5 группе это значение несколько ниже (0,823×10^-5 моль^-1 см^-1 против 0,892×10^-5 моль^-1 см^-1 для группы, получавшей «Полисорб»), это означает, что заявляемый энтеросорбент более активно связывал перекисные продукты метаболизма, чем «Полисорб».

При изучении адсорбционных свойств заявленного энтеросорбента по отношению к различным видам микроорганизмов (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringes) было установлено, что происходила их значительная адсорбция 63,2-91,8%, что не уступает, а иногда и значительно превосходит адсорбционные свойства прототипа.

Пример 12

Адсорбционное действие заявленного энтеросорбента в отношении микроорганизмов показано на примере культуры Escherichia coli.

За 1 сутки до начала опыта на скошенный мясопептонный агар (МПА) проводят посев культуры Escherichia coli. Посевы помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°С. По истечении 24 часов проводят смывы культур стерильной дистиллированной водой, фильтруют через стерильный фильтр и готовят рабочую суспензию микробов, стандартизируя по стандарту оптической плотности в 2 ед. Параллельно готовят рабочую взвесь с заявляемым энтеросорбентом, полученным по примеру 1. Для этого в стерильную пробирку наливают стерильный изотонический раствор 4,5 мл и добавляют 0,5 мл рабочей суспензии культуры и 25 мг стерильного энтеросорбента (количество используемого для опыта энтеросорбента обусловлено максимально рекомендуемой дозой энтеросорбента - 5 г/кг корма; для сохранения указанного соотношения расчет составлял - 5 г/л стерильного изотонического раствора). Рабочую взвесь с заявляемым энтеросорбентом помещают в аппарат для встряхивания проб на 1,5 часа. Далее проводят серийные разведения этой смеси 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, из которых проводят посевы на МПА в чашки Петри (по три посева на каждое разведение) из пробирки методом «газона» по 0,1 мл получившихся разведений. Чашки помещали в термостат на 24 часа при температуре 37°С.

Параллельно ставят контроли, т.е. выполняют те же действия для:

- пробирки с рабочей суспензией микробов без заявляемого энтеросорбента (основной контроль, по сравнению с которым проводят подсчет адсорбции);

- пробирки с изотоническим раствором и заявляемым энтеросорбентом без микробов (контроль на стерильность, чтобы убедиться в достоверности результатов, что с водой или с заявляемым энтеросорбентом не были внесены другие микробы);

- пробирки с 4,5 мл изотонического раствора, 0,5 мл рабочей суспензии культуры и 25 мг стерильного энтеросорбента-прототипа.

По истечении 24 часов визуально проводят подсчет количества выросших колоний в трех чашках, для подсчета КОЕ брали результаты наибольшего разведения с наименьшим количеством выросших колоний, и выводят средний результат - эту цифру затем умножали на степень разведения, полученную цифру сравнивали с контрольными посевами и разницу цифр считали как адсорбцию и пересчитывали в проценты. Исследования проводили 3-х кратно со стат. обработкой.

По истечению 24 часов визуально проводят подсчет количества выросших колоний в трех чашках, для подсчета KOE брали результаты наибольшего разведения с наименьшим количеством выросших колоний (1:10000), выводят средний результат, который умножают на степень разведения (10⁵), и полученную цифру сравнивают с контрольными посевами.

Разницу считают как адсорбцию и пересчитывают в проценты. Исследования проводят трехкратно с использованием статистической обработки.

Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12
Адсорбционное действие заявленного энтеросорбента в отношении культуры Escherichia coli, KOE/мл (×105)
	KOE/мл	Показатель адсорбционной активности, %
Контроль	50
Полисорб (прототип)	17	66
Изобретение	15	70

По данным таблицы 12 видно, что адсорбция в отношении Escherichia coli заявленным энтеросорбентом составила 70%, а Полисорбом - 66%, т.е. заявленный энтеросорбент проявляет лучшие адсорбционные свойства в отношении патогенного штамма Escherichia coli по сравнению с прототипом.

Пример 13

Испытания энтеросорбентов проводят с применением продуктов, полученных по примерам 1А, 1Б, 2А, 3А, 4А, аналогично описанию, приведенному в примере 12.

Результаты испытаний приведены в таблице 13.

Таблица 13
Адсорбционное действие заявленного энтеросорбента в отношении культуры Escherichia coli, KOE/мл (×105)
	KOE/мл	Показатель адсорбционной активности, %
Контроль	50
Полисорб (прототип)	17	66
Пример 1	15	70
Пример 1А	21	58
Пример 1Б	19	62
Пример 2А	19	62
Пример 3А