Средство для защиты животных от летающих кровососущих насекомых

Средство для защиты животных от летающих кровососущих насекомых

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к защите животных от летающих кровососущих насекомых.

С наступлением весны и приходом тепла активизируются насекомые и клещи, паразитирующие как на домашних, так и на сельскохозяйственных животных. Опасность заражения длится весь весенне-осенний период.

Новая разработка репеллентного средства предназначена для профилактической обработки и защиты крупного рогатого скота, лошадей, оленей и других животных от кровососущих двукрылых насекомых в период их массового лета.

Известно средство защиты от укусов летающих кровососущих насекомых, содержащее диметилфталат, смесь алифатических C₅-C₉ эфиров N,N-диэтилоксаминовой кислоты (оксамат), фракцию головная масла эвгенольного базилика (голбазил), аммиак водный 25%-ный, глицерин, стеариновая кислота, сплавленная смесь высших жирных спиртов C₁₆-C₂₁ и натриевых солей сульфоэфиров этих же спиртов (эмульгатор №1), триэтаноламин и воду (см. SU 1544431 А1, 22.09.1987).

Недостатком данного изобретения является то, что данное средство относится к медицине и имеет сложный состав.

Известен средство для борьбы с эктопаразитами сельскохозяйственных животных, содержащее в качестве акарицида многокомпонентный раствор (см. RU 2072843 С1, 10.02.1997).

Недостатком данного изобретения является то, что данное средство в качестве активнодействующего вещества содержит не менее четырех компонентов.

Наиболее близким является средство для защиты от летающих кровососущих насекомых, содержащее диметилфталат, оксамат, этиловый спирт, 1,4-бутандиол, водно-спиртоглицериновый экстракт чистотела, терпинеол, изопропиловый спирт в определенных количественных соотношениях (см. SU 1711368 A1, 29.04.1989).

Недостатком данного изобретения является то, что данным средством обрабатывают хлопчатобумажные костюмы (бязь, ситец). Кроме того, изобретение также относится к медицине и не применяется в ветеринарии.

Задачей изобретения является разработка удобного в использовании и недорого средства, защищающего животных от летающих кровососущих насекомых в течение продолжительного времени.

Поставленная задача в части средства для защиты животных от летающих кровососущих насекомых, содержащего диметилфталат, решается тем, что, согласно изобретению, средство дополнительно содержит бутиловый или изопропиловый спирт и масло индустриальное при следующем соотношении ингредиентов (мас.%): диметилфталат - 18,0-22,0, бутиловый или изопропиловый спирт - 40,5-49,5, масло индустриальное - остальное.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение недорого средства со сниженным содержанием диметилфталата и с высокой и пролонгированной репеллентной активностью в отношении комаров, мошек, мокрецов и слепней.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами выполнения, которые, однако, не ограничивают объем притязаний заявителя.

Пример 1

Средство изготавливают по технологической схеме поэтапно:

- Подготовка оборудования, помещения, инвентаря, спецодежды.

- Растаривание сырья.

- Отвешивание сырья.

Загрузка сырья в реактор. В реактор загружают диметилфталат - 20,0 кг, бутиловый или изопропиловый спирт - 45,0 кг, масло индустриальное - 35,0 кг.

- Приготовление раствора.

- Розлив или наполнение флаконов.

- Укупорка флаконов с готовой продукцией.

- Карантинное хранение до получения положительного заключения отдела технического контроля.

- Этикетирование и/или упаковка в индивидуальную упаковку.

- Формирование групповой упаковки и этикетирование.

- Хранение на складе готовой продукции.

Примеры терапевтической эффективности препарата

Пример 2

Обработку 140 голов телят 8-14 месячного возраста проводили в период активного лета насекомых на открытом воздухе в ВСО ОПХ «МИЛЕТ».

Перед применением препарата содержимое флакона встряхнули, с емкости сняли крышку и на ее место с помощью резьбового соединения закрепили распылительную головку. На флакон надавливали рукой до появления из форсунки струи средства, нажимая на рукоятку насоса, и провели обработку животных с расстояния 20-30 см, направляя факел аэрозоля на поверхности кожно-волосяного покрова животных.

Прикрыв глаза животному, обработали все части тела, особенно область головы, спины и конечностей. Кормушки, поилки и другое оборудование перед обработкой накрывали полиэтиленовой пленкой.

Расход препарата на одну голову составил 50 мл.

После обработки было установлено, что репеллентное действие препарата против слепней и комаров продолжалось в течение 30 часов. Отрицательных последствий от препарата у животных не наблюдали.

Пример 3

Препарат применяли на дойном стаде ЗАСХО «СЕРП и МОЛОТ». Обработку проводили на открытом воздухе 01.06.2009 г.в период открытого лета насекомых.

Перед обработкой препаратом визуально определяли численность насекомых, севших на животных в течение 5 минут.

При помощи беспропеллентного баллона с распылительной головкой препарат распыляли однократно, после утренней дойки, на чистый сухой кожно-волосяной покров до легкого увлажнения, избегая попадания на слизистые оболочки рта, носа и глаз, также на вымя. В результате подсчета насекомых находили в единичных экземплярах, как правило, не способных к полету.

В результате обработки животных препаратом эффективность репеллентного действия препарата составила 95-98%.

Благодаря подобранному соотношению компонентов препарат хорошо держится на коже животных и в течение длительного времени защищает их от кровососущих летающих насекомых.

Пример 4

Изучение острой токсичности препарата. Для определения острой токсичности при введении в желудок были испытаны дозы - 4,0; 7,0; 9,0; 11,0 и 14,0 г/кг. Препарат вводили в чистом виде белым крысам. В течение 2-х недель за животными велось наблюдение. Учитывали гибель животных и клиническую картину интоксикации.

ЛД₅₀ средства составляет 10,2±1,0 г/кг массы тела и свидетельствует о том, что препарат, согласно классификации (ГОСТ 12.1.007-76) - малотоксичное соединение (4 класс).

Симптомы отравления появлялись через 3-5 минут после введения препарата, начиная с минимально введенных доз (4 и 7 г/кг). Клиника острого отравления животных характеризовалась выраженным угнетением, вялостью животных, понижением подвижности. У животных наблюдались нарушение дыхания, цианоз кожных покровов, нарушение координации движения, отказ от пищи на протяжении 1-2 суток. Смерть наступала на фоне развившейся комы. У выживших животных явления токсикоза постепенно исчезали, но шерсть оставалась неопрятной.

При проведении патологоанатомического вскрытия у погибших животных, были отмечены - резко выраженное полнокровие внутренних органов и головного мозга, умеренная гиперемия слизистой желудка, резкое кровенаполнение сосудов брыжейки и кишечника, умеренные явления белковой дистрофии в печени и почках.

Для характеристики степени развития острого смертельного отравления помимо величины ЛД₅₀, указывающей на степень токсичности, использовались некоторые показатели, характеризующие опасность препарата в условиях введения в желудок. Одними из таких являются: - величина К=ЛД84/ЛД16, характеризующая вариабильность смертельных доз в виде отношения вероятностных величин и величина S - функция угла наклона прямой смертельных доз к оси абсцисс

В результате полученные величины составили 1,57 и 1,47, соответственно, и свидетельствуют о незначительной опасности развития острого отравления препаратом в условиях однократного введения в желудок.

Для суждения о скорости развития интоксикации определяли время гибели 50% животных (ЕТ₅О), что особенно важно для веществ остронаправленного типа действия, характеризующихся гибелью животных в течение первых суток. При этом также использовались результаты опыта по однократному введению в желудок.

Определение ЕТ₅₀ является простым и довольно объективным способом оценки кумулятивных свойств препарата по результатам однократного эксперимента (Егорова Н.А., 1984). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Определение среднего времени гибели крыс в остром опыте при введении средства в желудок.
Дозы(г/кг/	Время гибели в сутках	Среднее время гибели от каждой из введенных доз
1	2	3	4	5
4,0	-	-	-	-	-	0
7,0	-	1	-	-	-	2:1=2,0
9,0	-	1	1	-	-	(2+3):2=2,5
11,0	-	2	1	-	-	(4+3):3=2,3
14,0		2	2	2		(4+6+8):6=3,0

После обработки полученных данных ЕТ₅0 для препарата составило 2,5 суток (60 часов), что свидетельствует о том, что препарат обладает остронаправленным типом действия и является слабокумулятивным соединением.

Для подтверждения данного факта проводился подострый эксперимент.

Пример 5

Изучение кумулятивных свойств препарата в подостром эксперименте

Использовался метод Lim et all (1961). Препарат вводили в желудок белых крыс первые 4 дня в дозе, составляющей 1/10 от ЛД₅₀ (1,0 г/кг). Через каждые 4 дня эту дозу увеличивали в 1,5 раза. Длительность эксперимента -28 дней. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Данные к определению К сит в условиях повторного введения препарата в желудок белых крыс
Суммарная доза, г/кг	Гибель животных	Дни гибели
Количество	%
19,0	0/10	0	12
22,4	2/10	20	13
32,5	4/10	40	16
52,7	6/10	60	20
83,1	10/10	100	24

Как следует из таблицы, гибель животных начиналась на 13 день эксперимента, при введении суммарной дозы 22,4 г/кг. Расчет ЛД₅₀ по результатам данного опыта проводился аналогично обработке данных однократного опыта.

В результате данный коэффициент составил - 4,5. Согласно классификации Ю.С.Кагана (1983), препарат относится к 3 классу опасности по способности накапливаться в организме, т.е препарат умеренно кумулятивен.

Для выявления функциональной кумуляции животные обследовались через каждые 4 дня на протяжении 16 дней (пока количество опытных животных было достаточным для проведения статистической обработки):определялась масса животных, регистрировался суммационно-пороговый показатель (СПП), анализировалась кровь (лейкоциты, эритроциты и гемоглобин), измерялась ректальная температура и оценивалась статическая и динамическая работа. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3
Масса тела и суммационно-пороговый показатель (СПП) крыс в условиях подострого воздействия препарата
Показатели	Группы	4 день (п=10)	8 день (п=10)	12 день (п=8)	16 день (п=6)
Масса тела (в г)	Контр.	210±2,5	220±2,1	228±2,5	242±2,5
Опыт	215±2,8	218±2,0	221±3,2	228±2,9, Р<0,05
СПП (усл. ед.).	Контр.	3,3±0,9	3,5±0,7	3,8±0,5	3,5±0,3
Опыт	3,5±0,8	3,6±0,6	3,5±0,5	4,8±0,5, Р<0,05

Как следует из таблицы, на 16 день при введении суммарной дозы 32,5 г/кг, у крыс наблюдается достоверное (Р<0,05) снижение массы тела и достоверное повышение суммационно-порогового показателя и, как следствие, некоторая заторможенность и малоподвижность животных.

Результаты измерения ректальной температуры, анализа гематологических показателей и некоторых поведенческих реакций животных представлены на таблице 4.

Таблица 4
Некоторые функциональные показатели крыс в подостром эксперименте
Показатели	Группы	4 день	8 день	12 день	16 день
Гемоглобин, г/л	Контр.	129,5±2,8	123,1±2,1	138,9±3,1	132,4±3,0
Опыт	138,0±2,5	120,9±3,0	131,5±2,8	129,0±3,8
Лейкоциты, ×109/л	Контр.	12,8±0,8	11,9±1,3	11,3±0,8	12,9±0,9
Опыт	11,9±0,7	12,1±0,9	11,9±1,5	10,3±0,7, Р<0,05
Эритроциты, ×1012/л	Контр.	6,1±0,20	5,9±0,25	6,3±0,25	5,9±0,3
Опыт	б,5±0,45	5,7±0,35	6,1±0,25	5,0±0,9
Ректальная гемпература, °С	Контр.	38,1±0,21	37,8±0,25	37,9±0,21	36,8±0,5
Опыт	38,5±0,30	38,2±0,25	37,5±0,20	36,9±0,5
«Тест вставания», за 3 мин)	Контр.	9,1±1,3	9,3±i,55	10,3±1,70	10,0±2,3
Опыт	8,5±1,5	8,1±1,49	9,8±1,85	7,5±1,6, Р<0,05
«Горизонтальный стержень» (сек)	Контр.	31,5±2,6	32,3±2,9.	32,5±2,5	31,5±2,6
Опыт	33,5±2,0	30,4±2,1	27,3±2,5, Р<0,05	26,5±2,0, Р<0,05

Как следует из представленных данных, на 12 день, при получении животными суммарной дозы 19,0 г/кг, наблюдалось только достоверное снижение мышечной силы животных в тесте «горизонтальный стержень». На 16 день, когда суммарная доза препарата достигла 32,5 г/кг, количество достоверно изменившихся показателей увеличилось до 3-х:

- отмечено снижение лейкоцитов и снижение обоих показателей, характеризующих поведенческую реакцию животных.

Учитывая, что в процессе данного опыта достоверно изменялось незначительное число показателей, а главное, что эти изменения наблюдались на уровне доз, превосходящих в несколько раз реальные, и в 1,5-3 раза однократную ЛД₅₀, следует считать, что по степени функциональной кумуляции препарат также можно отнести к 3-ему классу умеренно-опасных препаратов.

Пример 6

Изучение кожно-резорбтивного, раздражающего и аллергенного действия препарата

Токсичность препарата при контакте с кожей определялась на белых крысах путем однократного нанесения средства на кожу в область спины, в количестве 6,0 г/кг, 12 г/кг и 15 г/кг массы тела с экспозицией 4 часа. Ввиду большого объема средство наносилось дробно, с интервалом 15-30 минут.

Среднелетальную дозу (DL₅₀cut) установить не удалось, так как гибель была отмечена только в дозе 15 г/кг (16,6%). Поэтому кожно-оральный коэффициент определить не представляется возможным. Клиническая картина подопытных животных имела место только в группе животных, которым препарат наносился в большей из доз, и характеризовалась незначительной заторможенностью и малоподвижностью, что приводило к повышению суммационно-порогового показателя (опыт - 5,1 усл. ед.; контроль - 4,2 усл. ед.). Нормализация наступала уже на следующий день и опытные животные не отличались от контрольных.

Местное и кожно-резорбтивное действие препарата изучалось на 20 белых мышах (10 в контроле, 10 в опыте). Хвосты опытных мышей погружали в чистый продукт. Время экспозиции - 2 часа, ежедневно, на протяжении 2-х недель.

Как показали исследования, незначительное проявление симптомов клинической интоксикации мышей имели место лишь в конце эксперимента (12-14 день), когда наблюдалась некоторая вялость и заторможенность животных. Однако восстановление наступало уже на следующие сутки и опытные мыши практически не отличались от контрольных животных. При осмотре хвостов наблюдалась незначительная сухость кожи только в конце опыта, после 10-12 аппликаций.

Для объективной оценки кожно-резорбтивного действия препарата было проведено обследование мышей по некоторым показателям. После взвешивания у животных был определен суммационно-пороговый показатель и взята кровь для определения гемоглобина, лейкоцитов и эритроцитов. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 5
Масса тела и СПП у мышей после окончания опыта по нанесению препарата на кожу хвостов
Группы	Масса, г	СПП, усл. ед.	Гемоглобин, г/%	лейкоциты, тыс/мкл	эритроциты, млн/мкл
до возд.	после возд.
Опыт	21,5±0,5	22,9±0,4	4,5±0,18, Р<0,05	119,4±1,5	9,158±0.8	5,633±0,7
Контр.	21,9±0,4	23,2±0,5	3,8±0,18	126,5±0,9	9,230±0.9	5,981±0,6

Как следует из таблицы, у животных опытной группы в конце эксперимента отмечалось достоверное повышение СПП; намечалось также некоторое снижение гемоглобина, однако, статистическая обработка не выявила достоверности данного показателя по сравнению с контролем. Через 5 дней после окончания эксперимента проведено повторное определение СПП. Результаты показали восстановление показателя до уровня контрольных величин (опыт - 3,8±0,18 усл. ед.; контроль - 3,5±0,18 усл. ед.)

Таким образом, в результате полученных данных можно сделать вывод о способности данного средства проникать через кожу в условиях ежедневного, многократного его контакта с кожей. Однако, учитывая быстрое восстановление изменившихся в процессе опыта показателей, можно считать, что это свойство незначительно. Кроме того, многократное нанесение препарата не предусмотрено разработчиками в условиях практического применения, в связи с чем полученный эффект не обладает критерием вредности.

Пример 7

Изучение аллергенного действия препарата

Первоначально (1 серия опыта), для выявления контактного дерматита, а также с целью получения оптимально недействующей дозы, (т.е. "рабочей дозы") были испытаны 3 концентрации препарата (в %%) - 100 (20% д.в)., 50 (10% д.в) и 25 (5% д.в.). Препарат наносился на выстриженные участки кожи кроликов, размером 3×3 на протяжении 2-х недель.

В результате, наибольшая из концентраций (100%) в конце эксперимента вызывала незначительное шелушение кожи и некоторое утолщение кожной складки. Оценка проводилась в баллах, согласно классификации С.В.Суворова. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6
Оценка выраженности местно-раздражающих свойств препарата
Концентрация препарата	Толщина кожной складки, мм	Выраженность раздраж. эффекта	Класс опасности
100%	2,4	Слабое	4
50%	2,2	Отсутствие	-
25%	2,2	Отсутствие	-
Контроль	2,1	Отсутствие	-

Как следует из таблицы, разница между средними величинами толщины кожной складки контрольных и опытных участков кожи при действии 100% препарата составила 0,3 (1 балл), т.е. слабый раздражающий эффект. Оценка эритемы по линейке С. В.Суворова также показала слабую интенсивность - розовый тон.

Для сенсибилизации была выбрана 50% концентрация препарата (10% по д.в.). Исследование аллергического действия проводили путем 20-ти повторных накожных аппликаций на участок боковой поверхности туловища, размером 4×4 см, по 5 раз в неделю. Первое тестирование проводили через 10 аппликаций. При этом выстригали участок кожи на противоположном боку кролика и наносили продукт. Реакцию кожи анализировали через 24, 48 и 72 часа.

Результаты показали отсутствие каких-либо признаков сенсибилизации кроликов к препарату. У животных не отмечено покраснения кожи, расчесов, отека, утолщения кожной складки, изменений цвета кожи. Не наблюдалось также каких-либо проявлений беспокойства в поведении опытных животных в сравнении с контролем. Опыт продолжили и довели число аппликаций до 20, после чего проводили повторное тестирование, которое дало аналогичные результаты.

Таким образом, был сделан окончательный вывод о том, что препарат в данных условиях и на данном виде животных не обладает аллергическим действием на кожу.

Для количественной оценки сенсибилизации использовался тест для выявления реакции клеток крови опытных и контрольных животных на аллерген in vitro - реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ), а также подсчет количества эозинофилов и базофилов.

Результаты представлены на таблице 7.

Таблица 7
Результаты оценки сенсибилизирующего действия препарата
Группы	РСЛЛ, в %	Количество эозинофилов, %	Количество базофилов, %
Контроль	7,0±0,7	4,0±0,6	0,055±0,002
Опыт	7,3±0,5	4,2±0,5	0,065±0,002

Как следует из данной таблицы, количественная диагностика также показала, что препарат не является аллергеном.

Пример 8

Изучение раздражающего действия препарата на слизистые оболочки глаз кроликов

Препарат в нативном виде вводился однократно в конъюнктивальный мешок правого глаза кроликов в количестве 3-х капель. Левый глаз кроликов служил контролем, куда вносили в том же количестве дистиллированную воду. Учет реакции проводили сразу после введения, а также через 4, 24, 48, 72 и 96 часов. При оценке раздражающего действия препарата учитывали состояние слизистой оболочки глаза, век и роговицы.

В результате сразу после введения препарата кролики вели себя спокойно, практически не прикрывая глаз. Через 24 часа наблюдалась незначительная гиперемия слизистой. Раздражающий эффект сохранялся на протяжении 3-4 дней, а затем начал ослабевать. Результаты бальной оценки раздражающего действия препарата представлены в таблице 8.

Таблица 8
Оценка интенсивности местно-раздражающего действия средства на глаза
Детали глаза кроликов	Результаты	Оценка (баллы)
Веко и конъюнктива	Сосуды расширены незначительно	1
Отек век	Отек отсутствует	0
Выделения из глаз	Количество выделений с увлажнением век и шерсти, прилегающей к векам, умеренное.	2
Состояние роговицы	Помутнение роговицы умеренное, но детали радужной оболочки видны	2

Как следует из таблицы, суммарный балл выраженности раздражающего эффекта препарата на глаза кроликов составляет «5». По шкале оценки данный эффект можно классифицировать как «умеренный» (3 класс).

Пример 9

Изучение биологического действия препарата при нанесении на кожу крыс в хроническом эксперименте

Согласно Инструкции по применению, данное средство наносится на шерсть животных 1 раз в сутки, 1-2 раза в неделю в период активного лета насекомых в дозах, которые зависят от площади кожной поверхности. Расход препарата на одну голову составляет 100 г на 3-5 м².

В пересчете на крысу рекомендуемая доза составила - 1,0 г на голову (3,0 г/кг массы), (1-я опытная группа); 2-я опытная группа крыс обрабатывалась препаратом в дозе в 2 раза больше - 2,0 г на голову (6,0 г/кг). Средство наносилось на всю поверхность туловища крысы, после чего животных на 4 часа помещали в индивидуальные клетки. Продолжительность эксперимента составила 2,5 месяца. На протяжении опыта животных обследовали, используя интегральные и специфические показатели.

Результаты оценки биологического действия препарата представлены в таблице 9. В таблице 9 представлены данные определения массы тела животных.

Таблица 9
Масса крыс (г) после аппликации средства на кожу спины на протяжении 2,5 месяца
Сроки	Кол-во животных	Контроль	3,0 г/кг	6,0 г/кг
Фоновые данные	8	188,5±1,5	189,0±1,5	187,5±1,5
Через 1,5 месяца	8	210,5±3,1	313,5±3,50	209,1±3,0
Через 2,5 месяца	8	26б,3±4,5	263,3±3,35	264,1±3,0

Как следует из таблицы, у животных после обработки масса тела обеих опытных групп достоверно не отличалась от контрольных величин на протяжении всего опыта.

Анализ периферической крови проводился с помощью определения гемоглобина и подсчета лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. Кроме того, определялись расчетные величины, характеризующие состояния эритроцитов. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10
Функциональное состояние периферической крови белых крыс в 2,5 месячном эксперименте
Сроки	Группы	Лейкоциты	Гемоглобин	Эритроциты	Тромбоциты
Через 1,5 месяц	Контроль	12,8±0,84	149,2±3,65	7,75±0,14	636,5±18,7
3,0 г/кг	12,1±1,13	145,0±3,95	8,20±0,16	641,8±19,8
6,0 г/кг	11,5±0,81	140,4±4,68	7,40±0,35	630,7±15,2
Через 2,5 месяца	Контроль	12,5±0,98	138,2±2,3	7,6±0,23	618,3±16,3
3,0 г/кг	11,9±1,38	36,2±2,2	7,4±0,19	598,4±30,8
6,0 г/кг	10,4±1,53	129,5±2,2 Р<0,05	8,3±0,22 Р=0,05	616,0±47,04

Как следует из таблицы, через 1,5 месяца, у животных, подвергавшихся действию, не наблюдалось достоверных изменений выбранных показателей ни в одной из групп. Через 2,5 месяца было отмечено достоверное снижение гемоглобина и повышение количества эритроцитов (при Р=0,05). при действии средства в дозе в 2 раза больше рекомендуемой. Восстановление данных показателей наступало через 1 неделю после окончания эксперимента (таблица 11).

Таблица 11
Определение гемоглобина и эритроцитов через неделю после окончания опыта
Группы	Гемоглобин	Эритроциты
Контроль	141,0±2,15	6,95±0,18
Опыт	145,0±3,05	7,15±0,15

При обработке животных препаратом в дозе 3,0 г/кг (реальный уровень) все показатели, характеризующие функциональное состояние крови, достоверно не отличаются от контрольных величин и не выходят за пределы физиологической нормы на протяжении всего опыта. Для оценки функционального состояния периферической крови использовали также расчетные величины, позволяющие количественно оценить некоторые показатели состояния эритроцитов. Их вычисляли, исходя из величины гематокрита, концентрации гемоглобина, количества и качества эритроцитов. Результаты представлены на таблице 12.

Таблица 12
Индексы эритроцитов крови белых крыс в 2,5-ой месячном эксперименте
Сроки	Группы	Ht	MCV	МСН	МСНС	RDW
Через 1,5 месяца	Контроль 3,0 г/кг 6,0 г/кг	34,7±1,2	51,3±1,3	20,3±0,5	376,6±5,8	15,3±0,4
35,5±1,1	53,1±1,1	20,8±0,5	389,0±5,9	14,3±0,3
34,0±0,9	52,2±0,9	20,8±0,5	393,0±5,5	15,4±0,5
Через 2,5 месяца	Контроль 3,0 г/кг 6,0 г/кг	34,4±0,6	45,1±1,3	19,8±0,6	378,0±6,3	13,1±0,6
36,2±0,5	45,8±1,4	19,6±0,5	379,6±6,1	13,1±0,7
34,0±0,6	44,9±1,3	20,1±0,7	391,7±5,4	14,3±0,5

Обозначения: Ht - Гематокрит; MCV - средняя величина объема эритроцитов, измеряемая в фемтолитрах или мкм³ (fl); MCH - среднее содержание гемоглобина в эритроците; МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроците; RDW - ширина распределения эритроцитов по размеру.

Как следует из таблицы, индексы эритроцитов крови белых крыс опытных животных достоверно не отличаются от таковых контрольных животных, а значит, не являются ведущими при действии на животных препарата в реальных условиях.

Функция центральной нервной системы исследовалась у животных с помощью измерения суммационно-порогового показателя (СПП), предусматривающего регистрацию нервно-мышечной возбудимости животных, определяемую по межпальцевым сокращениям на электродах. Данные представлены в таблице 13.

Таблица 13
Суммационно-пороговый показатель крыс после воздействия средства на кожу
Сроки	Контроль	3,0 г/кг	6,0 г/кг
Через 5 дней	3,6±0,21	3,5±0,21	3,4±0,21
Через 1,5 месяца	3,9±0,21	4,2±0,21	4,0±0,21
Через 2,5 месяца	3,5±0,21	3,1±0,21	4,5±0,21 Р<0,05

Как следует из таблицы, у животных, подвергавшихся накожному воздействию данного средства, было отмечено достоверное повышение СПП через 2,5 месяца эксперимента в группе животных, имеющих контакт с препаратом в большей из доз. И как следствие - заторможенность крыс этой группы. Однако уже через 3 дня наступала нормализация показателя и животные внешне не отличались от контроля. У животных, подвергавшихся действию препарата в меньшей дозе (реальной), СПП на протяжении всего опыта достоверно не отличался от контроля.

При изучении функционального состояния почек определяли диурез, удельный вес мочи, общий белок в моче и хлориды. Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14
Функциональное состояние почек после воздействия средства на кожу белых крыс
Показатели	Сроки	Контроль	3,0 г/кг	6,0 г/кг
Диурез(в мл)	1,5 месяца	4,5±1,3	5,1±1,5	5,3±0,9
2,5 месяца	4,8±1,5	4,8±1,1	5,2±1,5
Удельный вес (в г)	1,5 месяца	1,00±0,01	1,01±0,01	1,01±0,01
2,5 месяца	1,00±0,01	1,00±0,02	1,00±0,02
Белок в моче (в мг/%)	1,5 месяца	32,7±4,1	34,2±8,2	34,8±5,0
2,5 месяца	31,9±3,8	33,8±3,5	35,3±4,1
Хлориды (в мг/мл)	1,5 месяца	2,51±0,15	2,41±0,50	2,43±0,41
2,5 месяца	2,48±0,20	2,49+±0,35	2,47±0,45

Как следует из представленной таблицы, у животных обеих групп после нанесения препарата в дозах на уровне реальной и в 2 раза больше все показатели, характеризующие функциональное состояние почек, достоверно не отличаются от тех же показателей контрольных животных, как через 1,5, так и через 2,5 месяца воздействия препарата.

Функциональное состояние печени оценивалось по способности органа синтезировать гиппуровую кислоту (обезвреживающая функция) и по содержанию в сыворотке крови общего белка (белковообразовательная функция). Результаты представлены в таблице 15. Как следует из таблицы, ни один из выбранных показателей, характеризующих функцию печени, не является ведущим при действии препарата в данных условиях, на данном виде животных

Таблица 15
Некоторые показатели функционального состояния печени животных, подвергавшихся воздействию средства
Показатели	Сроки	Контроль	3,0 г/кг	6,0 г/кг
Гиппуровая кислота (мл)	1,5 месяца	113,2±8,4	109,5±7,3	109,5±7,9
2,5 месяца	111,1±7,9	110,5±6,9	111,5±9,1
Общий белок в сыворотке крови (г/%)	2,5 месяца	6,56±0,5	6,48±0,8	6,35±0,5

Не менее важными для жизнедеятельности организма животных и человека являются такие биохимические показатели, как определение количества в сыворотке крови общих SH-групп и иммуноглобулинов.

Результаты определения общих SH-групп в сыворотке крови белых крыс, подвергавшихся воздействию данного средства, представлены в таблице 16.

Таблица 16
Содержание SH-групп в сыворотке крови и состояние иммунной системы белых крыс после нанесения средства на кожу в 2,5месячном эксперименте
SH-группы (мкмоль/л)	Контроль	3,0 г/кг	6,0 г/кг
Общие	15,5±0,75	16,3±0,48	16,3±1,0
Небелковые	10,3±0,8	9,7±0,30	11,1±1,4
Белковые	5,1±0,6	5,5±0,50	4,3±1,2
Иммуноглобулины (мг/кг)	23,9±1,5	24,1±1,6	23,3±2,1

Как следует из таблицы, при нанесении препарата на кожу белых крыс величины SH-групп всех подопытных животных колебались в пределах контрольных значений и достоверно от них не отличались.

Роль иммуноглобулинов в организме заключается в их участии в процессах иммунитета. Защитная функция иммуноглобулинов обусловлена содержащимися в этой фракции разнообразными антигенами, способными специфически связывать чужеродные антитела. Патологические количественные и функциональные изменения иммуноглобулинов могут быть обусловлены нарушением их синтеза в результате химической интоксикации, вызывающей снижение их содержания в сыворотке крови. Изучение иммунного статуса организма белых крыс, подвергавшихся воздействию средства, представлены в таблице №17.

Как следует из таблицы, у опытных животных обеих групп количество иммуноглобулинов статистически недостоверно по сравнению с контролем и не

выходит за границу физиологических колебаний для данного показателя для данного вида животных.

После окончания опыта, животных убивали и определяли массовые коэффициенты внутренних органов. Результаты представлены в таблице 17.

Таблица 17
Массовые коэффициенты внутренних органов животных, подвергавшихся 2,5 месячному воздействию препарата
Группа	Печень	Почки	Сердце	Селезенка
Контроль	3,6±0,9	0,863±0,08	0,48±0,05	0,28±0,07
3,0 г/кг	3,3±1,3	0,842±0,05	0,42±0,09	0,31±0,09
6,0 г/кг	4,5±1,1	0,849±0,20	0,49±0,09	0,29±0,07

Как следует из таблицы, массовые коэффициенты почек, сердца и селезенки у животных обеих опытных групп находились на одном уровне с контролем и достоверно от него не отличались. Что касается печени, было отмечено некоторое увеличение органа в группе животных, подвергавшихся воздействию большей из доз. Однако данное увеличение статистически недостоверно, что указывает на отсутствие критерия вредности для данного изменения.

Пример 10

Изучение выделения диметилфталата с молоком дойных коров после обработки препаратом

Целью исследований являлось изучение возможного выделения диметилфталата (ДМФ) с молоком. Исследования проводились на молочной ферме "Серп и Молот" на пяти дойных коровах весом около 300 кг каждая.

Перед обработкой у каждой коровы было взято молоко на содержание ДМФ (фоновые данные).

Препарат наносили на все участки кожного покрова коров, за исключением вымени, во избежание непосредственного попадания препарата в молоко при доении. Использовались дозы, рекомендуемые производителем данного средства. Обработки проводились через день в течение двух недель. Молоко на анализ в количестве 500 мл отбирали в часы доения коров на 1, 5, 10, 14 и 15 день. Для определения диметилфталата в пробах был использован метод ГЖХ.

Подбор методики определения остаточных количеств диметилфталата в молоке.

Подбор способа экстракции из молока.

Для экстракции диметилфталата к пробам молока добавляли ацетон в количестве 40 мл, после чего производили встряхивание на шуттель-аппарате в течение 40 мин. Далее в экстракты добавляли по 20 мл воды и выдерживали 30 мин при температуре +4°С. Полученный экстракт фильтровали, добавляли к экстракту 40 мл гексана и снова встряхивали. Затем с помощью делительной воронки отделяли гексан от водно-ацетоновой смеси, пропускали через безводный сернокислый натрий и выпаривали под тягой. Остаток разводили в 1 мл гексана. Пробу объемом 1 мкл вносили в хроматограф.

Условия хроматографирования.

Анализы проводили на газожидкостном хроматографе "ЛХМ 2000", оснащенном детектором электронного захвата. Рабочая температура термостата колонок составляла 270°С, детектора 320°С, термостата испарителя 250°С. Скорость газа-носителя 1 мл/мин. Колонка капиллярная кварцевая (25 м), газ-носитель - азот особой чистоты.

Оценка результатов

Учет пиков проб проводили путем сравнения времени выхода пиков испытуемых экстрактов со временем выхода пика стандартного раствора диметилфталата. При условиях хроматографирования, указанных в п.1.2., время выхода стандарта диметилфталата составляет 2,00 минуты. Выход ДМФ из проб молока при указанном способе экстракции составляет 75±5%. Чувствительность метода для диметилфталата 0,01 мг/л.

Изучение выделения диметилфталата с молоком коров.

При исследовании молока после однократной обработки препаратом диметилфталат не обнаружен.

Результаты содержания ДМФ в молоке коров после многократной обработки представлены в таблице 18.

Таблица 18
Дни определения ДМФ в молоке коров	Содержание ДМФ в молоке (мг/л)
1-й день	не обнаружено
5-й день	не обнаружено
10-й день	не обнаружено
14-й день	следы
15-й день (следующий день после окончания обработок)	не обнаружено

Таким образом, в результате исследований было установлено, что при использовании препарата в рекомендуемой производителем дозе на протяжении 2 недель (7-обработок), анализ молока на 1,5,10 день показал отсутствие содержания диметилфталата в пробах. На 14 день в молоке были обнаружены следы диметилфталата. На следующий день после окончания обработок ДМФ н