Водный раствор фармацевтической композиции 20(r)-гинсенозида rg3 и способ его приготовления

Водный раствор фармацевтической композиции 20(r)-гинсенозида rg3 и способ его приготовления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтической композиции гинсенозида Rg3 и способу ее приготовления.

Уровень техники

Гинсенозид Rg3 является тетрациклическим тритерпеновым соединением сапонина, присутствующим в женьшене (Ginseng) с молекулярной массой 784,3. Имеются два оптических изомера гинсенозида Rg3, т.е. 20(R)-гинсенозид Rg3 и (20S)-гинсенозид Rg3. 20(R)-гинсенозид Rg3 является химически стабильным и нерастворимым в воде, в то время как (20S)-гинсенозид Rg3 является химически нестабильным и легко растворимым в воде. Их молекулярные структуры являются следующими:

Было обнаружено, что 20(R)-гинсенозид Rg3 имеет сильные ингибирующие и антиметастатические активности в отношении опухоли. Поскольку 20(R)-гинсенозид Rg3 нерастворим в воде, биодоступность его пероральных препаратов является очень низкой, что в значительной степени ограничивает достижение его клинической эффективности и парентеральный способ его введения.

Для растворения 20(R)-гинсенозида Rg3 в воде были предприняты некоторые исследования, такие как "Ginsenoide Rg3 hydroxypropyl-β-cyclodextrin clathrate, preparations and its process" (Заявка №01119929.6), которая была опубликована в Патентном Бюллетене 29-го января 2003 г. Основным содержанием является следующее: клатрат гинсенозид Rg3 - гидроксипропил-β-циклодекстрин = 1:1~200.

Способ получения является следующим: (1) Растворите гинсенозид Rg3 в органическом растворителе; (2) Растворите гидроксипропил-β-циклодекстрин в воде; (3) Добавляйте раствор гинсенозида по каплям при сильном перемешивании; после этого продолжайте перемешивание этой смеси еще в течение 2~24 часов. Отфильтруйте эту смесь с использованием фильтрующей мембраны с микропорами 0,45 мкм, конденсируйте этот фильтрат, удалите органический растворитель, повторно растворите в воде для инъекций и затем отфильтруйте этот фильтрат опять с использованием фильтрующей мембраны с микропорами 0,22 мкм, лиофилизируйте этот фильтрат с получением пористого белого порошка, т.е. клатрата гинсенозида.

Недостатки этого способа являются следующими: (1) в этом способе получения клатрата, когда реагирующее вещество (раствор реагирующего вещества) рециклируют до трети его первоначального объема, все еще имеется некоторый остаток детектируемого органического растворителя; однако удаление этого остаточного органического растворителя лиофилизацией является неэффективным. Таким образом, очень трудно удовлетворить требованию в отношении отсутствия остаточного растворителя в инъекционном растворе при его получении с использованием этого порошка клатрата; (2) в этом способе получения клатрата этот остаточный растворитель очень важен для образования растворимого клатрата гинсенозида Rg3 и гидроксипропил-β-циклодекстрина с соотношением 1:1~200. Если остаточный растворитель удаляют полностью, стабильный клатрат не будет образован при вышеупомянутом соотношении, и гинсенозид Rg3 будет немедленно отделяться в виде осадка из водного клатрата, делая этот клатрат непригодным для приготовления инъекционного раствора; (3) при помощи этого способа гинсенозид Rg3 не мог бы полностью превращаться в клатрат, и степень утилизации Rg3 равна только 86%. Таким образом, себестоимость продукции для приготовления инъекционного раствора будет явно увеличиваться.

Раскрытие изобретения

Объектами этого изобретения являются обеспечение способа приготовления и медицинского применения фармацевтической композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 и ее фармацевтических препаратов с характеристиками низкой себестоимости и легкой абсорбции (высокой биодоступности) телом человека.

Основным исходным материалом (для краткости, основным материалом) этого изобретения является 20(R)-гинсенозид Rg3, а адъювантный материал (для краткости, адъювант) этого изобретения состоит из материалов Класса А и Класса В. Класс А включает в себя дезоксихолевую кислоту (натриевая соль), додецилсульфат натрия (ДСН) и аргинин; Класс В является циклодектринами, включающими в себя: 1) циклодекстрин и его производные, такие как полимеризованная микрочастица нанодиапазона циклодекстрина, полимеризованный циклодекстрин и циклодекстрин с боковой цепью (В(1)); 2) β-циклодекстрин и его производные, такие как β-циклодекстрин, 2,6-диметил-β-циклодекстрин, глюкозил-β-циклодекстрин, β-циклодекстрин на основе наночастиц, сульфобутиловый эфир β-циклодекстрина, метил-β-циклодекстрин и нелокализованный метилированный β-циклодекстрин (В(2)); 3) гидроксипропил-β-циклодекстрин и его производные, такие как 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, производные 3-гидроксипропил-β-циклодекстрина, 2,3-дигидроксипропил-β-циклодекстрин и 2,3,6-тригидроксипропил-β-циклодекстрин (В(3)); 4) гидроксиэтил-β-циклодекстрин (В(4)); и 5) адъювантная смесь циклодекстрина и его производных, т.е. смесь, смешанная при различных комбинациях вышеупомянутых циклодекстрина, β-циклодекстрина, гидроксипропил-β-циклодекстрина, гидроксиэтил-β-циклодекстрина и их производных (В(5)).

Массовое отношение основного материала к адъювантным материалам является следующим:

20(R)-гинсенозид Rg3:адъювант А или В(1),(2),(5)=1:1~300 и 20(R)-гинсенозид Rg3:адъювант В(3),(4) - 1:100~400.

Способ приготовления фармацевтической композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 является следующим:

(1) приготовление раствора основного материала: Растворите 20(R)-гинсенозид Rg3 в смеси органических растворителей с получением 0,1-5,0% раствора гинсенозида. Название и соотношение этих смешанных органических растворителей являются следующими: 1) хлороформ: этилацетат:этанол (метанол):вода=10-25:30~45:18~30:5~15, нижний уровень; 2) хлороформ: этанол (метанол):вода=70~60:40~30:10, нижний уровень; 3) этанол:вода=90~95:10~5; 4) метанол:вода=85~90:15~10; 5) ацетонитрил:вода=40~60:60~40; 6) дихлорметан:этанол (метанол):вода=60~65:40~35:10; 7) ацетонитрил:этанол (метанол)=70~80:30~20; 8) диметилсульфоксид:вода=90~80:10~20; и 9) пропиленгликоль:этанол (метанол):Твин 80:вода=40~50:20:1:49~29;

(2) приготовление раствора адъювантного материала: 1) растворите вышеупомянутые адъюванты Класса А и Класса B в воде по отдельности для получения 0,1~30% водного раствора (а); 2) растворите вышеупомянутый адъювант подгрупп (3) и (4) Класса B в воде отдельно для получения 20~65% водного раствора (b);

(3) добавление раствора основного материала в раствор адъювантов: 1) непосредственно добавьте вышеупомянутый раствор гинсенозида в раствор адъювантов (а) при 40~100°С и перемешивайте эту смесь в течение 0,3~1 часа с получением затем прозрачного раствора, или 2) добавляйте по каплям вышеупомянутый раствор гинсенозида при постоянной скорости в раствор адъювантов (b) при 60~100°С и перемешивайте этот водный раствор до полного завершения добавления по каплям с получением прозрачного раствора;

4) рециклирование растворителя и приготовление фармацевтической композиции: рециклируйте растворитель, подвергая действию пониженного давления прозрачный раствор в стадии (3) до почти сухого состояния приблизительно 2/3 его первоначального объема, со степенью разрежения 0,01~0,08 МПа, при температуре 80~100°С. Восстановите раствор добавлением воды до первоначального объема и проведите рециклирование растворителя, подвергая действию пониженного давления, почти досуха; повторите вышеупомянутую процедуру дважды и, наконец, восстановите раствор из этого почти высушенного материала добавлением воды для инъекции или очищенной воды и затем смешайте хорошо для растворения. Полученный водный раствор является фармацевтической композицией 20(R)-гинсенозида Rg3. Для раствора композиции, приготовленного из 20(R)-гинсенозида Rg3 и адъюванта Класса А или подгрупп (1), (2) и (5) Класса В, содержание основного материала равно 0,5~10 мг/мл; для раствора композиции, приготовленного из 20(R)-гинсенозида Rg3 и адъюванта Класса В(3) и (4), содержание основного материала равно 0,1~2 мг/мл. После процессов сушки, таких как вакуумная сушка, распылительная сушка или лиофилизация, может быть получен водорастворимый порошок фармацевтической композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, и способ и условия сушки являются следующими:

Способ сушки	Условия сушки
Вакуумная сушка	Температура 30~60°С; давление 0,01~0,08 Па, вакуумная сушка в течение 48 часов.
Распылительная сушка	Используют способ сверхзвуковой струи. Скорость струи 300~990 м/с; температура 30~60°С; давление 0,01~0,05 МПа, мгновенная сушка при сверхзвуковой скорости.
Лиофилизация (сушка вымораживанием)	Предварительное замораживание в течение 5 часов при -45°С и лиофилизация в соответствии с программой градиента температуры: -45°С~-5°С, сублимационная сушка в течение 20 часов и затем вакуумная сушка в течение 10 часов при -15~30°С.

С использованием этой водорастворимой фармацевтической композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 могут быть приготовлены различные типы препаратов:

1) препараты для перорального и наружного применения: для раствора композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, полученного реакцией основного материала с адъювантами Класса А и В, водорастворимый твердый порошок гинсенозида Rg3 может быть получен с использованием способа сушки. После формулирования с фармацевтически приемлемыми носителями и обработки фармацевтическими способами могут быть получены различные типы препаратов, такие как гранулы, таблетки (обычная таблетка, таблетка для диспергирования, таблетка с замедленным высвобождением, таблетка с регулируемым высвобождением и т.д.), мягкие или твердые капсулы, раствор для перорального введения, препараты для наружного применения (пластырь, мазь, капли и аэрозоль);

2) инъекционные препараты: для раствора композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, полученного реакцией основного материала с адъювантами Класса А и В °С и °С:1, однородно смешивают вышеупомянутый водный раствор композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 либо через ультрафильтр, либо с добавлением 0,1 мас.% активированного угля квалификации «для медицинских инъекций», оставляют при 80°С на 30 минут, удаляют пирогены фильтрованием через фильтрующую мембрану с микропорами 0,45 мкм. После стерилизации через фильтрующую мембрану с микропорами 0,22 мкм получают инъекционный раствор. Или после лиофилизации получают лиофилизированный порошок для инъекции или стерильный порошок для инъекции. Вышеупомянутый водный раствор сушат или рециклируют растворитель либо лиофилизацией, вакуумной сушкой, либо распылительной сушкой для получения стабильного и водорастворимого твердого порошка гинсенозида Rg3. После восстановления могут быть получены лиофилизированный порошок для инъекции или стерильный порошок для инъекции.

Фармацевтические препараты, приготовленные из вышеупомянутой фармацевтической твердой или жидкой композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, имеют ингибирующие активности в отношении роста и метастазирования опухолей и активности потенцирования эффективности и аттенуации токсичности при объединении с химиотерапией или лучевой терапией опухоли и могут усиливать иммунные функции человека, улучшать память человека и противостоять усталости, имеют эффекты уменьшения припухлости, ослабления боли и заживления ран.

В сравнении с существующей технологией данное изобретение обладает следующими преимуществами:

1) Из раствора фармацевтической композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 в данном изобретении порошок, который не содержит остаточного органического растворителя и может быть полностью растворен в воде, может быть получен после сушки; таким образом, лиофилизированный порошок для инъекции, приготовленный из этого порошка, может удовлетворять требованиям инъекционного препарата в «Фармакопее Китайской народной республики». И могут быть получены различные типы препаратов для перорального или наружного применения.

2) Инъецируемые препараты или пероральные препараты, приготовленные из фармацевтической композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 в данном изобретении, имеют значимо улучшенную биодоступность в сравнении с существующими коммерческими пероральными препаратами (товарное название: Капсула Shen Yi). После инъекции: инъецируемый препарат гинсенозида Rg3 может полностью проникать в кровь человека и животных, с абсолютной биодоступностью 100%, что превышает биодоступность существующих пероральных препаратов в 20~50 раз. Пероральные препараты гинсенозида Rg3 превышают биодоступность существующих пероральных препаратов более чем в 10 раз.

3) 20(R)-гинсенозид Rg3, полученный в данном изобретении, может на 100% превращаться в раствор с использованием адъюванта. После процесса сушки может быть получен лиофилизированный порошок для инъекции; следовательно, степень утилизации этого материала равна 100% с расходами, значимо более низкими, чем расходы для лиофилизированного порошка его клатрата для инъекции.

4) Пероральные фармацевтические препараты композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, полученные в данном изобретении, могут быть уменьшены до половины дозы применения вследствие улучшенной биодоступности, с той же самой или лучшей эффективностью, чем эффективность существующей капсулы, что в значительной степени уменьшает расходы раковых пациентов.

5) Инъекционные препараты композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, полученные в данном изобретении, имеют распределение высокой концентрации в печени и желудочно-кишечных стенках крыс и собак и, следовательно, они могут быть использованы в качестве хорошего лечения для опухолей пищеварительного тракта и метастазирования опухолей.

Описание чертежей

Фиг. 1 является хроматограммой определения высокоэффективной жидкостной хроматографией стандартной пробы 20(R)-гинсенозида Rg3.

Фиг. 2 является хроматограммой высокоэффективной жидкостной хроматографии композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 и натриевой соли дезоксихолевой кислоты.

Фиг. 3 является хроматограммой высокоэффективной жидкостной хроматографии стандартной пробы 20(R)-гинсенозида Rg3.

Фиг. 4 является хроматограммой высокоэффективной жидкостной хроматографии композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 и додецилсульфата натрия.

Фиг. 5 является хроматограммой высокоэффективной жидкостной хроматографии стандартной пробы 20(R)-гинсенозида Rg3.

Фиг. 6 является хроматограммой высокоэффективной жидкостной хроматографии композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 и 2,3,6-тригидроксипропил-β-циклодекстрина.

Фиг. 7 является хроматограммой высокоэффективной жидкостной хроматографии стандартной пробы 20(R)-гинсенозида Rg3.

Фиг. 8 является хроматограммой высокоэффективной жидкостной хроматографии композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 и β-циклодекстрина.

Фиг. 9 является временной кривой концентрации лекарственного средства в плазме после перорального введения 5,6 г гранул 20(R)-гинсенозида Rg3 у семи собак.

Фиг. 10 является временной кривой концентрации лекарственного средства в плазме после перорального введения 3 капсул 20(R)-гинсенозида Rg3 Shen Yi у семи собак.

Фиг. 11 является временной кривой концентрации лекарственного средства в плазме после перорального введения 3 гранул 20(R)-гинсенозида Rg3 и капсул Shen Yi у семи собак.

Описание вариантов осуществления

Пример 1

Растворите 1 грамм 20(R)-гинсенозида Rg3 смесью органических растворителей (хлороформ:этилацетат:этанол:вода=10:30:18:5, нижняя фаза) и приготовьте 0,1% раствор. Растворите 100 граммов натриевой соли дезоксихолевой кислоты в воде для инъекций; нагрейте этот раствор до 40°С и приготовьте 30% водный раствор. Добавьте приготовленный раствор гинсенозида Rg3 в вышеупомянутом растворе натриевой соли дезоксихолевой кислоты и перемешивайте в течение 3 часов с получением затем прозрачного раствора композиции. После фильтрования этот раствор подвергают действию пониженного давления в роторном испарителе при 100°С со степенью разрежения 0,01 МПа для рециклирования растворителя почти досуха. После восстановления этого почти высушенного материала дистиллированной водой до первоначального объема этот раствор рециклируют опять почти досуха. Повторите вышеуказанную процедуру еще раз для полного удаления органического растворителя. Восстановите почти высушенный материал водой для инъекции (100 мл); полученный водный раствор является 100 мл композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 с натриевой солью дезоксихолевой кислоты. После определения при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии рассчитано, что содержание гинсенозида Rg3 в растворе композиции равно 10 мг/мл, как показано на фиг. 1 и 2.

Пример 2

Растворите 0,5 г 20(R)-гинсенозида Rg3 смесью органических растворителей (хлороформ:этилацетат:этанол:вода=20:45:30:15, нижняя фаза) и приготовьте 5% раствор. Растворите 100 граммов додецилсульфата натрия в воде для инъекций; нагрейте этот раствор до 100°С и приготовьте 0,1% водный раствор. Добавьте приготовленный раствор гинсенозида Rg3 в вышеупомянутом растворе додецилсульфата натрия и перемешивайте в течение 0,1 часа с получением затем прозрачного раствора композиции. После фильтрования этот раствор подвергают действию пониженного давления в роторном испарителе при 80°С со степенью разрежения 0,08 МПа для рециклирования растворителя до четверти первоначального объема, и этот раствор опять рециклируют почти досуха. После восстановления этого почти высушенного материала дистиллированной водой до первоначального объема этот раствор рециклируют опять почти досуха. Повторите вышеуказанную процедуру еще раз для полного удаления органического растворителя. Восстановите почти высушенный материал очищенной водой (1000 мл); полученный водный раствор является 1000 мл композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 с додецилсульфатом натрия. После определения при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии рассчитано, что содержание гинсенозида Rg3 в растворе композиции равно 0,5 мг/мл, как показано на фиг. 3 и 4.

Пример 3

Растворите 5 г 20(R)-гинсенозида Rg3 смесью органических растворителей (хлороформ:этанол:вода=70:30:10, нижняя фаза) и приготовьте 0,1% раствор. Растворите 500 граммов 2,3,6-тригидроксипропил-β-циклодекстрином в дистиллированной воде; нагрейте этот раствор до 60°С и приготовьте 20% водный раствор. После перемешивания добавляйте по каплям приготовленный раствор гинсенозида Rg3 в вышеупомянутый раствор 2,3,6-тригидроксипропил-β-циклодекстрина при постоянной скорости 10 мл/мин и остановите перемешивание после завершения добавления капель. Этот раствор подвергают действию пониженного давления в роторном испарителе при 100°С со степенью разрежения 0,05 МПа для рециклирования растворителя почти досуха. После восстановления этого почти высушенного материала дистиллированной водой до первоначального объема этот раствор рециклируют опять почти досуха. Повторите вышеуказанную процедуру еще раз. Восстановите этот концентрированный материал 2,5 литрами воды для инъекции; полученный водный раствор является водорастворимым промежуточным продуктом 20(R)-гинсенозида Rg3. После определения при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии рассчитано, что содержание водорастворимого промежуточного продукта гинсенозида Rg3 равно 2 мг/мл, как показано на фиг. 5 и 6.

Пример 4

Растворите 2 г 20(R)-гинсенозида Rg3 смесью органических растворителей (хлороформ:этанол:вода=70:30:10, нижняя фаза) и приготовьте 5% раствор. Растворите 600 граммов β-циклодекстрина в дистиллированной воде; нагрейте этот раствор до 40°С и приготовьте 30% водный раствор. После перемешивания добавляйте по каплям приготовленный раствор гинсенозида Rg3 в вышеупомянутый раствор β-циклодекстрина при постоянной скорости 5 мл/мин и остановите перемешивание после завершения добавления капель. Этот раствор подвергают действию пониженного давления в роторном испарителе со степенью разрежения 0,04 МПа для рециклирования растворителя почти досуха. После восстановления этого почти высушенного материала дистиллированной водой до первоначального объема этот раствор рециклируют опять почти досуха. Повторите вышеуказанную процедуру еще раз. Восстановите этот концентрированный материал 20 литрами воды для инъекции; полученный водный раствор является водорастворимым промежуточным продуктом 20(R)-гинсенозида Rg3. После определения при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографией, рассчитано, что содержание водорастворимого промежуточного продукта гинсенозида Rg3 равно 0,1 мг/мл, как показано на фиг. 7 и 8.

Пример 44

Возьмите 100 мл раствора композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, полученного из рабочего примера 1, добавьте воду для инъекции до 1000 мл, добавьте 0,1 г активированного угля инъекционной чистоты и смешайте до однородности. Оставьте смесь при 80°С на 30 минут, удалите пирогены фильтрованием через мембрану с микропорами 0,45 мкм, стерилизуйте при помощи фильтрующей мембраны с микропорами 0,22 мкм, расфасуйте в стерильные флаконы для антибиотиков при стерильных условиях с количеством в каждом флаконе 4,5~4,9 мл: 5 мг. После расфасовки флаконы для антибиотиков закрывают наполовину, переносят на планшет лиофилизатора (LYO-5, изготовляемого в Шанхае). Закройте дверцу лиофилизатора, включите лиофилизатор и сначала заморозьте ниже -40°С и выдерживайте в течение 4 часов, а затем начните вакуумную сушку в соответствии с программой для сублимации: -45°С~-30°С в течение 4 часов, -30°С~-20°С в течение 4 часов, -20°С~-15°С в течение 2 часов. Наконец, после сушки в течение 4 часов при 15~30°С процесс лиофилизации завершается. После лиофилизации пробки полностью закупоривают и придавливают на герметизирующей машине. Возьмите пробу для испытания. Упакуйте прошедшие испытание флаконы. Получают 1000 флаконов с лиофилизированным порошком для инъекции (3,1 мг Rg3 на флакон). Вышеупомянутые процедуры могут проводиться для примеров 2-40 с получением водорастворимого порошка гинсенозида Rg3.

Пример 45

Возьмите 50 литров раствора композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, полученного из рабочего примера 20, поместите на сушильную пластину из нержавеющей стали вакуумной сушилки с двухконусным сферическим вращением (модели SZG-4500, изготовляемой в Changzhou) для вакуумной сушки в течение 12 часов при 80°С со степенью разрежения 1,3 Па с получением водорастворимого порошка; или поместите вышеупомянутый раствор композиции в эксикатор с псевдоожиженным слоем комбинированной распылительной сушилки (модель SPG-105, изготовляемой в Changzhou) и распыляйте раствор композиции, содержащий 20% твердого вещества, в ожиженный слой через распыляющее сопло с двойным отверстием при 20°С и при скорости разбрызгивания 0,8 кг/час. Температура на входе псевдоожиженного газа равна 150°С, распыленный объем может нагревать псевдоожиженный слой до 75°С и могут быть получены 55 килограммов водорастворимого порошка с диаметром частиц 100~250 микрометров. Или вышеупомянутый водорастворимый высушенный порошок может быть снова восстановлен и лиофилизирован с использованием процедуры, описанной в примере 35, и могут быть получены 10000 флаконов лиофилизированного порошка для инъекции.

Пример 46

Эксперимент in vivo по улучшению биодоступности гранул композиции 20(R)-гинсенозида Rg3

Концентрации в плазме 20(R)-гинсенозида Rg3 в коротконогих гончих собаках (биглях) сравнивали между пероральным введением гранул композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 и пероральным введением капсул материала 20(R)-гинсенозида Rg3. Это исследование выполняли по контракту с Лабораторией метаболизма и фармакокинетики лекарственных средств (Shenyang Pharmaceutical University). Результаты демонстрируют, что концентрация в плазме 20(R)-гинсенозида Rg3 у гончих собак, которым перорально вводили гранулы композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, в 12-20 раз выше, чем концентрация у собак, которым вводили перорально капсулы материала 20(R)-гинсенозида Rg3, что позволяет предполагать, что биодоступность гранул композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 в теле животного гораздо выше, чем биодоступность капсул, изготовленных из материала гинсенозида Rg3.

Гончим собакам вводят перорально гранулы композиции 20(R)-гинсенозида Rg3, полученные в рабочем примере 37, и измеряют биодоступность. Используемым инструментом для тестирования биологических проб является масс-спектрометр API 4000. Используют способ тандемной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (LC/MS/MS). Временная кривая концентрации лекарственного средства в плазме в семи собаках, которым вводили перорально 5,6 граммов фармацевтической композиции 20(R)-гинсенозида Rg3 и β-циклодекстрина (1:200, содержащей 30 мг Rg3), представлена на фиг. 9. Временная кривая концентрации лекарственного средства в плазме в семи собаках, которым вводили перорально 3 капсулы Shen Yi (содержащие 30 мг Rg3, 10 мг Rg3 на одну капсулу), представлена на фиг. 10. Временные кривые средней концентрации лекарственного средства в плазме этих двух групп обработки представлены на фиг. 11. После перорального введения фармацевтической композиции максимальная наблюдаемая концентрация (С_макс) равна 6,8±1,8 нг/мл при 2,3±0,9 ч (t _макс, время максимальной наблюдаемой концентрации). Терминальное время полужизни (t_1/2) равно 6,0±0,9 ч и площадь под кривой (AUC0-t) равна 40,0±15,7 нг·ч/мл.

Пример 47

Противоопухолевый фармакодинамический биоанализ лиофилизированного порошка для инъекции композиции 20(R)-гинсенозида Rg3

1. Тестируемое лекарственное средство и способ приготовления

Тестируемое лекарственное средство: лиофилизированный порошок для инъекции гинсенозида Rg3; партия 20030519, требование стандарта 5 мг/флакон.

Способ приготовления: точно взвесьте требуемое количество лиофилизированного порошка для инъекции гинсенозида Rg3 или соответствующего адъюванта; добавьте в солевой раствор до требуемой концентрации. Объем введения равен 0,5 мл/мышь.

2. Материалы эксперимента

2.1. Растворитель: солевой раствор

2.2. Положительные контроли: циклофосфамид для инъекции (СТХ), производимый Фармацевтической группой Shanghai Hualian. Внутривенная инъекция один раз в день, продолжающаяся в течение 7 дней. 5-фтордезоксиуридин (5Fu) для инъекции, производимый Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Corporation, Ltd. Митомицин С для инъекции, производимый Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. (Tokyo, Japan).

2.3. Источник опухоли: модель LOVO рака кишечника человека, модель MGC рака желудка человека и модель QGY рака печени человека, все штаммы опухолей субкультивировали in vivo в течение более 2-й генерации. Клетки меланомы мыши B₁₆ субкультивировались и поддерживались Отделом фармакологии Шанхайского института фармацевтической промышленности.

3. Экспериментальные животные

3.1. Источник: голых мышей поставлял Шанхайский центр лабораторных животных Китайской академии наук; № сертификата о качестве SCXK2003-0003. Мышей C₅₇BL/6 и мышей Kunming поставляла Группа лабораторных животных Шанхайского института фармацевтической промышленности. Номер лицензии Laboratory Animal Usage License No. SYXK (Shanghai) 2004-0015.

3.2. Масса тела

Голые мыши: 6 недель; мыши C₅₇BL/6 и мыши Kunming: 18~22 г.

3.3. Пол: для каждого теста использовали как самок, так и самцов этих животных, использовали один и тот же пол животных.

3.4. Количество животных: для групп обработки и положительного контроля на каждую группу использовали 6 голых мышей и 8-10 других мышей, для отрицательных контролей использовали 2 группы животных.

4. Экспериментальные схемы

4.1. Установка дозировок: дозу введения для лиофилизированного порошка для инъекции 20(R)-гинсенозида Rg3 устанавливали в количестве 1,5, 0,75 и 0,375 мг/кг/день.

4.2. Протокол введения: выполняли внутривенное введение, два раза в день. Для мышиных моделей, инокулированных опухолевыми клетками человека, инъекцию продолжали в течение семи дней; для мышиных моделей, инокулированных опухолевыми клетками мыши, продолжали инъекцию в течение пяти дней.

4.3. Экспериментальные контроли

Отрицательные контроли: вводили с тем же самым адъювантом, что и адъювант в группах обработки, и протокол введения был таким же, что и протокол в группах обработки.

Положительные контроли: СТХ, 30 мг/кг; ММС, 2 мг/кг; 5Fu, 30 мг/кг;

внутрибрюшинная или внутривенная инъекция, один раз в день, продолжающаяся в течение 7 дней.

5. Экспериментальные способы

5.1. Антибластомный биоанализ

5.1.1. Модель инокуляции in situ желудка

Возьмите сильно растущие in vivo клетки 2-й генерации рака желудка MGC при стерильных условиях и приготовьте их в виде суспензии клеток с плотностью клеток 2×10⁷ клеток/мл при помощи способа гомогената. Инъецируйте 0,05 мл этой суспензии клеток в мышечный слой большой кривизны желудка голых мышей посредством хирургической операции. Введите вышеуказанным мышам тестируемое лекарственное средство на следующий день в соответствии с протоколом схемы эксперимента и рассчитайте процент продления жизни несущего опухоль хозяина:

Процент продления жизни (%)=(среднее количество дней выживания группы обработки / среднее количество дней выживания контроля) х 100%.

5.1.2. Модель инокуляции in situ печени

Возьмите сильно растущие in vivo опухолевые клетки 2-й генерации QGY при стерильных условиях и приготовьте их в виде суспензии клеток с плотностью приблизительно 1-2×10⁷ клеток/мл при помощи способа гомогената 1:6. Эту суспензию клеток фильтруют с использованием сита из нержавеющей стали 100 меш и сохраняют для последующего использования. После рутинной стерилизации и анестезии голых мышей разрежьте кожу живота ниже мечевидного отростка грудины середины брюшной полости и затем откройте брюшную полость. Обнажите печень и инъецируйте 0,05 мл суспензии клеток в паренхиму печени введенным шприцем калибра 28 G на ½ мл. После закрывания брюшной полости зашейте мышечный слой и слой кожи последовательно. Этих голых мышей содержат в ламинарном боксе и используемые кормушку, подстилку, клетку и весь рабочий прибор стерилизуют автоклавированием. Введите тестируемое лекарственное средство на следующий день в соответствии с протоколом схемы эксперимента, зарегистрируйте время выживания в пределах 45 дней после введения доз для каждой группы и рассчитайте процент продления жизни несущего опухоль хозяина в сравнении с процентом продления жизни отрицательных контролей.

5.2. Биоанализ потенцирования противоопухолевой эффективности

5.2.1. Модель подкожной инокуляции в подмышечные ямки

Возьмите сильно растущие опухолевые клетки при стерильных условиях и приготовьте их в виде суспензии клеток с плотностью приблизительно 1~2×10⁷ клеток/мл способом гомогенизации. Инокулируйте 0,2 мл на мышь этой суспензии клеток подкожно в подмышечную ямку хозяина. Введите тестируемое лекарственное средство на следующий день в соответствии с протоколом схемы эксперимента. Эвтанизируйте животное каждой группы после ~3 недель, извлеките опухоль из мышей и взвесьте ее. Рассчитайте процент ингибирования опухоли по следующей формуле:

Процент ингибирования опухоли (%)=[(средняя масса опухоли контрольной группы - средняя масса опухоли группы обработки)/средняя масса опухоли контрольной группы]×100%.

5.2.2. Модель инокуляции хвостовой вены

Клетки меланомы мыши В16 в фазе логарифмического роста берут при стерильных условиях и готовят суспензию клеток с плотностью приблизительно 2,5×10⁷ клеток/мл. Инокулируйте 0,2 мл/мышь суспензии клеток в каудальную вену мыши C₅₇BL/6. На следующий день введите тестируемое лекарственное средство в соответствии с протоколом схемы эксперимента, эвтанизируйте животное после ~3 недель, извлеките легкие из мышей и подсчитайте количество метастатических колоний в легких каждой мыши. Рассчитайте процент ингибирования опухолей на основе среднего количества колоний групп по следующей формуле:

Процент ингибирования опухолей (%)=[(среднее количество колоний контрольной группы - среднее количество колоний группы обработки)/среднее количество колоний контрольной группы]×100%.

5.3. Биоанализ аттенуации противоопухолевой токсичности

Оценивают действия лиофилизированного порошка для инъекции гинсенозида Rg3 на изменения количества лейкоцитов в мышах, индуцированных химиотерапевтическими агентами. Пробу крови берут из мышей C₅₇BL/6 через глазное венозное сплетение и выполняют подсчет лейкоцитов для каждой мыши рутинной процедурой с камерой для подсчета клеток крови (гематоцитометром). Мышей с количеством лейкоцитов 7500±300 отбирают и случайным образом относят к различным группам, по 10 мышей для каждой группы. За исключением слепой контрольной группы животным в других группах вводят 100 мг/кг СТХ ip 2 раза в дни 0 и 2. Введите тестируемое лекарственное средство в соответствии с вышеуказанным протоколом, подсчитайте количество лейкоцитов, начиная со дня 0, и затем подсчитывайте количество лейкоцитов каждые 3 дня во время экспериментального периода. Измеряйте количество лейкоцитов каждой группы и рассчитывайте средние количества лейкоцитов и их стандартные отклонения для каждой группы в каждой временной точке, пока количество лейкоцитов положительных контролей не вернется к нормальному уровню.

5.4. Иммунологический биоанализ

5.4.1. Биоанализ активности НК-клеток в мышах C₅₇BL/6, несущих клетки рака легкого Льюиса

Суспензию клеток рака легкого Льюиса готовят при стерильных условиях и 0,05 мл (приблизительно 1×10⁶ опухолевых клеток) этой суспензии подкожно инокулируют в палец задней лапки мышей C₅₇BL/6. Мышей случайным образом относят на следующий день к различным группам и вводят тестируемое лекарственное средство в соответствии с протоколом схемы эксперимента. На следующий день после последнего введения дозы из мышей извлекают селезенки в стерильных условиях и готовят суспензию клеток селезенки с использованием сита 100 меш. Эритроциты удаляют гипотонической обработкой и полученную суспензию клеток переносят в колбу для культуры клеток. После инкубирования при 37°С, 5% СО₂ в течение 1 часа прикрепленные клетки извлекают, клетки считают и доводят до плотности 3×10⁶ клеток/мл и используют в качестве эффекторных клеток. Клетки-мишени готовят рутинным культивированием l₉₂₉ in vitro клеток в течение 24 часов и доведением концентрации клеток до 1,5×10⁵ клеток/мл и отношения эффекторные клетки:клетки-мишени до 20:1. Эффекторные клетки и клетки-мишени последовательно добавляют в 96-луночные планшеты для культуры клеток, делая также контроли эффекторных клеток и клеток-мишеней, и культивируют в течение 4 часов при 37°С, 5% CO₂. Добавляют раствор красителя МТТ и клетки дополнительно культивируют в течение 2 часов, после чего добавляют расщепляющий раствор и величину OD для каждой лунки измеряют на следующее утро. Активности НК-клеток рассчитывают по следующей формуле:

Активности НК-клеток (%)={[средняя OD контроля-мишени - (средняя OD экспериментальной группы - средняя OD эффекторных клеток)]/средняя OD контроля-мишени}×100%.

5.4.2. Фагоцитоз макрофагалии брюшной полости нормальных мышей Kunming

Самцов мышей Kunming случайным образом относят в различные группы и вводят им тестируемое лекарственное средство в соответствии с протоколом схемы эксперимента. После последнего введения доз 1,5 мл 0,5% аминопептодрата внутрибрюшинно инъецируют в каждую мышь. После 24 часов 0,2 мл суспензии куриных эритроцитов 1×10⁷/мл инъецируют внутрибрюшинно в каждую мышь. Спустя 40 минут после этой инъекции внутрибрюшинную жидкость элюируют солевым раствором, собирают и затем центрифугируют. Осажденные осадки после центрифугирования наносят мазком на предметное стекло. После фиксации метанолом и окрашивания красителем Гимза и приготовления препаратов на предметных стеклах количество макрофагов, которые поглощали куриные эритроциты, считают из 100 макрофагов для каждой мыши под иммерсионным микроскопом и считают также общее количество поглощенных куриных эритроцитов. Процент фагоцитоза и индексы фагоцитоза рассчитывали по следующим формулам:

Процент фагоцитоза = (количество макрофагов, поглотивших куриные эритроциты, в 100 макрофагах/100 макрофагов)×100%;

Индексы фагоцитоза = общее количество куриных эритроцитов, поглощенных в 100 макрофагах/100 макрофагов.

5.4.3. Биоанализ активности IL-2 в мышах C₅₇BL/6, несущих клетки рака легкого Льюиса

Используют способ сэндвич-ELISA с двумя антителами. Моноклональными антителами против мышиного IL-2 покрывают планшет ELISA, и молекулы IL-2 в пробах или стандартах связываются с этим моноклональным антителом, а свободные несвязанные компоненты вымываются. Между тем, добавляют биотинилированное антитело против мышиного IL-2 и добавляют меченный пер