Полифункциональный полигемоглобин-ферментный комплекс

Полифункциональный полигемоглобин-ферментный комплекс

Реферат

Изобретение относится к медицине и технологиям создания биосовместимых материалов, а именно к кислородтранспортным кровезаменителям, и предназначено для использования при массивных кровопотерях службами скорой медицинской помощи, в операционных блоках клиник, при транспортировке и хранении донорских органов, а также для лечения ряда таких патологий, как, например, ишемические и реперфузионные повреждения, воспаления и тромбозы.

Известно, что сами по себе кислородтранспортные растворы на основе свободного полигемоглобина могут приводить к увеличению концентрации активных форм кислорода в организме (D`Agnillo F. Polyhemoglobin-superoxide dismutase-catalase as a blood substitute with antioxidant properties / F.D`Agnillo, T.M. Chang // Nat. Biotechnol. - 1998. - Vol.16. - № 7. - P. 667-671). Так, в присутствии супероксидного аниона и пероксида водорода железо гемов гемоглобина (Fe²⁺) может вступать в реакцию Фентона, генерируя другие высокоактивные продукты. Также, железо гема (Fe²⁺) может подвергаться процессу аутоокисления, продуцируя при этом супероксидный радикал. Кроме того, модифицированный гемоглобин может стимулировать фагоцитарный дыхательный взрыв и увеличивать метаболизм арахидоновой кислоты, что приводит к увеличению продукции супероксидного аниона.

Существует проблема, связанная с применением кислородтранспортных кровезаменителей на основе свободного полигемоглобина. Она заключается в эффекте вазоконстрикции при введении таких кровезаменителей в кровеносное русло пациента (Patel R.P. Biochemical aspects of the reaction of hemoglobin and NO: implications for Hb-based blood substitutes / R.P.Patel // Free Radical Biology & Medicine. - 2000. - V.28. - P.1518-1525). Это может приводить к серьезным нарушениям работы сердечно-сосудистой системы пациента или даже к летальному исходу. Кроме того, было показано, что при введении в кровеносное русло кровезаменителя на основе свободного полигемоглобина в местах повреждения сосудов могут активироваться тромбоциты (Olsen S.B. Enhancement of Platelet Deposition by Cross-Linked Hemoglobin in a Rat Carotid Endarterectomy Model / S.B.Olsen [et al] // Circulation. - 1996. - №93 (2). - P.327-332). Это приведет к повышенному тромбообразованию, особенно у пациентов с сосудистыми заболеваниями (Marcus A.J. Cell-free hemoglobin as an oxygen carrier removes nitric oxide, resulting in defective thromboregulation / A.J.Marcus, J.B.Broekman // Circulation. - 1996. - №93 (2). - P.208-209). В качестве решения этих проблем предлагается вводить в состав кровезаменителя вазодилататоры на основе оксида азота (II) и оксида углерода (II).

Существует ряд патентов на изобретение, относящихся к кровезаменителям на основе свободного полигемоглобина. Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются кровезаменители по следующим патентам.

Патенты RU 2132687, 1999, МПК A61K 35/18, 38/42; RU 2162707, 2001, МПК A61K 38/42; RU 2341286, 2008, МПК A61K 38/42, C07K 14/805, относящиеся к препарату «Геленпол». К недостаткам препарата относится наличие в его составе большого количества тетрамерного гемоглобина, который, как известно, способен диссоциировать на димеры. Низкая молекулярная масса полигемоглобина - 150-260 кДа - еще один минус кровезаменителя. Тетрамеры и димеры, а также полигемоглобин, в составе которого до пяти тетрамеров гемоглобина, в значительно большей степени способны вызывать вазоконстрикцию и нефротоксический эффект, по сравнению с молекулами полигемоглобина с молекулярной массой 320 кДа и выше (Nishide H. Facilitated oxygen transport with modified and encapsulated hemoglobins across non-lowing solution membrane / H.Nishide [et al] // Artif. Cells. Blood Substit. Immobil. Biotechnol. - 1997. - Vol.25. - №4. - P.335-346; Tsai S. Enhancement of erythrocyte sedimentation rate by polymerized hemoglobin / S.Tsai, Wong J.Tze-Fei // Artif. Cells. Blood Substitut. and Immobilizat. Biotechnol. - 1996. - Vol.24. - № 5. - P.513-523). Низкомолекулярный полигемоглобин будет быстро выведен из кровообращения, что не позволит выполнить ему газотранспортную функцию. Кроме того, препарат «Геленпол» изготовлен в виде лиофильно высушенного порошка. При растворении такого препарата перед введением его пострадавшему в значительной степени будет происходить окисление атомов железа гемов полигемоглобина, что заметно снизит кислородтранспортную функцию кровезаменителя.

Препарат фирмы Нортфилд Лэборэтериз, Инк. (US) (RU 2203087, 2000, МПК A61K 38/42, C07K 14/805).

Недостатком кровезаменителя является низкая молекулярная масса предлагаемого полигемоглобина - 128-256 кДа. Кроме того, данный препарат получен с использованием пиридоксаль-5'-фосфата - регулятора степени связывания кислорода гемоглобином, потенциально возможное попадание которого в организм опасно в связи с его токсичностью.

Кровезаменитель фирмы BioPure Corporation, Cambridge, MA (патент US 6,506,725, МПК С07К 14/805, A61K 30/00, 2003). Недостатками кровезаменителя являются наличие в нем тетрамерного гемоглобина и высокое содержание метгемоглобина, что снижает его кислородтранспортные свойства.

Кровезаменитель ООО «Медбиофарм» (патент WO 2009116894, МПК A61K 38/42, 2009; патент RU 2361608, МПК A61K 38/42, C07K 14/805, 2009). Недостатками кровезаменителя являются низкая молекулярная масса полигемоглобина - 192-320 кДа, а также лиофильная сушка конечного продукта.

Вышеуказанные кровезаменители обладают кислородтранспортной функцией. Однако ни один из них не обладает выраженными антиоксидантными, вазодилататорными и антитромбическими свойствами.

Существуют полифункциональные кровезаменители на основе полигемоглобина с антиоксидантной функцией.

Кровезаменитель по патенту US 5,606,025 (МПК C07K 14/805, A61K 38/00, 1997) на основе полимеризованного с помощью бифункциональных агентов (в том числе и глутарового альдегида) гемоглобина человека или животных (например, быка), к которому этими же бифункциональными агентами пришиты эндогенные антиоксидантные ферменты супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза (КАТ). Недостатком данного кровезаменителя является опасность возникновения вазоконстрикции и тромбообразования у пациентов в связи с отсутствием в его составе агентов, предотвращающих эти эффекты.

Кровезаменитель по патенту US 6,747,132 (МПК A61K 38/16, С07К 14/805, 2004), который получается путем пошаговой фильтрации внутриклеточного содержимого эритроцитов так, что в результате в конечном фильтрате остаются высокоочищенные от стромальных компонентов и вирусов гемоглобин и внутриэритроцитарные ферменты СОД и КАТ. Далее в фильтрат добавляют агент (например, глутаровый альдегид), осуществляющий внутри- и межмолекулярные сшивки содержимого фильтрата, что позволяет получить комплекс полигемоглобин-СОД-КАТ, обладающий кислородтранспортной и антиоксидантной функциями. Недостатками данного изобретения являются использование пиридоксаль-5'-фосфата, а также отсутствие агентов, предотвращающих вазоконстрикцию и тромбообразование.

Таким образом, общими недостатками известных изобретений являются молекулярная масса полигемоглобина ниже 320 кДа и использование токсичного реагента пиридоксаль-5'-фосфата.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение кровезаменителя, лишенного вышеперечисленных недостатков и обладающего выраженными антиоксидантными, вазодилататорными и антитромбическими свойствами.

Технический результат заключается в получении кровезаменителя с оптимальными кислородтранспортными свойствами и сроками его функционирования в кровеносном русле, не повреждающего почки, не вызывающего агрегацию эритроцитов, а также не приводящего к нарушению осмотического давления в сосудах, обладающего антиоксидантными, вазодилататорными и антитромбическими свойствами.

Технический результат достигается тем, что полифункциональный полигемоглобин-ферментный комплекс состоит из молекул полигемоглобина различного состава с молекулярной массой в диапазоне 300-3300 кДа, полученных с использованием глутарового альдегида; в комплексе 90-99,99 % от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полиоксигемоглобина, полученные из тетрамеров бычьего оксигемоглобина (HbO₂), к которому с помощью глутарового альдегида пришиты ферменты супероксиддисмутаза и каталаза, взятые в следующем диапазоне: общее количество тетрамеров в полиоксигемоглобине:СОД равно 5:1-5·10³:1 и общее количество тетрамеров в полиоксигемоглобине:каталаза равно 5:1-5·10³:1 соответственно; в комплексе 0,009-9% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полигемоглобина, полученные из NO-производных тетрамеров бычьего гемоглобина; в комплексе 0,001-1% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полигемоглобина, полученные из тетрамеров бычьего карбоксигемоглобина; количество молекул глутарового альдегида, используемое для полимеризации белков, должно быть выше количества полимеризуемых молекул в 4-24 раза.

Для получения NO-производных гемоглобина с преимущественным содержанием гемнитрозилгемоглобина в качестве источника оксида азота (II) используют газообразный NO, растворенный в физиологическом растворе NaCl, а для получения NO-производных гемоглобина с преимущественным содержанием S-нитрозогемоглобина - S-нитрозоцистеин (Cys-NO).

Для получения карбоксигемоглобина используют газообразный СО.

Использование полигемоглобина (молекулярная масса в диапазоне 300-3300 кДа), содержащего не менее пяти тетрамеров, позволит получить кровезаменитель с оптимальными кислородтранспортными свойствами и сроком функционирования в кровеносном русле, не повреждающий почки, не вызывающий агрегацию эритроцитов, а также не приводящий к нарушению осмотического давления в сосудах (Tsai S. Enhancement of erythrocyte sedimentation rate by polymerized hemoglobin / S.Tsai, Wong J.Tze-Fei // Artif. Cells. Blood Substitut. and Immobilizat. Biotechnol. - 1996. - Vol.24. - №5. - P.513-523; Nishide H. Facilitated oxygen transport with modified and encapsulated hemoglobins across non-lowing solution membrane / H.Nishide [et al] // Artif. Cells. Blood Substit. Immobil. Biotechnol. - 1997. - Vol.25. - №4. - P.335-346). Кроме того, полигемоглобин, состоящий из пяти тетрамеров и более, в определенной степени, будет способствовать снижению эффекта вазоконстрикции, поскольку такие крупные агрегаты не будут подвержены экстравазации и взаимодействию с эндотелиальным NO, находящимся вне просвета кровеносных сосудов (Moore E.D. Blood Substitutes: The Future Is Now / E.D.Moore // J. Am. Coll. Surg. - 2003. - Vol.196. - №1. - P.1-17).

Известно, что бычий гемоглобин, в силу своих структурных особенностей, имеет низкое сродство к кислороду, близкое к таковому для донорской крови человека, поэтому нет необходимости использовать для регуляции сродства гемоглобина к О₂ биологически активный препарат пиридоксаль-5'-фосфат, который может вызывать токсичные эффекты. Кровезаменитель на основе бычьего гемоглобина будет иметь ряд преимуществ над человеческим: кровь крупного рогатого скота легко доступна в больших количествах и дешевле человеческой крови, что снижает себестоимость производства препарата; отсутствует риск заражения реципиента инфекционным гепатитом и СПИДом; сродство бычьего гемоглобина к кислороду регулируется в основном ионами хлора, которых достаточно в плазме крови человека, а сродство гемоглобина человека к O₂ регулируется молекулами 2,3-дифосфоглицерата, которые теряются в процессе очистки гемоглобина, что резко повышает сродство гемоглобина к О₂ и снижает кислородтранспортные характеристики кровезаменителя.

В качестве бифункционального сшивающего агента для получения комплекса предлагается использовать глутаровый альдегид. Количество молекул глутарового альдегида, используемое для полимеризации белков, должно быть выше количества полимеризуемых молекул в 4-24 раза.

Предлагается использование кровезаменителя на основе PolyHb, в состав которого будут также включены природные ферменты каталаза и СОД в определенных соотношениях. Поскольку в составе апобелковых частей каталазы, СОД и гемоглобина присутствуют аминокислотные остатки, боковые радикалы которых могут взаимодействовать с различными бифункциональными агентами, то эти три биомолекулы могут быть сшиты друг с другом. Это, с одной стороны, позволит каталазе и СОД достаточно длительный период функционировать в кровеносной системе, а с другой стороны, будет предотвращать аутоокисление гемов полигемоглобина, увеличение концентрации активных форм кислорода вследствие введения кровезаменителя в кровеносное русло, а также снижать оксидативный стресс, сопутствующий массивным кровопотерям и реперфузии ишемированных тканей.

Известно, что NO-производные гемоглобина (гемнитрозилгемоглобин и S-нитрозогемоглобин) в кровеносном русле могут проявлять как вазодилатирующие свойства, так и понижать агрегацию тромбоцитов (Stamler J.S. S-nitroso-albumin is the predominant bioactive form of nitric-oxide in human plasma / J.S.Stamler [et al] // Circulation. - 1992. - №86. - P.757; Wallis J.P. Nitric oxide and blood: a review / J.P.Wallis // Transfusion medicine. - 2005. - №15. - P.1-11.; Kim-Shapiro D.B. Unraveling the Reactions of Nitric Oxide, Nitrite, and Hemoglobin in Physiology and Therapeutics / D.B.Kim-Shapiro [et al] // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2006. - №26. - P.697-705). Существует патент US Pat. №7,538,193 (МПК А61К 38/42, 2009), в котором описаны способы получения и применения NO-производных гемоглобина в качестве доноров NO при гипоксиях различного происхождения. Как и NO, молекулы СО тоже обладают вазодилатирующими свойствами и ингибируют агрегацию тромбоцитов (Verma A. Carbon monoxide: a putative neural messenger / A.Verma [et al] // Science. - 1993. - V.259. - P.381-384; Zakhary R.Heme oxygenase 2: endothelial and neuronal localization and role in endothelium-dependent relaxation / R.Zakhary [et al] // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1996. - №93 (2). - P.795-798). Поэтому карбоксигемоглобин также можно вводить в состав кровезаменителя для предотвращения вазоконстрикции. Количество полигемоглобина, полученного из тетрамеров NO-производных гемоглобина, должно составлять 0,009-9% от общего количества молекул полигемоглобина в растворе. Количество поликарбоксигемоглобина должно составлять 0,001-1% от общего количества молекул полигемоглобина в растворе.

Для придания кровезаменителю функции донора NO могут быть использованы различные NO-производные гемоглобина. Так, с одной стороны, при инкубации гемоглобина с низкомолекулярными нитрозотиолами (например, с нитроцистеином) преимущественно образуется гемоглобин, в котором молекулы NO связаны с атомами серы 93-х цистеинов β-цепей гемоглобина (S-нитрозогемоглобин или SNO-Hb) (US Pat. №7,538,193; Stamler J.S. S-nitroso-albumin is the predominant bioactive form of nitric-oxide in human plasma / J.S.Stamler [et al] // Circulation. - 1992. - №86. - P.757). Молекулы NO имеют большее сродство к SH-группам Cysβ-93 в окси-форме гемоглобина, чем в дезокси-форме, и связь NO с Cysβ-93 аллостерически регулируется концентрацией O₂. Поэтому в условиях гипоксии степень выраженности донорских свойств S-нитрозодезоксигемоглобина в отношении NO⁺ будет определяться парциальным давлением кислорода. Считается, что именно в форме NO⁺ (нитрозоний-катиона) оксид азота проявляет свои вазодилататорные свойства, при этом для его образования в реакционной среде должен присутствовать акцептор электрона, которым, в нашем случае, может быть супероксиддисмутаза (US Pat. №7,538,193; Stamler, 2009).

С другой стороны, при взаимодействии дезоксигемоглобина с газообразным NO или его раствором будет образовываться гемнитрозилгемоглобин. СОД, пришитая к такому гемнитрозилгемоглобину, способна инициировать внутримолекулярный переход NO от гемов к SH-группам Cysβ-93, образуя SNO-Hb, а также межмолекулярный переход NO на другие низкомолекулярные тиолы, содержащиеся в плазме (US Pat. №7,538,193; Stamler, 2009).

Предлагаемая нами форма выпуска препарата - полигемоглобин-ферментный комплекс, растворенный в физиологическом растворе хлорида натрия, который хранится в пластиковых контейнерах при +2+4°С в атмосфере стерильного азота.

Пример получения лабораторного образца кровезаменителя

Последовательность приготовления лабораторного образца

Согласно формуле нашего изобретения, полигемоглобины могут состоять из 5-50 тетрамеров гемоглобина. В качестве примера приведем приготовление комплекса, в котором полигемоглобины состоят из 5 тетрамеров гембелка.

Для получения полигемоглобинов различного состава необходимо приготовить исходный раствор высокоочищенного тетрамерного бычьего оксигемоглобина в изотоническом NaCl. Из него получают растворы NO-производных тетрамерного гемоглобина, а также карбоксигемоглобина. С помощью глутарового альдегида из растворов, содержащих тетрамерные молекулы оксигемоглобина, карбоксигемоглобина и NO-производных гемоглобина, получают пятитетрамерные полиоксигемоглобин, поликарбоксигемоглобин, а также полигемоглобин с NO-производными в составе. Далее к раствору с полиоксигемоглобином добавляют ферменты супероксиддисмутазу и каталазу так, чтобы общее количество тетрамеров в полиоксигемоглобине:СОД составляло 5:1 и общее количество тетрамеров в полиоксигемоглобине:каталаза составляло 5:1 соответственно. Сшивают молекулы полиоксигемоглобина с ферментами супероксиддисмутазой и каталазой с помощью глутарового альдегида. Далее получают смесь, в которой 90% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полиоксигемоглобин-СОД-каталаза, 9% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полигемоглобина с NO-производными гемоглобина в составе, 1% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы поликарбоксигемоглобина. Готовый образец хранят при температуре +2+4°С в герметичной емкости в атмосфере стерильного азота.

Получение оксигемоглобина. Для получения оксигемоглобина брали стабилизированную кровь крупного рогатого скота, центрифугированием при 855 g осаждали эритроциты, отмывали эритроциты физиологическим раствором NaCl, лизировали эритроциты дистиллированной водой для инъекций, осаждали строму центрифугированием при 9500 g. Надосадочную жидкость отбирали и последовательно фильтровали от остатков стромы с помощью фильтров с диаметром пор от 50 до 0,1 мкм. Далее раствор пропускали через мембраны, отсекающие вещества с молекулярной массой более 100 и 70 кДа. В растворе, прошедшем через фильтр, содержался в основном тетрамерный гемоглобин. Полученный раствор пропускали через мембрану с размерами пор 50 кДа. В оставшемся перед мембраной концентрате был очищенный тетрамерный оксигемоглобин. Для приготовления препарата кровезаменителя использовали стерильный изотонический раствор NaCl.

Концентрацию оксигемоглобина определяли спектрофотометрически по следующей формуле:

где [HbO₂] - концентрация оксигемоглобина, моль/л; А₅₇₆, A₅₆₀, A₅₄₀ - значения поглощения исследуемого раствора оксигемоглобина при длинах волн 576, 560 и 540 нм соответственно (Столяр О.Б. Молекулярные основы кислородной диссоциации оксигемоглобина кролика при действии рентгеновского излучения в дозе 600 р / О.Б.Столяр [и др.] // Молекулярные механизмы биологического действия ионизирующих излучений. - Львов, 1979. - С.64-75).

NO-производные гембелка получали, используя в качестве источников NO или нитроцистеин (Cys-NO), или раствор стерильного изотонического NaCl, насыщенный газообразным NO высокой чистоты (объемная доля NO в баллоне >99,85 %).

Нитроцистеин получали по методу, описанному в работе Монгина и соавт. (Монгин А.А. Деполяризация изолированных нервных окончаний мозга донорами окиси азота: мембранные механизмы / А.А.Монгин [и др.] // Биохимия. - 1998. - Т.63. - вып.6. - С.787-796). Для этого на влажном льду смешивали эквимолярные количества L-цистеина и нитрата натрия (NaNO₃), затем добавляли 0,5 н соляную кислоту (HCl), при этом раствор приобретал красную окраску с максимумами поглощения при 340 и 540 нм. Раствор Cys-NO хранили в темноте на льду не более 1-го часа и непосредственно перед использованием нейтрализовали гидроксидом натрия (NaOH). В колбу с боковым отростком вносили раствор высокоочищенного HbO₂, в боковой отросток раствор Cys-NO (0,1 моль/л) в объемных соотношениях приблизительно 2:1 соответственно. Содержимое колбы вакуумировали в течение 20 минут, снижая давление до 10^-4 мм рт.ст. После этого к раствору образовавшегося дезоксигенированного гемопротеида приливали Cys-NO и инкубировали смесь при вакуумировании 10 минут. Избыток несвязавшихся молекул нитроцистеина удаляли, пропуская раствор гемоглобина через хроматографическую колонку, упакованную сефадексом G-25 (Pharmacia, Швеция). В качестве элюирующего раствора использовали стерильный изотонический раствор NaCl.

Полностью нитрозилированный газообразным NO гемоглобин получали, помещая раствор дезоксигемоглобина, полученный из высокоочищенного оксигемоглобина, в атмосферу оксида азота (II). Раствор дезоксигемоглобина с заданной концентрацией получали вакуумированием в герметичном кварцевом тонометре.

Раствор дезоксигемоглобина инкубировали в атмосфере NO в течение 10 мин при комнатной температуре, постоянно перемешивая.

Образование NO-производных гемоглобина контролировали спектрофотометрически по наличию характерных максимумов поглощения.

Карбоксигемоглобин получали прокачиванием через раствор высокоочищенной оксиформы гембелка монооксида углерода из баллона. Степень взаимоперехода лигандных форм гембелка контролировали спектрофотометрически на основании регистрации электронных спектров поглощения образцов в видимом диапазоне длин волн.

Молекулы полигемоглобинов (PolyHb) получали следующим образом: к раствору оксигемоглобина, карбоксигемоглобина и NO-производных гемоглобина добавляли глутаровый альдегид в соотношении молекул 1:16. Образцы инкубировали 3,5 часа при +4°С. Реакцию завершали добавлением водного раствора боргидрида натрия (рН 8-9). Молекулы PolyHb очищали методом колоночной гель-хроматографии с использованием сефадекса G-200 (Pharmacia, Швеция). В качестве элюирующего раствора использовали изотонический раствор NaCl.

Образование поперечных сшивок между молекулами полиоксигемоглобина, супероксиддисмутазы и катализы осуществляли путем добавления к растворам полиоксигемоглобина глутарового альдегида (соотношение молекул 1:16) и растворов ферментов. Образцы инкубировали в течение 3,5 ч при +4°С (D`Agnillo F. Polyhemoglobin-superoxide dismutase-catalase as a blood substitute with antioxidant properties / F.D`Agnillo, T.M.Chang // Nat. Biotechnol. - 1998. - Vol.16. - №7. - P.667-671). Реакцию завершали добавлением водного раствора боргидрида натрия (рН 8-9).

Полифункциональный полигемоглобин-ферментный комплекс, состоящий из молекул полигемоглобина различного состава с молекулярной массой в диапазоне 300-3300 кДа, полученных с использованием глутарового альдегида; в комплексе 90-99,99% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полиоксигемоглобина, полученные из тетрамеров бычьего оксигемоглобина (HbO₂), к которому с помощью глутарового альдегида пришиты ферменты супероксиддисмутаза и каталаза, взятые в следующем диапазоне: общее количество тетрамеров в полиоксигемоглобине: СОД равно 5:1-5·10³:1 и общее количество тетрамеров в полиоксигемоглобине: каталаза равно 5:1-5·10³:1 соответственно; в комплексе 0,009-9% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полигемоглобина, полученные из NO-производных тетрамеров бычьего гемоглобина; в комплексе 0,001-1% от общего числа молекул полигемоглобина составляют молекулы полигемоглобина, полученные из тетрамеров бычьего карбоксигемоглобина; количество молекул глутарового альдегида, используемое для полимеризации белков, должно быть выше количества полимеризуемых молекул в 4-24 раза.