Применение слитого полипептида, содержащего белок mecp2 и домен трансдукции белка, фармацевтическая композиция, содержащая такой белок, и способ лечения и/или профилактики связанного с развитием нервного заболевания

Применение слитого полипептида, содержащего белок mecp2 и домен трансдукции белка, фармацевтическая композиция, содержащая такой белок, и способ лечения и/или профилактики связанного с развитием нервного заболевания

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к белку МеСР2 и его применению в белковой заместительной терапии. Более конкретно, это изобретение относится к кодон-оптимизированным последовательностям нуклеиновых кислот для экспрессии белка MeCP2, способам создания такой последовательности нуклеиновой кислоты и экспрессии такого белка, слияниям белка этого изобретения с доменом трансдукции и векторам и клеткам-хозяевам, содержащим белок этого изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к применениям нуклеиновых кислот или белков настоящего изобретения в медицине, фармацевтическим композициям, содержащим последовательности нуклеиновых кислот и белки настоящего изобретения, а также способам лечения, профилактики и/или терапии нейродегенеративных или связанных с развитием нервных заболеваний, в том числе синдрома Ретта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Синдром Ретта (RTT) является прогрессирующим, связанным с развитием нервным нарушением. Он поражает почти исключительно женщин (Rett, 1966, Wien Med Wochenschr 116:723-6) и является одной из наиболее частых причин задержки умственного развития у женщин. RTT характеризуется динамически клиническим течением болезни с четырьмя последовательными стадиями. Во время Стадии I (возраст 6-18 месяцев) девочки прекращают приобретение новых навыков; они проявляют замедление роста головы и признаки аутизма, такие как эмоциональный уход в себя (замыкание в себе) и уменьшенный зрительный контакт. В Стадии II (возраст 1-4 года) пораженные дети теряют приобретенные навыки, такие как речь и целевое использование рук. Они развивают неравномерный характер дыхания, атаксию/апраксию туловища и походки и стереотипичные движения рук. Приблизительно у половины девочек развиваются также судороги, и некоторая стабилизация болезни имеется во время Стадии III (возраст 4-7 лет). Судороги становятся менее частыми во время Стадии IV (возраст 5-15 лет и старше), но двигательное расстройство продолжается. Гипофункция (сниженная активность), особенно среди тех, кто не может ходить, способствует частому развитию сколиоза, который может заставить девочек быть прикованными к креслу-каталке. Невропатологические признаки пациентов с синдромом Ретта включают в себя уменьшение толщины коры головного мозга, а также уменьшение размера нейронов коры головного мозга. Было описано также сильное уменьшение дендритной арборизации, но нет влияния на другие макроскопические морфологические признаки (Armstrong, 2002, Ment Retard Dev Disabil Res Rev 8:72-6). RTT представляет собой X-связанное заболевание с приближенно определенной встречаемостью 1:10000-1:15000. Amir et al. (1999) (Nat Genet 23:185-8) идентифицировали мутации в гене MECP2 в качестве причины RTT. Ген MECP2 подвержен X-инактивации. Таким образом, гетерозиготные мутантные женщины являются мозаичными в отношении недостаточности MeCP2, и это, наиболее вероятно, является одним из модулирующих факторов, влияющих на фенотип этого заболевания. Были идентифицированы мужчины, удовлетворяющие клиническим критериям синдрома Ретта, в ассоциации с кариотипом 47,XXY и из постзиготных мутаций MECP2, приводящих к соматической мозаичности (мозаицизму). В качестве ссылки, см. L. S. Weaving et al.: Journal of Medical Genetics 2005; 42:1-7; и G. Miltenberger-Miltenyi, F. Laccone: Human Mutation 2003 Volume 22, Issue 2; 107-115.

Ген MECP2 локализован на длинном плече хромосомы Х в положении Xq28 (Adler 1995, Mamm Genome 6(8):491-2). Этот ген охватывает 76 т.п.н. и состоит из четырех экзонов. Ген MECP2 кодирует белок, названный метил-СрG-связывающим белком 2 (MeCP2), причем считается, что он играет центральную роль в сайленсинге других генов. Белок MeCP2 имеет две изоформы, MeCP2 e1 и MeCP2 e2, ранее называемые MeCP2B и MeCP2A, соответственно (Mnatzakanian et al. 2004, Nat Genet 36:339-41). Изоформа e1 состоит из 498 аминокислот, а изоформа e2 имеет длину 486 аминокислот. Изоформа e1 имеет отдельный, состоящий из 21 аминокислоты, пептид на N-конце, включающий в себя участки полиаланина и полиглицина. мРНК варианта MECP2 e1 имеет в 10 раз большую экспрессию в головном мозге, чем мРНК MECP2 e2, и она является наиболее часто встречающейся изоформой белка в головном мозге мыши и человека. MeCP2 является часто встречающимся белком млекопитающих, который селективно связывает остатки 5-метилцитозина в симметрично расположенных динуклеотидах. CpG-динуклеотиды предпочтительно локализованы в промоторных районах генов. Они представляют один из элементов регуляции генов, являющихся мишенью факторов сайленсинга транскрипции после метилирования ДНК.

Еще неизвестно успешное лечение для улучшения неврологического исхода индивидуумов с синдромом Ретта. Согласно спектру мутаций MECP2 в человеке (Lam et al. 2000, J Med Genet 37(12):E41; Lee et al. 2001, Brain Dev 23:S138-43) и результатам из RTT-мыши, всеми признается, что синдром Ретта обусловлен потерей функции MeCP2. Эффективная стратегия, нацеленная на восстановление активности MeCP2, должна быть способна компенсировать потерю функции MeCP2 в недостаточных нервных клетках. В отношении ссылки, см. L. S. Weaving et al.: Journal of Medical Genetics 2005; 42:1-7; и G. Miltenberger-Miltenyi, F. Laccone: Human Mutation 2003, Volume 22, Issue 2; 107-115.

Schwarze et al. (1999, Science 285:1569-1572) сообщают, что можно доставлять биологически активные макромолекулы в живые клетки с использованием домена ТАТ (белка-трансактиватора транскрипции вируса-1 иммунодефицита человека). Они показывают получение рекомбинантного белка TAT-β-галактозидазы и его инъекцию внутрибрюшинно в мышей. Они обнаружили, что этот слитый белок распределялся во все ткани, в том числе в головной мозг, и этот слитый белок был биологически активным.

WO 00/62067 (Dowdy et al.) сообщает о применении молекул трансдукции белка (PTD), включающих в себя домены белка ТАТ для нацеливания терапевтических молекул в нервной системе.

Продуцирование белков в гетерологичных системах экспрессии (т.е. белка человека в Escherichia coli) требует соответствующего экспрессирующего вектора и кДНК-последовательности представляющего интерес гена. 64 кодона (триплетов нуклеотидов) генетического кода кодируют 20 аминокислот и три стоп-сигнала трансляции. Таким образом, генетический код является избыточным, и это означает, что некоторые аминокислоты кодируются более чем одним кодоном. Метионин и триптофан являются единственными аминокислотами, кодируемыми одним кодоном, ATG и TGG, соответственно, тогда как аргинин, лейцин и серин, каждый, кодируются шестью синонимичными кодонами. Вследствие вырожденности генетического кода, многие альтернативные последовательности нуклеиновых кислот кодируют один и тот же белок. Эти неоднозначности кодонов могут сильно влиять на экспрессию гетерологичных белков (Kane, 1995, Curr Opin Biotechnol 6(5):494-500). Частота использования кодона была идентифицирована как единственный наиболее важный фактор в экспрессии прокариотических генов (Lithwick, 2003, Genome Res 13 (12):2665-2673).

Одной целью авторов настоящего изобретения является обеспечение конструкций, кодирующих биологически активные белки MeCP2, которые способны входить в клетки нервной системы и компенсировать потерю функции MeCP2 пораженных нервных клеток.

Терапевтический подход с использованием доставки ТАТ-рекомбинантных белков в головной мозг мог бы иметь огромное преимущество возможного быстрого перехода от модели животных к пациентам. Дополнительными преимуществами могут быть применение легко контролируемой дозы такого белка, очень высокая эффективность доставки, отсутствие проблем, присущих потенциально инсерционному мутагенезу или клинических побочных эффектов вследствие иммунологической реакции против вирусных белков, которые возникают в случае подхода с использованием генной терапии. Подход с доставкой PTD-белка и его дополнительное развитие могут сделать возможным лечение нейрогенетических и изнуряющих заболеваний, таких как синдром Ретта.

Поскольку попытки экспрессии конструкций белка MeCP2 с использованием кДНК-последовательности человека в количествах, достаточных для терапевтических целей, были до сих пор безуспешными, другой целью настоящего изобретения является обеспечение экспрессионной конструкции MeCP2, которая делает возможной увеличенное продуцирование рекомбинантного белка MeCP2.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок MeCP2 или биологически активный фрагмент или производное указанного белка или фрагмента, как определено в формуле изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду, кодируемому молекулой нуклеиновой кислоты, вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, и клетке-хозяину, содержащему вектор, как определено в формуле изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, определенный в формуле изобретения, а также способ получения полипептида, определенный в формуле изобретения. Кроме того, обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты и/или полипептид, в соответствии с формулой изобретения. Настоящее изобретение относится также к способу лечения и применению этих молекул нуклеиновых кислот и/или полипептидов для применения в медицинских курсах лечения, описанных в формуле изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЭТОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение решает давно поставленную задачу предоставлением средств и путей обеспечения рекомбинантных белков MeCP2, которые могут быть использованы в терапии нейродегенеративных и связанных с развитием нервных заболеваний. Авторы изобретения обнаружили, что посредством конструирования и создания оптимизированных последовательностей нуклеиновых кислот MeCP2, впервые можно обеспечивать белки MeCP2, а также фрагменты или производные таких белков или фрагментов, которые могут быть использованы для способов белковой заместительной терапии в млекопитающих.

В первом аспекте, настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок MeCP2 или биологически активный фрагмент или производное этого белка или фрагмента, где эта последовательность нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для экспрессии в гетерологичной клетке.

“Белок MeCP2", в данном контексте, может быть изоформой е1 человека (иначе называемой изоформой B), имеющей номер доступа AAS55455, или изоформой е2 человека (иначе называемой изоформой А), имеющей номер доступа NP_004983 (базы данных последовательностей белков NCBI), соответственно. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что другие изоформы белков MeCP2 или MeCP2 человека, происходящие из других позвоночных, будут также пригодны в качестве белков MeCP2 настоящего изобретения, если эти белки или их фрагменты обнаруживают сходную биологическую активность с биологической активностью известных изоформ MeCP2 человека. Квалифицированный в данной области специалист может легко получить последовательности вышеупомянутых изоформ и их соответствующих мРНК из публично доступных баз данных.

Термин “биологически активный фрагмент”, в данном контексте, относится к полипептиду из по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150 или по меньшей мере 200 аминокислот белка MeCP2. Фрагмент белка MeCP2 содержит меньше аминокислот, чем любой из полноразмерных белков MeCP2, которые могут быть найдены под номером доступа AAS55455 или под номером доступа NP_004983, соответственно. Биологически активный фрагмент все еще проявляет биологическую активность природно-встречающегося белка, из которого он получен, хотя и необязательно в той же самой степени.

“Производное” белка MeCP2 является полипептидом, который не кодируется как таковой геномом встречающихся в природе видов. В частности, производное является полипептидом, который не является идентичным одному из полипептидов, имеющих номера доступа любой из вышеупомянутых изоформ MeCP2. Таким образом, производное содержит модификацию встречающихся в природе белков MeCP2, например, посредством замены, делеции и присоединения аминокислот, но все еще проявляет биологическую активность встречающегося в природе белка, хотя необязательно в той же самой степени. Производное включает в себя молекулы, содержащие районы, которые являются гомологичными белку MeCP2, имеющими по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичность на протяжении аминокислотной последовательности идентичного размера, когда эти две сравниваемые последовательности сопоставляют с использованием компьютерной программы гомологии, известной в данной области, такой как, например, программа “BLAST”, которая доступна публично на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Фрагмент производного белка MeCP2 содержит меньше аминокислот, чем производное белка MeCP2, определенное выше.

“Биологически активный” фрагмент или “биологически активное” производное белка или фрагмента означает, что этот фрагмент или это производное имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% биологической активности белка MeCP2, определенного выше. Является ли белок или фрагмент или производное MeCP2 биологически активным, можно определить, например, при помощи следующих тестов:

1. Белок MeCP2, или фрагмент, или производное считается биологически активным, если он способен связываться с метилированными цитозинами и/или индуцировать прямой рекрутинг HDAC и/или изменять состояние ацетилирования гистона H3 и гистона H4. Обычный тест включает в себя культивирование фибробластов мышей Mecp2^y/- (доступных от Jackson Laboratory под B6.129P2(C)-Mecp2^tml.lBird/J) и мышей дикого типа из задней конечности/кончиков хвоста, например, установленное в соответствии с протоколом, описанным в 3.1 экспериментального раздела, приведенного ниже.

Обычно, среда будет заменена и затем эти клетки будут инкубироваться в течение недели при 37°С с 10% CO₂. Для тестирования на биологическую активность, например, мониторингом состояния ацетилирования гистона Н3 и гистона Н4 фибробласты мыши Mecp2^y/- обрабатывают, например, 300 пмоль белка MeCP2 или фрагмента или производного белка MeCP2 или фрагмента, слитого с доменом трансдукции, таким как домен ТАТ или другие домены трансдукции, описанные ниже, и инкубируют, например, в течение 30 часов. Затем лизаты клеток иммуноблоттируют с антителом против, например, гистона Н3, ацетилированного гистона Н3 или ацетилированного H4K16, как описано ниже. Различие состояния ацетилирования между обработанными и необработанными фибробластами определяют количественно денситометрическим анализом, как представлено, например, на фиг. 5С, и, следовательно, квалифицированный в данной области специалист будет способен определить изменение в состоянии ацетилирования гистонов. Примеры 5, 6 и 8.1 в комбинации с фигурой 3 С-D и фигурой 5 ниже показывают путь выполнения и оценки таких анализов.

2. Другой возможностью тестирования на биологическую активность белка MeCP2 или фрагмента или производного белка MeCP2 или фрагмента является измерение уровня ацетилирования Н3, индуцированного экспериментами по трансдукции, проводимыми с белками, подлежащими тестированию, слитыми с доменами трансдукции белков, как описано ниже. Для этой цели могут быть использованы обычно доступные клеточные линии, такие как HeLa или NIH 3T3. При помещении этих клеток в контакт со слитыми белками, уровень ацетилирования гистона Н3 будет уменьшаться в сравнении с линией контрольных клеток, которые имеют нормальный уровень ацетилирования гистона Н3. Это уменьшение можно использовать для количественного определения биологической активности продуцируемого белка. Оценка этого теста, например, способы Вестерн-блоттинга, описана в экспериментальном разделе ниже.

3. Белки MeCP2 или фрагменты или производные таких белков могут быть определены как биологически активные по их способности связываться с метилированными цитозинами, например, при помощи анализов транскрипции in vitro, таких как описанные в Nan, X et al., Cell 88: 471-481 (1997), в Yusufzai T.M. and Wolffe, A.P., Nucl. Acids Res. 28: 4172-4179 (2000) или Yu F. et al., Nucl. Acids Res. 29(21):4493-501 (2001).

Термин “кодон-оптимизированная” последовательность нуклеиновой кислоты относится, в данном контексте, к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны, которые сконструированы таким образом, чтобы было возможно использование кодонов, предпочтительных для желаемых клеток-хозяев, предпочтительно для клетки-хозяина E. coli. Последовательность нуклеиновой кислоты превращают в кодон-оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую идентичную транслируемую полипептидную последовательность, но с альтернативной частотой использования кодонов, в частности, с использованием наиболее часто кодонов данного организма, например, Escherichia coli. Такой способ называют «обратной трансляцией». Способ отбора и приготовления кодон-оптимизированных последовательностей нуклеиновых кислот и выполнение обратной трансляции включает, например, использование данных из гена Класса II из Henaut and Danchin: Analysis and Predictions from Escherichia coli sequences in: Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2, Ch. 114:2047-2066, 1996, Neidhardt FC ed., ASM press, Washington, D.C. Руководство в отношении обратной трансляции конкретной белковой последовательности дается также в инструментах, доступных на http://www.prodoric.de/JCat (Grote A. et al., Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Web Server issue doi:10.1093/nar/gki376, W526-W531) или программном обеспечении Vector NTI (Invitrogen). Способ создания кодон-оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты белка MeCP2 включает в себя идентификацию кодонов в природно-встречающейся последовательности гена MECP2, которые обычно не ассоциированы с высокой экспрессией генов E. coli, и замену их кодонами, о которых известно, что они широко используются в экспрессии генов E. coli. Кодон-оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты может обнаруживать улучшенную экспрессию в сравнении с встречающейся в природе последовательностью в желаемой клетке-хозяине. Будет ли кодон-оптимизированная последовательность индуцировать улучшение в продуцировании этого белка в сравнении с неоптимизированной последовательностью, может быть испытано квалифицированным в данной области специалистом в связи с данным описанием. Пример того, как сконструировать и создать кодон-оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, представлен в экспериментальном разделе ниже.

“Гетерологичной” клеткой называют в данном контексте клетку, экспрессирующую ген, который не является встречающимся в природе геном этой конкретной клетки.

В предпочтительном варианте осуществления, белок MeCP2 или биологически активный фрагмент или производное этого белка или фрагмента происходят из человека. Более конкретно, белок MeCP2 или биологически активный фрагмент или производное этого белка или фрагмента могут быть изоформой е1 MeCP2 человека или изоформой е2 MeCP2 человека или биологически активным фрагментом или производным этих изоформ или этих фрагментов. Квалифицированному в данной области специалисту будет ясно, что другие биологически активные изоформы MeCP2 человека или не из человека или их биологически активные фрагменты или производные этих изоформ или фрагментов могут быть также использованы в качестве белков MeCP2 этого изобретения.

В другом варианте осуществления, эта первая последовательность нуклеиновой кислоты, определенная в формуле изобретения, имеет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, в частности, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с ДНК-последовательностью кодон-оптимизированной изоформы е1 MeCP2 человека (SEQ ID NO:1) или кодон-оптимизированной изоформы е2 MeCP2 человека (SEQ ID NO:2). Предполагается также 100% идентичность последовательности. Молекула нуклеиновой кислоты имеет “по меньшей мере × % идентичность” c SEQ ID Nо: 1 или SEQ ID Nо: 2, если при сопоставлении рассматриваемой последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью наилучшего соответствия SEQ ID Nо: 1 или SEQ ID Nо: 2, идентичность последовательности между двумя сопоставленными последовательностями равна по меньшей мере × %. Такое сопоставление может быть выполнено публично доступной компьютерной программой гомологии, такой как программа “BLAST”, обеспеченная на собственной странице NCBI на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Хотя нефункциональные полипептиды MeCP2, или фрагменты, или производные могут быть применимы, например, для диагностических целей, для терапевтических целей желательными являются биологически функциональные белки или фрагменты или производные. Биологическая активность такого полипептида может быть определена вышеописанными анализами.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления, молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения экспрессируется в прокариотической клетке, в частности, в грамотрицательной или грамположительной клетке, например, в клетках E. coli или Bacillus sp. Прокариотические клетки, подходящие для экспрессии молекул нуклеиновых кислот, например, грамотрицательные или грамположительные бактерии, известны в данной области. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что другие хорошо известные системы экспрессии могут быть использованы для достижения экспрессии белков из молекул нуклеиновых кислот этого изобретения. Такие подходящие клетки могут быть клетками не человека внутри или вне тела животного или клеткой человека вне тела человека. Примерами являются клетки млекопитающих, такие как клетки НЕК, клетки HeLa, клетки СНО и другие. Примерами клеток, не происходящих из млекопитающих или даже не происходящих из позвоночных, являются клетки Шнайдера дрозофилы, другие клетки насекомых, такие как клетки Sf9, клетки дрожжей, другие грибные клетки, и другие.

В другом варианте осуществления, это изобретение обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты этого изобретения, которая дополнительно содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий домен трансдукции белка, где эта вторая последовательность находится в функциональной связи с первой последовательностью нуклеиновой кислоты. Конкретно, молекула нуклеиновой кислоты, содержащая первую и вторую последовательности нуклеиновой кислоты согласно этому изобретению, выбрана из любой из последовательностей SEQ ID Nо: 50 или SEQ ID Nо: 51.

Домены трансдукции белка являются районами белка с высокой плотностью положительных зарядов и способны пересекать биологические мембраны неклассическими путями. Эти районы обычно имеют длину, меньшую чем 30 аминокислот, и требуют их основного характера и, следовательно, их свойств трансдукции на основании высокого содержания аргинина и, в меньшей степени, лизина; делается ссылка, например, на Mol. Cell Proteomics. 2004, 3 (8): 746-69. Домен трансдукции может быть получен из любого белка или его части, которые могут способствовать вхождению в клетку другого белка, слитого с доменом трансдукции. Способность домена трансдукции к трансдукции белка в клетку может быть определена любым общепринятым способом мониторинга поглощения белка клетками, обычно FACS-сортингом или различными микроскопическими способами, такими как флуоресцентная микроскопия. Домены трансдукции белков, способные трансдуцировать сопряженный полипептид, могут быть получены, например, из белка-трансактиватора транскрипции вируса-1 иммунодефицита человека (ТАТ-белка, с номером доступа AAQ86751), гомеодомена Antennapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem., 269: 10444 (1994) и HSVVP22 (Elliot and O'Hare, Cell, 88: 223 (1997)), или других доменов трансдукции белков, таких как участки полиаргининов (8-10) (в отношении обзора см. Jones S.W. et al., Br. J. Pharmacol. (2005) 145(8):1093-1102), или синтетического пептида PTD4 (описанного в Ho A. et al., Cancer Res. (2001) 15; 61(2):474-477). В предпочтительном варианте осуществления, домен трансдукции белка получен из белка ТАТ (белка-трансактиватора лентивирусов, например, ВИЧ). Еще более предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая домен трансдукции белков, кодирует аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, в частности, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью домена трансдукции белка TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID Nо: 54). Аминокислотная последовательность имеет “по меньшей мере × % идентичность” c SEQ ID Nо: 54, если при сопоставлении рассматриваемой аминокислотной последовательности с последовательностью наилучшего соответствия SEQ ID Nо: 54, идентичность последовательности между двумя сопоставленными последовательностями равна по меньшей мере × %. Такое сопоставление может быть выполнено публично доступной компьютерной программой гомологии, такой как программа “blastp”, обеспеченная на собственной странице NCBI на http://www.ncbi.nhn.nih.gov/BLAST/. Однако квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что в качестве домена трансдукции белков может быть также использован более длинный фрагмент белка ТАТ.

Термин в “функциональной связи” означает в данном контексте конфигурацию последовательностей нуклеиновых кислот настоящего изобретения, в которой одна последовательность помещена в положении относительно другой последовательности таким образом, что эти последовательности нуклеиновых кислот, после связывания, находятся в такой ориентации, что рамка трансляции кодируемых полипептидов не изменяется (т.е. эти молекулы нуклеиновых кислот связаны одна с другой «в рамке считывания»). Таким образом, полученная молекула нуклеиновой кислоты кодирует слитый белок в рамке считывания. Для достижения этого, последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть организованы несколькими путями. Одна последовательность нуклеиновой кислоты может быть помещена при N-конце или при С-конце другой последовательности, либо связанной непосредственно, либо отделенной дополнительными линкерными нуклеиновыми кислотами, которые также находятся в рамке считывания с последовательностями нуклеиновых кислот этого изобретения. Предполагается также, что одна последовательность нуклеиновой кислоты является встроенной в последовательность другой нуклеиновой кислоты, при условии, что рамка считывания кодируемого полипептида остается интактной. Если желательно, чтобы последовательность, в которую помещена инсерция, все еще кодировала функциональный полипептид, биологическая активность рассматриваемого полипептида может оцениваться в соответствии с описанными в настоящем изобретении тестами.

Связывание последовательностей нуклеиновых кислот настоящего изобретения может быть достигнуто стандартными способами лигирования манипуляции ДНК, описанными в экспериментальном разделе настоящего изобретения и, например, Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Обсуждается также другой способ лигирования, например, химическое лигирование.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает третью последовательность нуклеиновой кислоты в функциональной связи с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты или (ii) первую и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, где эта третья последовательность кодирует одну или несколько полипептидных последовательностей, подходящих для очистки белка. Конкретно, полипептидные последовательности, подходящие для очистки белка, включают в себя, но не ограничиваются ими, strep-метку и/или his-метку и/или GST-метку и/или интеиновую метку. Такие метки облегчают очистку белка аффинной хроматографией и хорошо известны в данной области (в отношении ссылки см., например, Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 60(5):523-533). Эта третья последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей первую последовательность нуклеиновой кислоты или первую и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. помещена в положении либо на N-конце, либо на С-конце либо первой, либо второй последовательности нуклеиновой кислоты. Если (1) означает первую последовательность нуклеиновой кислоты, (2) означает вторую последовательность нуклеиновой кислоты и (3) означает третью последовательность нуклеиновой кислоты, возможные пути помещения этих последовательностей включают в себя (1)-(2)-(3), (1)-(3)-(2), (2)-(1)-(3), (2)-(3)-(1), (3)-(1)-(2) или (3)-(2)-(1). Эти последовательности нуклеиновых кислот либо могут быть лигированы друг с другом непосредственно, либо могут быть отделены друг от друга дополнительными линкерными нуклеиновыми кислотами. Лигирование с линкером или без линкера выполняют таким образом, чтобы привести все три последовательности нуклеиновых кислот в рамку считывания относительно друг друга и чтобы полученная молекула нуклеиновой кислоты кодировала слитый белок. Предполагается также, что одна последовательность нуклеиновой кислоты встроена в другую последовательность нуклеиновой кислоты, при условии, что рамка считывания кодируемого полипептида остается интактной. Если желательно, чтобы последовательность, в которую помещена инсерция, все еще кодировала функциональный полипептид, биологическая активность рассматриваемого полипептида может оцениваться в соответствии с описанными здесь тестами.

В дополнительном варианте осуществления, молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может дополнительно содержать четвертую последовательность нуклеиновой кислоты в функциональном связывании с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты или (ii) первую и вторую последовательность нуклеиновой кислоты или (iii) первую и вторую и третью последовательность нуклеиновой кислоты, причем указанная четвертая последовательность кодирует один или несколько репортерных полипептидов. Подходящие репортерные полипептиды или репортерные молекулы делают возможными визуализацию и/или локализацию слитого полипептида, например, оптическими способами, такими как флуоресцентная микроскопия. Примерами подходящих репортерных полипептидов являются флуоресцентные белки, такие как GFP, CFP и YEP, или ферменты, способные образовывать детектируемую метку во вторичной реакции, такие как пероксидаза хрена, люцифераза или β-галактозидаза. Вместо репортерного полипептида, квалифицированный в данной области специалист будет также рассматривать мечение слитого белка этого изобретения другой детектируемой меткой, такой как флуоресцентные или люминесцентные органические молекулы (например, флуоресцеин, FITC или Cy5), или радиоактивной меткой.

Четвертая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей первую последовательность нуклеиновой кислоты или первую и вторую последовательность нуклеиновой кислоты или первую, вторую и третью последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. помещена в положении либо на N-конце, либо на С-конце либо первой, либо второй, либо третьей последовательности нуклеиновой кислоты. Если (1) означает первую последовательность нуклеиновой кислоты, (2) означает вторую последовательность нуклеиновой кислоты и (3) означает третью последовательность нуклеиновой кислоты и (4) означает четвертую последовательность нуклеиновой кислоты, возможные пути помещения этих последовательностей включают в себя (1)-(2)-(3)-(4), (1)-(2)-(4)-(3), (1)-(3)-(2)-(4), (1)-(3)-(4)-(2). (1)-(4)-(2)-(3), (1)-(4)-(3)- (2), (2)-(1)-(3)-(4), (2)-(1)-(4)-(3), (2)-(3)-(1)-(4), (2)-(3)-(4)-(1), (2)-(4)-(1)-(3), (2)-(4)- (3)-(1), (3)-(1)-(2)-(4), (3)-(1)-(4)-(2), (3)-(2)-(1)-(4), (3)-(2)-(4)-(1), (3)-(4)-(1)-(2), (3)- (4)-(2)-(1), (4)-(1)-(2)-(3), (4)-(1)-(3)-(2), (4)-(2)-(1)-(3), (4)-(2)-(3)-(1), (4)-(3)-(1)-(2) или (4)-(3)-(2)-(1). Эти последовательности нуклеиновых кислот либо могут быть лигированы друг с другом непосредственно, либо могут быть отделены друг от друга дополнительными линкерными нуклеиновыми кислотами. Лигирование с линкером или без линкера выполняют таким образом, чтобы привести все четыре последовательности нуклеиновых кислот в рамку считывания относительно друг друга и чтобы полученная молекула нуклеиновой кислоты кодировала слитый белок. Предполагается также, что одна последовательность нуклеиновой кислоты встроена в другую последовательность нуклеиновой кислоты, при условии, что рамка считывания кодируемого полипептида остается интактной. Если желательно, чтобы последовательность, в которую помещена инсерция, все еще кодировала функциональный полипептид, биологическая активность рассматриваемого полипептида может оцениваться в соответствии с описанными здесь тестами.

В другом аспекте, это изобретение относится к полипептиду, кодируемому нуклеиновой кислотой этого изобретения. Способы получения полипептидов из молекул нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области и описаны, например, Maniatis et al (supra).

Предполагается также получение слитого полипептида химическим лигированием двух или более фрагментов полипептида этого изобретения. Способы химического лигирования обеспечивают ковалентные связи между полипептидами посредством химического сшивания. Подходящими агентами сшивания являются например, бифункциональные агенты сшивания, такие как сульфо-MBS, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS и другие агенты сшивания, доступные, например, из Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA).

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает вектор, содержащий молекулы нуклеиновых кислот в соответствии с изобретением. Таким вектором может быть плазмида, фагмида или космида. Например, молекула нуклеиновой кислоты может быть клонирована в прокариотический или эукариотический вектор способами, описанными в Maniatis et al. (supra). Предпочтительно, такой вектор способен экспрессировать полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты этого изобретения. Такие экспрессирующие векторы обычно содержат по меньшей мере один промотор и могут также содержать сигнал инициации трансляции и сигнал терминации трансляции или сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования. Подходящими экспрессирующими векторами являются, например, вектор pET28 a+, вектор pUC18 или вектор pTRI-Ex-neo1.1, описанные в примерах ниже.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор по изобретению. Такой клеткой-хозяином может быть клетка не человека внутри или вне тела животного или клеткой человека внутри или вне тела человека. Другие подходящие клетки включают в себя прокариотические клетки, в частности, грамотрицательные или грамположительные бактериальные клетки. Особенно предпочтительными являются клетки E. coli или клетки Bacillus sp. Вектор может переноситься в клетку-хозяин различными способами, хорошо известными в данной области. Способы трансфекции клеток-хозяев и культивирования таких трансфицированных клеток-хозяев, а также условия продуцирования и получения полипептидов настоящего изобретения из таких трансформированных клеток-хозяев хорошо известны в данной области и описаны, например, в Maniatis et al. (supra).

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения последовательностей нуклеиновых кислот или молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения, предусматривающему стадию (а) генерирования двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты отжигом и удлинением первого набора подходящих олигонуклеотидных праймеров, где эти праймеры содержат последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения; и (b) необязательное повторение стадии (а) со вторым, третьим или более набором подходящих олигонуклеотидных праймеров.

Подходящие олигонуклеотидные праймеры по настоящему изобретению конструируют делением представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты на перекрывающиеся олигонуклеотиды, так что эти олигонуклеотиды содержат последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Обычно диапазон перекрывания, охватываемый этими олигонуклеотидными праймерами, варьируется от 3 до 100 нуклеотидов, в частности, от 20 до 30 нуклеотид