Набор праймеров, используемый для определения дрожжей рода saccharomyces

Набор праймеров, используемый для определения дрожжей рода saccharomyces

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к набору праймеров, используемому для идентификации дрожжей рода Saccharomyces, и конкретно, к набору праймеров для LAMP и набору праймеров для ПЦР, которые используют для определения дрожжей рода Saccharomyces. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения и количественной оценки дрожжей рода Saccharomyces, в котором используется такой набор праймеров.

Уровень техники

Дрожжи рода Saccharomyces широко используются в хлебопечении, а также в производстве алкогольных напитков, таких как пиво, вино, японская рисовая водка, дистиллированные спирты и виски. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae используют в производстве алкогольных напитков, получаемых путем брожения, включая верхнебродильное пиво, такое как светлое пиво (эль), вино, японская рисовая водка и фруктовое вино, такое как сидр, а также в производстве очищенной перегонкой жидкости, такой как дистиллированные спирты и виски. Дрожжи Saccharomyces bayanus используют в производстве вина, хереса, игристого вина и т.д. Дрожжи низового брожения, используемые в производстве легкого пива высокого качества, до настоящего времени относили к виду Saccharomyces pastorianus (Kurtzman, C. P. & Fell, J. W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4^th edition, 1998, Elsevier Science, B. V., The Netherlands, Back, W.: Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl. Nuernberg, Barnett, J. A. et al.: Yeasts, characteristics and identification, 3^rd edition, 2000, Cambridge University Press, UK, Seishu Kobo/Koji Kenkyukai (Study Group for Sake Yeasts and Rice Malts): “Studies of Sake Yeasts”, 2003, Shinnihon Printing Inc., Tokyo). Таким образом, чтобы понять, являются ли дрожжи, используемые в производстве пищевых продуктов и алкогольных напитков, подходящими дрожжами, важно иметь методику идентификации штамма дрожжей рода Saccharomyces.

Однако если такие дрожжи сохраняются в отфильтрованном алкогольном напитке или они привносятся извне, то возникает избыточное брожение, что приводит к помутнению и появлению специфического привкуса. Так, такое избыточное брожение, кроме того, вызывает появление острого горького привкуса, что влияет на качество продукции. (Back, W.: Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg, European Brewery Convention: ANALYTICA-MICROBIOLOGICA-EBC, 2^nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg).

Более того, дрожжи рода Saccharomyces также могут быть выделены из безалкогольных напитков и, в частности, из фруктовых соков. Наличие дрожжей в продуктах приводит к выделению из сахаров, таких как глюкоза или сахароза, углекислого газа, этанола и к появлению неприятного привкуса, а качество продуктов вследствие этого значительно ухудшается (Back, W.: Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil II, 1999, Verlag Hans Carl, Nuernberg).

Таким образом, пролиферация дрожжей рода Saccharomyces в продуктах существенно влияет на промышленное производство. Соответственно, для контроля качества важна методика быстрого определения и/или идентификации таких дрожжей. Кроме того, если дрожжи рода Saccharomyces, выделенные из продуктов, представляют собой дрожжи, используемые в процессе производства, то делают вывод о том, что их присутствие связано с утечкой в процессе производства, недостаточной стадией фильтрации и т.д. Если дрожжи, выделенные из продуктов, привносятся извне, то делается вывод о недостаточной промывке фильтра, наличии пыли в банке и т.д. Следовательно, для решения проблем при обнаружении контаминации важна методика идентификации дрожжей, выделенных из продуктов.

Однако, с точки зрения таксономии, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces bayanus являются близкородственными видами. Вместе с несколькими другими видами дрожжей, такими как Saccharomyces paradoxus и Saccharomyces mikatae, они образуют таксономическую группу, называемую Saccharomyces sensustricto (Naumov., G. I. et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, 1931-1942). Кроме того, необходимо учитывать, что Saccharomyces pastorianus представляет собой вид, полученный путем скрещивания Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces bayanus, и на генном уровне и на хромосомном уровне было подтверждено, что Saccharomyces pastorianus представляет собой гибрид вышеуказанных видов дрожжей (Kielland-Brandt, M.C. et al.: Genetics of brewing yeast. The Yeast, 2^nd edn, vol. 6, pp. 223-254, Edited by Wheals, et al., Academic Press, New York, Ryu, S.-L. et al.: Yeast, 1996, vol. 12, 757, Tamai, Y. et al.: Yeast, 1998, vol. 14, 923-933, Tamai, Y. et al.: Yeast, 2000, vol. 16, 1335-1343). В качестве традиционных способов идентификации дрожжей используют морфологический, физиологический и биохимический способы. В частности, в большинстве случаев оценивали способность к ассимиляции и ферментации большого числа сахаров. Тем не менее, поскольку фенотипы штаммов, относящихся к таксономической группе Saccharomyces sensustricto, подобны друг другу, затруднительно такими традиционными способами отличать штаммы друг от друга (Naumova, E. S. et al.: Antonievan Leeuwenhoek, 2003, vol. 83, 155-166). В качестве молекулярно-биологических подходов для различия таких штаммов были известны ПЦР-фингерпринтинг, кинетический анализ рекомбинации ДНК/ДНК, анализ кариотипа, рестрикционный анализ митохондриальной ДНК, анализ нуклеотидной последовательности генов рРНК, рестрикционный анализ рДНК, ПЦР с универсальными праймерами, анализ изозимов, электрофорез продуктов ПЦР в геле с градиентом температуры, ПЦР в режиме реального времени и т.д.

К настоящему времени был разработан способ, который включает амплификацию части гена FLO1 дрожжей рода Saccharomyces методом ПЦР или амплификацию части гена рРНК методом ПЦР и затем идентификацию с помощью RFLP, являются ли дрожжи рода Saccharomyces дрожжами другого рода, дрожжами, используемыми в брожении, или дрожжами, используемыми в целях, отличных от брожения (выложенная публикация патента Японии № 11-56366). Кроме того, основываясь на обнаружении того, что между геном 26S рРНК и геном 5S рРНК дрожжей низового брожения существуют два типа последовательностей спейсерных областей, были разработаны наборы праймеров для проведения ПЦР, специфичные для двух типов последовательностей (выложенная публикация патента Японии № 2001-8684). Кроме того, были сконструированы праймеры, специфичные для конгенного гена Lg-FLO1, в котором N-концевой участок Lg-FLO1 лигируют с геном хромосомы IX дрожжей (выложенная публикация патента Японии № 2002-233382).

Однако, поскольку для проведения ПЦР или ПЦР в режиме реального времени необходим высокий уровень контролирования температуры и наблюдения флуоресценции, эти способы требуют дорогостоящего оборудования. Кроме того, по окончании реакции ПЦР необходимо проведение электрофореза, окрашивания, фотографирования и т.д., и, таким образом, для этого способа необходим длительный период времени после амплификации генов до получения результатов. Более того, для проведения RAPD PCR, обработки продукта амплификации рестриктазами, анализа нуклеотидной последовательности, анализа изозимов, гель-электрофореза в градиенте температуры и т.д. требуются более продолжительный период времени и более сложные операции, чем при обычной ПЦР, и поэтому эти способы оказались сложными при осуществлении в качестве ежедневных анализов микроорганизмов.

С другой стороны, Saccharomyces pastorianus обладает как субгеномом, полученным от Saccharomyces cerevisiae (Sc-тип), так и субгеномом, полученным от Saccharomyces bayanus (Lg-тип). Согласно недавним исследованиям у дрожжей низового брожения отсутствует часть правого плеча хромосомы XVI Sc-типа, часть правого плеча хромосомы III Lg-типа и часть левого плеча хромосомы VII Lg-типа (Naoyuki Umemoto et al., “Production of physical map of beer yeasts and comparative genomic science”, 24^th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (2001); Nakao et al., Proceedings of the 29^th EBC Congress (2003); Yoshihiro Nakao: Chemistry and Organisms, 2005, vol. 43, No. 9, 559-561; and Japanese Patent Laid-Open Publication No. 2004-283169). Однако в существующих условиях до сих пор не получена подробная информация относительно хромосомной транслокации Saccharomyces pastorianus.

Кроме того, был создан набор праймеров для способа LAMP (изотермальной петлевой амплификации), используемый для детекции Saccharomyces pastorianus (WO2005/093059). Однако по-прежнему существует необходимость в повышении точности определения.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения идентифицировали положения хромосомных транслокаций правого плеча хромосомы XVI, правого плеча хромосомы III и левого плеча хромосомы VII дрожжей Saccharomyces pastorianus, а также проанализировали геном вокруг этих положений транслокаций. Кроме того, на основании этой информации авторам настоящего изобретения удалось разработать набор праймеров для точного детектирования дрожжей рода Saccharomyces.

В дальнейшем в настоящем документе изобретение, относящееся к хромосомной транслокации правого плеча хромосомы XVI, обозначают как первый и второй варианты осуществления, изобретение, относящееся к хромосомной транслокации правого плеча хромосомы III, обозначают как третий вариант осуществления, а изобретение, относящееся к хромосомной транслокации левого плеча хромосомы VII, обозначают как четвертый вариант осуществления.

Первый вариант осуществления

Авторы настоящего изобретения провели геномный анализ дрожжей низового брожения, относящихся к виду Saccharomyces pastorianus, и в результате было обнаружено, что хромосома XVI Sc-типа дрожжей низового брожения транслоцируется при участии хромосомы Lg-типа по ORF гена GPH1 правого плеча, и дополнительно, что она вновь транслоцируется по ORF гена QCR2 в окончательном направлении правого плеча, таким образом, она возвращается к Sc-типу. То есть авторы настоящего изобретения обнаружили, что в области, фланкированной генами GPH1 и QCR2 правого плеча хромосомы XVI, у дрожжей низового брожения находится только нуклеотидная последовательность Lg-типа.

Авторы настоящего изобретения разработали набор праймеров для LAMP, используемый для детекции Saccharomyces pastorianus на основании последовательности (SEQ ID NO: 6) гена МЕТ16 Lg-типа, расположенного в области, фланкированной генами GPH1 и QCR2, и было обнаружено, что, используя сконструированный таким образом набор праймеров, можно точно определить Saccharomyces pastorianus. Последовательность гена МЕТ16 Lg-типа представляет собой новую последовательность, которая до сих пор не была описана ни в одной из опубликованных баз данных.

Конкретно, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к зонду или праймеру, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который состоит из полинуклеотида, состоящего по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6, или полинуклеотида, состоящего по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение также относится к набору праймеров для проведения LAMP, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который состоит из двух или более типов вышеуказанных праймеров.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение также относится к набору праймеров для проведения ПЦР, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который состоит из двух или более типов вышеуказанных праймеров.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение предпочтительно относится к набору праймеров для проведения LAMP, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который содержит следующие полинуклеотиды:

полинуклеотид (FIP) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности;

полинуклеотид (F3) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности;

полинуклеотид (BIP) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и

полинуклеотид (В3) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

На основании расположения хромосомной транслокации правого плеча хромосомы XVI дрожжей низового брожения авторы настоящего изобретения разработали набор праймеров для проведения ПЦР, используемый для детекции Saccharomyces pastorianus, и затем обнаружили, что дрожжи Saccharomyces pastorianus можно точно определить, используя этот набор праймеров.

Конкретно, в соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров для проведения ПЦР, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который содержит: полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 27 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 28 или ере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение также относится к набору праймеров для проведения ПЦР, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который содержит: полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 29 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 30 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение также относится к набору праймеров для проведения ПЦР, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, в котором один из праймеров представляет собой полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6, или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6, а другой праймер представляет собой полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью Sc-типа, которая находится вне области, фланкированной генами GPH1 и QCR2 правого плеча хромосомы XVI дрожжей низового брожения, или с комплементарной ей последовательностью.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу детекции Saccharomyces pastorianus, который включает проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом LAMP, используя набор праймеров для проведения LAMP в соответствии с первым вариантом осуществления.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение также относится к способу детекции Saccharomyces pastorianus, который включает проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом ПЦР, используя набор праймеров для проведения ПЦР в соответствии с первым вариантом осуществления.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способу детекции Saccharomyces pastorianus, который включает определение гибридного комплекса, содержащего зонд в соответствии с первым вариантом осуществления.

Второй вариант осуществления

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что у дрожжей низового брожения в области, фланкированной генами GPH1 и QCR2 правого плеча хромосомы XVI, находится только нуклеотидная последовательность Lg-типа. То есть это означает, что у Saccharomyces pastorianus или Saccharomyces bayanus в области, фланкированной генами GPH1 и QCR2 правого плеча хромосомы XVI, отсутствует нуклеотидная последовательность Sc-типа, и, таким образом, вышеупомянутая нуклеотидная последовательность Sc-типа специфична для Saccharomyces cerevisiae.

На основании последовательности гена МЕТ16 Sc-типа, расположенного в области, фланкированной генами GPH1 и QCR2, авторы настоящего изобретения разработали набор праймеров для проведения LAMP, используемый для детекции Saccharomyces cerevisiae. Авторы изобретения позднее обнаружили, что, используя данный набор праймеров, можно с высокой точностью детектировать Saccharomyces cerevisiae.

Конкретно, в соответствии со вторым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров для проведения LAMP, используемому для детекции Saccharomyces cerevisiae, который содержит следующие полинуклеотиды:

полинуклеотид (FIP) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности;

полинуклеотид (F3) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности;

полинуклеотид (BIP) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и

полинуклеотид (В3) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 10 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

В соответствии со вторым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу детекции Saccharomyces cerevisiae, который включает проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом LAMP, используя набор праймеров для проведения LAMP в соответствии со вторым вариантом осуществления.

Третий вариант осуществления

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что хромосома III Lg-типа дрожжей низового брожения транслоцируется при участии хромосомы Sc-типа по локусу МАТ правого плеча и что у дрожжей низового брожения от локуса МАТ правого плеча хромосомы III до его конца присутствует только нуклеотидная последовательность Sc-типа. То есть это означает, что, поскольку у Saccharomyces cerevisiae или Saccharomyces pastorianus на протяжении от локуса МАТ правого плеча хромосомы III до его конца отсутствует нуклеотидная последовательность Lg-типа, то нуклеотидная последовательность Saccharomyces bayanus, соответствующая этой области, специфична для Saccharomyces bayanus.

На основании последовательности гена, гомологичного RAD18, расположенного в области, находящейся между локусом МАТ и концом правого плеча хромосомы, авторы настоящего изобретения разработали набор праймеров для проведения LAMP, используемый для определения Saccharomyces bayanus. Авторы изобретения позднее обнаружили, что, используя данный набор праймеров, можно с высокой точностью детектировать Saccharomyces bayanus.

Конкретно, в соответствии с третьим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров для проведения LAMP, используемому для определения Saccharomyces bayanus, который содержит следующие полинуклеотиды:

полинуклеотид (FIP) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности;

полинуклеотид (F3) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности;

полинуклеотид (BIP) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и

полинуклеотид (В3) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 16 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

Авторы настоящего изобретения также разработали набор праймеров для проведения ПЦР, используемый для детекции Saccharomyces pastorianus, основываясь на положении хромосомной транслокации правого плеча хромосомы III дрожжей низового брожения. Авторы изобретения позднее обнаружили, что, используя такой набор праймеров, можно с высокой точностью детектировать Saccharomyces pastorianus.

Конкретно, в соответствии с третьим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров для проведения ПЦР, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который содержит: полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 23 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 24 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

В соответствии с третьим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу определения Saccharomyces bayanus, который включает проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом LAMP, используя набор праймеров для проведения LAMP в соответствии с третьим вариантом осуществления.

В соответствии с третьим вариантом осуществления настоящее изобретение также относится к способу определения Saccharomyces pastorianus, который включает проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом ПЦР, используя набор праймеров для проведения ПЦР в соответствии с третьим вариантом осуществления.

Четвертый вариант осуществления

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что хромосома VII Lg-типа дрожжей низового брожения транслоцируется при участии хромосомы Sc-типа по ORF гена КЕМ1, расположенного на левом плече. То есть авторы изобретения обнаружили, что у дрожжей низового брожения на протяжении от локуса КЕМ1 левого плеча хромосомы VII до конца левого плеча существует только нуклеотидная последовательность Sc-типа.

Авторы настоящего изобретения также разработали набор праймеров для проведения ПЦР, используемый для детекции Saccharomyces pastorianus, на основании положения хромосомной транслокации левого плеча хромосомы VII дрожжей низового брожения. Авторы изобретения позднее обнаружили, что, используя такой набор праймеров, можно с высокой точностью детектировать Saccharomyces pastorianus.

Конкретно, в соответствии с четвертым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров для проведения ПЦР, используемому для детекции Saccharomyces pastorianus, который содержит: полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 25 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 26 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

В соответствии с четвертым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу детекции Saccharomyces pastorianus, который включает проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом ПЦР, используя набор праймеров для проведения ПЦР в соответствии с четвертым вариантом осуществления.

С помощью наборов праймеров по настоящему изобретению дрожжи рода Saccharomyces могут быть определены с высокой точностью до вида. В частности, наборы праймеров для проведения LAMP в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом LAMP и для детекции мишеневых видов на основании наличия или отсутствия амплифицированного продукта. Таким образом, с помощью наборов праймеров для проведения LAMP по настоящему изобретению дрожжи рода Saccharomyces могут быть с высокой точностью, быстро и легко идентифицированы до вида.

С помощью наборов праймеров для проведения LAMP в соответствии с настоящим изобретением также можно измерить количество клеток, содержащихся в образце. Таким образом, с помощью наборов праймеров для проведения LAMP в соответствии с настоящим изобретением можно с точностью количественно оценить наличие Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces bayanus.

Дрожжи рода Saccharomyces представляют собой виды дрожжей, которые делают мутными различные виды напитков, такие как алкогольные и безалкогольные напитки. Таким образом, наличие или отсутствие этих видов дрожжей можно использовать в качестве одного из показателей контроля качества различных видов напитков. Соответственно, наборы праймеров в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для контроля качества различных видов напитков (например, алкогольных и безалкогольных напитков, в частности, пива, пива с низким содержанием солода (фальшивое пиво), вина) и оценки образцов окружающей среды.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана специфичность реакции с набором праймеров (LGM1LB1), используемым для детекции Saccharomyces pastorianus, в отношении определяемых мишеневых видов. Были использованы следующие штаммы: Saccharomyces cerevisiae NBRC10217, Saccharomyces bayanus NBRC11022, Saccharomyces pastorianus NBRC11024, NBRC11023 и NBRC10610, Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus DSM70487, Saccharomyces paradoxus NBRC10609, Saccharomyces cariocanus NBRC10947, Saccharomyces mikatae NBRC1815, Saccharomyces kudriavzevii NBRC 1802, Saccharomyces exiguous NBRC1128, Saccharomyces servazzii NBRC1838, Saccharomyces unisporus NBRC0316, Saccharomyces dairenensis NBRC0211, Saccharomyces kluyveri NBRC1685, Nega: без добавления геномной ДНК.

На фигуре 2 показана аппроксимированная кривая, построенная, исходя из количества колониеобразующих единиц Saccharomyces pastorianus и времени детекции способом LAMP, используя LGM1LB1. Пороговое время на горизонтальной оси координат указывает время проведения реакции, когда мутность превышает 0,1.

На фигуре 3 показана специфичность реакции с набором праймеров (SSC1LB1), используемым для детекции рода Saccharomyces, в отношении детектируемых мишеневых видов. Были использованы следующие штаммы: Saccharomyces cerevisiae NBRC10217, Saccharomyces bayanus NBRC11022, Saccharomyces pastorianus NBRC11024, NBRC11023 и NBRC10610, Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus DSM70487, Saccharomyces paradoxus NBRC10609, Saccharomyces cariocanus NBRC10947, Saccharomyces mikatae NBRC1815, Saccharomyces kudriavzevii NBRC 1802, Saccharomyces exiguous NBRC1128, Saccharomyces servazzii NBRC1838, Saccharomyces unisporus NBRC0316, Saccharomyces dairenensis NBRC0211, Saccharomyces kluyveri NBRC1685, Nega: без добавления геномной ДНК.

На фигуре 4 показана специфичность реакции с набором праймеров (SBFY1LF1LB1), используемым для детекции дрожжей низового брожения, в отношении детектируемых мишеневых видов. Были использованы следующие штаммы: Saccharomyces cerevisiae NBRC10217, Saccharomyces bayanus NBRC11022, Saccharomyces pastorianus NBRC11024, NBRC11023 и NBRC10610, Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus DSM70487, Saccharomyces paradoxus NBRC10609, Saccharomyces cariocanus NBRC10947, Saccharomyces mikatae NBRC1815, Saccharomyces kudriavzevii NBRC 1802, Saccharomyces exiguous NBRC1128, Saccharomyces servazzii NBRC1838, Saccharomyces unisporus NBRC0316, Saccharomyces dairenensis NBRC0211, Saccharomyces kluyveri NBRC1685, Nega: без добавления геномной ДНК.

Подробное описание изобретения

Праймеры и наборы праймеров

Набор праймеров для проведения LAMP в соответствии с настоящим изобретением состоит из 4 типов праймеров, обозначаемых FIP, F3, BIP и B3. Эти праймеры соответствуют 6 областям мишеневой нуклеотидной последовательности. Конкретно, области F3c, F2c, F1c, В1, В2 и В3 определяются в данном порядке от 3'-конца до 5'-конца мишеневой нуклеотидной последовательности. Далее, принимая во внимание данные 6 областей, создают 4 типа праймеров, обозначаемых FIP, F3, BIP и B3. В данном документе областями, комплементарными областям F3c, F2c и F1c, являются F3, F2 и F1 соответственно. Кроме того, областями, комплементарными областям В1, В2 и В3, являются В1с, В2с и В3с соответственно.

FIP представляет собой праймер, созданный таким образом, что он имеет область F2, комплементарную области F2c мишеневой последовательности на 3'-концевой стороне, и имеет последовательность, аналогичную последовательности области F1c мишеневого гена на 5'-концевой стороне. При необходимости, в участок между областями F1c и F2 праймера FIP может быть встроен сайт рестрикции.

F3 представляет собой праймер, созданный таким образом, что он имеет область F3, комплементарную области F3c мишеневого гена.

BIP представляет собой праймер, созданный таким образом, что он имеет область В2, комплементарную области В2с мишеневой последовательности на 3'-концевой стороне, и имеет последовательность, аналогичную последовательности области В1с мишеневого гена на 5'-концевой стороне. При необходимости, в участок между областями В1с и В2 праймера BIP может быть встроен сайт рестрикции.

В3 представляет собой праймер, созданный таким образом, что он имеет область В3, комплементарную области В3с мишеневого гена.

Если в праймерах FIP и BIP имеются сайты рестрикции, после окончания реакции амплификации нуклеиновой кислоты способом LAMP амплифицированный продукт обрабатывают рестриктазами, чтобы можно было увидеть, что после проведения электрофореза образовалась единичная полоса. В том случае, когда мишеневая последовательность уже содержит сайт рестрикции, необходимости в искусственном встраивании такого сайта рестрикции в праймеры может не быть.

Если используется набор праймеров для проведения LAMP в соответствии с настоящим изобретением, для ускорения реакции амплификации нуклеиновой кислоты можно добавить один или два типа петлевых праймеров (праймер LF или праймер LB). Такой петлевой праймер конструируют таким образом, чтобы он отжигался в области между F1 и F2 или области между В1 и В2, и затем его добавляют в реакционную систему для проведения LAMP. Таким образом, эти праймеры связываются с петлевыми участками, которые не используются в процессе амплификации нуклеиновой кислоты для усиления реакции амплификации нуклеиновой кислоты, используя все петлевые участки в качестве матриц, благодаря чему можно ускорить реакцию амплификации нуклеиновой кислоты (например, выложенная публикация японского патента № 2002-345499).

Конкретно, среди наборов праймеров для проведения LAMP в соответствии с первым вариантом осуществления набор праймеров для проведения LAMP, состоящий из полинуклеотидов, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID №: 1-4, или гомологичных им полинуклеотидов, может дополнительно содержать в качестве петлевого праймера полинуклеотид (LB) c нуклеотидной последовательностью SEQ ID №: 5 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

Набор праймеров для проведения LAMP в соответствии со вторым вариантом осуществления может дополнительно содержать в качестве петлевого(ых) праймера(ов) один из или оба полинуклеотида, выбранных из полинуклеотида (LF) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №: 11 или полинуклеотида, состоящего по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности; и полинуклеотида (LB) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №: 12 или полинуклеотида, состоящего по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

Набор праймеров для проведения LAMP в соответствии с третьим вариантом осуществления может дополнительно содержать в качестве петлевого праймера полинуклеотид (LB) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №: 17 или полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную данной нуклеотидной последовательности.

В соответствии с настоящим изобретением в качестве праймеров или зондов могут использоваться не только полинуклеотиды, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID №: 1-5 и 7-30, но также полинуклеотиды, гибридизующиеся с полинуклеотидами, имеющими последовательности, комплементарные данным нуклеотидным последовательностям SEQ ID №: 1-5 и 7-30 (которые в настоящем описании также могут быть обозначены как «гомологичные полинуклеотиды»).

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением в качестве праймеров для проведения LAMP, праймеров для проведения ПЦР и зондов могут быть использованы полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID №: 6, и полинуклеотид, состоящий по меньшей мере из 10 оснований, который гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID №: 6.

Под термином «гибридизоваться» в настоящем описании понимают, что определенный полинуклеотид гибридизуется с мишеневым полинуклеотидом, но при этом он по существу не гибридизуется с полинуклеотидами, отличными от мишеневого полинуклеотида. Такую гибридизацию можно осуществлять в жестких условиях. В данном документе «жесткие условия» могут быть определены в зависимости от Tm (°C) двойной цепи, включающей последовательность праймера и комплементарную ему цепь, необходимой концентрации соли и т.д. Методика выбора последовательности, используемой в качестве зонда, и затем определения жестких условий, подходящих для этого, хорошо известна специалистам в данной области (см., например, J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) и т.д.). В отношении таких жестких условий, реакцию гибридизации осуществляют при температуре немного ниже, чем Tm, определенной на основании нуклеотидной последовательности (например, при температуре, которая примерно на 0-5°C ниже, чем Tm), в подходящем буферном растворе, обычно используемом при гибридизации. Кроме того, в отношении других жестких условий, отмывку после реакции гибридизации осуществляют при высокой концентрации низкоконцентрированного раствора соли. Примерами таких жестких условий являются условия отмывки, при которых отмывку осуществляют в 6-кратном SSC/0,05% растворе пирофосфата натрия при температуре 37°C (для олигонуклеотида, состоящего примерно из 14 оснований), 48°C (для олигонуклеотида, состоящего примерно из 17 оснований), 55°C (для олигонуклеотида, состоящего примерно из 20 оснований) и 60°C (для олигонуклеотида, состоящего примерно из 23 оснований).

Длина нуклеотидов гомологичного полинуклеотида составляет по меньшей мере 10 оснований.

В случае праймеров для проведения LAMP, длина нуклеотидов каждого из полинуклеотидов, гомологичных FIP и BIP, может предпочтительно составлять по меньшей мере 30 нуклеотидов (например, от 30 до 60 нуклеотидов) и, более предпочтительно, по меньшей мере 42 нуклеотида (например, от 42 до 57 нуклеотидов).

Кроме того, длина нуклеотидов каждого из полинуклеотидов, гомологичных F3, В3, LF и LB, предпочтительно, может составлять по меньшей мере 12 оснований (например, от 12 до 30 оснований) и, более предпочтительно, по меньшей мере 18 оснований (например, от 18 до 25 оснований и от 18 до 30 оснований).

В случае праймеров для проведения ПЦР, длина в нуклеотидах каждого из полинуклеотидов, гомологичных полинуклеотидам, имеющим нуклеотидные последовательности SEQ ID №: 23-30, предпочтительно, может составлять по меньшей мере 15 оснований (например, от 15 до 30 оснований), более предпочтительно, по меньшей мере 18 оснований (например, от 18 до 24 оснований и от 18 до 30 оснований) и, особенно предпочтительно, по меньшей мере 20 оснований (например, от 20 до 25 оснований и от 20 до 30 оснований).

Такой гомологичный полинукл