Антитела высокой аффинности к il-6-рецептору человека

Антитела высокой аффинности к il-6-рецептору человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Интерлейкин-6 (IL-6) является плейотропным цитокином, продуцируемым иммунными и неиммунными клетками, который играет решающую роль в регуляции иммунной реакции, реакций острой фазы и гемопоэза. Он связывается с растворимым и связанным с клеточной мембраной IL-6R (α-цепью) с образованием бинарного комплекса, и этот комплекс способен взаимодействовать со связанным с клеточной мембраной gp130 (β-цепью), индуцирует образование комплекса передачи сигнала, содержащего по два каждого из IL-6, IL-6R и gp130.

Антитела к hIL-6R описаны в патентах US 5670373, 5795965, 5817790, 6410691 и EP 409607B1. Терапевтические способы описаны в патентах US 5888510 и 6723319.

Сущность изобретения

В первом аспекте, данное изобретение обеспечивает антитела человека, предпочтительно рекомбинантные антитела человека, которые специфически связывают рецептор интерлейкина-6 человека (hIL-6R). Эти антитела характеризуются связыванием с hIL-6R с высокой аффинностью и медленной кинетикой диссоциации и способностью нейтрализовать активность IL-6. Эти антитела могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG2) или могут содержать только антигенсвязывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv) и могут быть модифицированы для влияния на функциональность, например, для элиминации остаточных эффекторных функций (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933). В предпочтительном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает IL-6-рецептор человека (SEQ ID NO: 1) с K_D около 500 пМ или менее, как измерено резонансом поверхностных плазмонов. В более конкретном варианте осуществления, это антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет K_D менее 300 пМ или менее 200 пМ или даже менее 100 пМ. В различных вариантах осуществления, это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент блокирует активность hIL-6 с IC₅₀ 250 пМ или менее, как измерено биоанализом с использованием люциферазы. В более конкретных вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент проявляет IC₅₀ 150 пМ или менее.

В родственных аспектах, это антитело или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению связывает hIL-6R с аффинностью по меньшей мере в 2 раза более высокой, чем аффинность, с которой он связывает IL-6R обезьяны. В более предпочтительных вариантах осуществления, это антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывает белок hIL-6R (SEQ ID NO: 1) с аффинностью, которая является приблизительно в 3 раза более высокой относительно его аффинности связывания с IL-6R обезьяны (внеклеточный домен Macaca fascicularis показан в SEQ ID NO: 251).

В одном варианте осуществления, антитело или антигенсвязывающая часть антитела по данному изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 227, 19, 231, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 239, 241, 163, 179, 235, 195 и 211 или их по существу подобной последовательности. В более конкретном варианте осуществления, это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 229, 27, 233, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 237, 203 и 219 или их по существу подобной последовательности. В конкретных вариантах осуществления, это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит пары HCVR/LCVR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3/11; 227/229; 19/27; 231/233; 35/43; 51/59; 67/75; 83/91; 99/107; 115/123; 131/139; 147/155; 239/155; 241/155; 163/171; 179/187; 235/237; 195/203 и 211/219 или их по существу подобной последовательности.

Во втором аспекте, это изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела этого изобретения. В одном варианте осуществления, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению кодирует антитело или его фрагмент, содержащие HCVR, описанную выше. В конкретных вариантах осуществления, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HCVR, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 226, 18, 230, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 238, 240, 162, 178, 234, 194 и 210 или их по существу идентичной последовательности. В родственном аспекте, это изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую LCVR, описанную выше. В конкретных вариантах осуществления, эта молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая LCVR, является нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 228, 26, 232, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 236, 202 и 218 или их по существу идентичной последовательности.

В третьем аспекте, это изобретение описывает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий домен определяющего комплементарность участка 3 (CDR3) тяжелой цепи и домен CDR3 легкой цепи, где

домен CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - Х³ - Х⁴ - Х⁵ - Х⁶ - Х⁷ - Х⁸ - Х⁹ - Х¹⁰ - Х¹¹ - Х¹² - Х¹³ - Х¹⁴ - Х¹⁵ - Х¹⁶ - Х¹⁷ - Х¹⁸ - Х¹⁹ (SEQ ID NO: 247), где X¹=Ala, X²=Lys, X³=Gly, X⁴=Arg, X⁵=Asp, X⁶=Ser или Ala, X⁷=Phe, X⁸=Asp; X⁹=Ile, X¹⁰=Pro или отсутствует, X¹¹=Phe или отсутствует, X¹²=Val или отсутствует, X¹³=Tyr или отсутствует, X¹⁴=Tyr или отсутствует, X¹⁵=Tyr или отсутствует, X¹⁶=Gly или отсутствует, X¹⁷=Met или отсутствует, X¹⁸=Asp или отсутствует и X¹⁹=Val или отсутствует; и

домен CDR3 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶- X⁷ - X⁸ - X⁹ (SEQ ID NO: 250), где X¹=Gln, X²=Gln или His, X³=Ala, X⁴=Asn или Tyr, X⁵=Ser, X⁶=Phe, X⁷=Pro, X⁸=Pro и X⁹=Thr.

В более конкретном варианте осуществления, это антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит

домен CDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ (SEQ ID NO: 245), где X¹=Gly или Arg, X²=Phe, X³=Thr, X⁴=Phe, X⁵=Asp, X⁶=Asp, X⁷=Tyr и X⁸=Ala;

домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶- X⁷ - X⁸ (SEQ ID NO: 246), где X¹=Ile или Val, X²=Ser, X³=Trp, X⁴=Asn, X⁵=Ser, X⁶=Gly, X⁷=Ser и X⁸=Ile;

домен CDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ (SEQ ID NO: 248), где X¹=Gln, X²=Gly, X³=Ile, X⁴=Ser, X⁵=Ser и X⁶=Trp; и

домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ (SEQ ID NO: 249), где X¹=Gly или Ala, X²=Ala и X³=Ser.

В четвертом аспекте, это изобретение описывает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:

домен CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 153, 9, 185, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 169, 201 и 217; и

домен CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33, 161, 17, 193, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 177, 209 и 225.

В более конкретном варианте осуществления, антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит:

домен CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 149, 5, 181, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 165, 197 и 213;

домен CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 151, 7, 183, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 167, 199 и 215;

домен CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 157, 13, 189, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 173, 205 и 221; и

домен CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, 159, 15, 191, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 175, 207 и 223.**

В конкретных вариантах осуществления, это антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 21, 23, 25 и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID NO: 29, 31, 33; последовательности CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 149, 151, 153 и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID NO: 157, 159, 161; последовательности CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 5, 7, 9 и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID NO: 13, 15, 17; и последовательности CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 181, 183, 185 и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID NO: 189, 191, 193.

В пятом аспекте, это изобретение описывает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитело или антигенсвязывающие фрагменты этого изобретения, где это антитело или его фрагмент содержит

домен CDR3 тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 152, 8, 184, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 168, 200 и 216; и

домен CDR3 легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, 160, 16, 192, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 176, 208 и 224; а также их по существу идентичные последовательности нуклеиновых кислот.

В более конкретном варианте осуществления, обеспечены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитело или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению, где этот антитело или его фрагмент содержит

домен CDR1 тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 148, 4, 180, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 164, 196 и 212;

домен CDR2 тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 150, 6, 182, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 166, 198 и 214;

домен CDR1 легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28, 156, 12, 188, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 172, 204 и 220; и

домен CDR2 легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, 158, 14, 190, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 174, 206 и 222; а также их по существу идентичные последовательности нуклеиновых кислот.

Данное изобретение включает в себя анти-hIL-6R-антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, имеющие модифицированный паттерн (распределение) гликозилирования. В некоторых применениях, может быть применима модификация для удаления нежелательных сайтов гликозилирования, или антитело, лишенное фукозной части молекулы на олигосахаридной цепи, например, для увеличения антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других применениях, может быть произведена модификация галактозилирования для модификации комплементзависимой цитотоксичности (CDC).

В других аспектах, данное изобретение обеспечивает рекомбинантные экспрессирующие векторы, несущие молекулы нуклеиновых кислот этого изобретения, и клетки-хозяева, в которые были введены такие векторы, а также способы получения антител или антигенсвязывающих фрагментов этого изобретения, полученных культивированием клеток-хозяев этого изобретения. Эта клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической клеткой, предпочтительно этой клеткой-хозяином является клетка E. coli или клетка млекопитающего, например клетка СНО.

В следующем аспекте, данное изобретение описывает фармацевтическую композицию, содержащую антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент антитела, который специфически связывается с hIL-6R, и фармацевтически приемлемый носитель.

В следующих аспектах, данное изобретение описывает способы ингибирования активности IL-6 человека с использованием антитела или его антигенсвязывающей части данного изобретения. В одном варианте осуществления, это антитело включает в себя терапевтический способ, предусматривающий введение антитела этого изобретения, или его фрагмента, субъекту-человеку, страдающему от нарушения, которое лечится или ослабляется ингибированием активности IL-6. Этим нарушением может быть, например, артрит, в том числе хронический ревматоидный артрит; воспалительные заболевания кишечника, в том числе болезнь Крона и язвенный колит; системная красная волчанка и воспалительные заболевания.

В других аспектах, данное изобретение обеспечивает применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, определенных выше, в приготовлении лекарственного средства для применения в ослаблении или ингибировании IL-6-опосредованного заболевания или нарушения у человека. В родственном аспекте, это изобретение обеспечивает антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, определенные выше, для применения в ослаблении или ингибировании IL-6-опосредованного заболевания или нарушения у человека.

Другие цели и преимущества станут очевидными при рассмотрении следующего подробного описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед описанием способов данного изобретения должно быть понятно, что это изобретение не ограничивается описанными конкретными способами и экспериментальными условиями, так как такие способы и условия могут варьироваться. Должно быть также понятно, что используемая в данном описании терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, так как объем данного изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

Если нет другого указания, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют такое же значение, что и значение, понимаемое специалистом с обычной квалификацией в области, к которой принадлежит это изобретение. Хотя в практике или тестировании данного изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данном описании, теперь будут описаны предпочтительные способы и материалы.

Термин "IL6R человека" (hIL-6R) относится, в данном контексте, к рецептору цитокина человека, который специфически связывает интерлейкин-6 (IL-6). Внеклеточный домен hIL-6R показан в SEQ ID NO: 1.

Термин “антитело” относится, в данном контексте, к молекулам иммуноглобулина, содержащим четыре полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращаемую в данном описании как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращаемую как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоят из одного домена (CL1). VH- и VL-области могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность районами (областями) (CDR), со вставленными районами, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») относится, в данном контексте, к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антителом (например, hIL-6R). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают в себя (i) Fab-фрагмент, одновалентное антитело, состоящее из доменов VL, VH, CL1 и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком при шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов единственного плеча антител; (v) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 241 :544-546), который состоит из VH-домена; и (vi) выделенный определяющий комплементарность район (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов, посредством синтетического линкера, который позволяет им образовать единую смежную цепь, в которой эти VL- и VH-области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела включены также в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также включены в этот термин (см., например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448).

“Нейтрализующее" или “блокирующее" антитело, в данном контексте, относится к антителу, связывание которого с hIL-6R приводит к ингибированию биологической активности hIL-6. Это ингибирование биологической активности hIL-6 может оцениваться измерением одного или нескольких индикаторов биологической активности hIL-6, известных в данной области, таких как hIL-6-индуцируемая клеточная активность и связывание hIL-6 с hIL-6R (см. примеры ниже).

“CDR" или определяющим комплементарность участком является участок гипервариабельности, вставленный с интервалами в областях, которые являются более консервативными, называемыми “каркасными областями” (FR). В разных вариантах осуществления анти-hIL-6R-антитела или фрагмента по данному изобретению, эти FR могут быть идентичными последовательностям зародышевой линии человека или могут быть природно или искусственно модифицированными. Группа CDR может быть определена как аминокислотная консенсусная последовательность, например, в одном варианте осуществления, анти-hIL-6R-антитело или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут быть описаны как содержащие домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶- X⁷ - X⁸ - X⁹ - X¹⁰ - X¹¹ - X¹² - X¹³- X¹⁴ - X¹⁵ - X¹⁶ - X¹⁷ - X¹⁸ - X¹⁹ (SEQ ID NO: 247), где X¹=Ala, X²=Lys, X³=Gly, X⁴=Arg, X⁵=Asp, X⁶=Ser или Ala, X⁷=Phe, X⁸=Asp; X⁹=He, X¹⁰=Pro или отсутствует, X¹¹=Phe или отсутствует, X¹²=Val или отсутствует, X¹³=Tyr или отсутствует, X¹⁴=Tyr или отсутствует, X¹⁵=Tyr или отсутствует, X¹⁶=Gly или отсутствует, X¹⁷=Met или отсутствует, X¹⁸=Asp или отсутствует и X¹⁹=Val или отсутствует; и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶- X⁷ - X⁸ - X⁹ (SEQ ID NO: 250), где X¹=Gln, X²=Gln или His, X³=Ala, X⁴=Asn или Tyr, X⁵=Ser, X⁶=Phe, X⁷=Pro, X⁸=Pro и X⁹=Thr.

Термин "резонанс поверхностных плазмонов", в данном контексте, относится к оптическому явлению, которое делает возможным анализ взаимодействий реального времени детектированием изменений концентраций белка в биосенсорном матриксе, например, с использованием системы BIAcore™ (Pharmacia Biosensor AB).

Термин "эпитоп" означает антигенную детерминанту, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Отдельный антиген может иметь более чем один эпитоп. Эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп образуется пространственно расположенными бок о бок аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп образуется смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В некоторых обстоятельствах эпитоп может включать в себя сахаридные части, фосфорильные группы или сульфонильные группы этого антигена.

Термин "существенная идентичность" или "по существу идентичные", когда он относится к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, указывает на то, что при оптимальном сопоставлении с подходящими нуклеотидными инсерциями или делециями с другой молекулой нуклеиновой кислоты (или ее комплементарной цепью) имеется идентичность нуклеотидной последовательности по меньшей мере в приблизительно 95% или более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных оснований, как измерено любым хорошо известным алгоритмом идентичности последовательности, таким как FASTA, BLAST или Gap, обсуждаемыми ниже.

В применении к полипептидам, термин "существенная идентичность" или "по существу идентичные” означает, что две пептидные последовательности, при оптимальном сопоставлении, таком как программы GAP или BESTFIT, использующие массы гэпов по умолчанию, имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности, даже более предпочтительно по меньшей мере 98% или 99% идентичность последовательности. Предпочтительно, положения остатков, которые не являются идентичными, различаются консервативными аминокислотными заменами. “Консервативная аминокислотная замена" является заменой, в которой аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (R-группу) со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Обычно консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процентная идентичность или степень сходства последовательности может корректироваться в направлении коррекции консервативной природы этой замены. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают в себя 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические-гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; 3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспартат и глутамат и 7) серусодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. Альтернативно, консервативной заменой является любое изменение, имеющее положительную величину в матрице log-вероятности PAM250, описанной в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45. A "умеренно консервативной" заменой является любое изменение, имеющее неотрицательную величину в матрице log-вероятности PAM250.

Сходство последовательности для полипептидов, которое также называют идентичностью последовательности, измеряют обычно с использованием программного обеспечения анализа последовательностей. Программное обеспечение анализа белков сопоставляет сходные последовательности с использованием измерений сходства, приписанных различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG содержит программы, такие как Gap и Bestfit, которые могут быть использованы с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды из разных видов организмов или между белком дикого вида и его мутеином. См., например, GCG Version 6.1. Полипептидные последовательности могут также сравниваться при помощи FASTA с использованием параметров по умолчанию или рекомендуемых параметров, программы в GCG Version 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает сопоставления и процентную идентичность последовательности районов наилучшего совпадения между запрашиваемыми последовательностями и последовательностями поиска (Pearson (2000) supra). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности этого изобретения с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из разных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно blastp или tblastn, использующие параметры по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

Получение антител человека

Способы генерирования антител человека включают в себя, например, технологию Velocimmune™ (Regeneron Pharmaceuticals), XenoMouse™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix), подход "минилокуса" и фаговый дисплей (и см., например, патент US 5545807, патент US 6787637). Технология Velocimmune™ (патент US 6596541) включает в себя способ генерирования высокоспецифического полноразмерного антитела человека к выбранному антигену. Эта технология включает в себя генерирование трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, функционально связанные с эндогенными локусами константной области мыши, так что эта мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей этого антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелой и легкой цепей человека. Затем эту ДНК экспрессируют в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело. В конкретном варианте осуществления, этой клеткой является клетка СНО.

Антитела могут быть терапевтически применимы в блокировании взаимодействия лиганд-рецептор или ингибировании взаимодействия рецепторного компонента, а не посредством убивания клеток через фиксацию комплемента (комплемент-зависимой цитотоксичности) (CDC) и через участие в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Константная область антитела является важной в способности антитела фиксировать комплемент и опосредовать клеточнозависимую цитотоксичность Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основе того, является ли желательным, чтобы это антитело опосредовало цитотоксичность.

Иммуноглобулины человека могут существовать в двух формах, которые ассоциированы с гетерогенностью шарнирной области. В одной форме, молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе взаимодействием дисульфидной связи тяжелой цепи. Во второй форме, эти димеры не связаны вместе межцепочечными дисульфидными связями, и образована молекула приблизительно 75-80 кДа, составленная из ковалентно связанных легкой цепи и тяжелой цепи (полуантитело). Разделить эти формы было крайне трудно, даже после аффинной очистки. Частота встречаемости второй формы в разных интактных изотипах IgG обусловлена, но не ограничивается ими, структурными различиями, ассоциированными с изотипом шарнирной области этого антитела. Действительно, замена единственной аминокислоты в шарнирной области шарнира IgG4 человека может значимо уменьшать появление второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно наблюдаемых с использованием шарнира IgG1 человека. Данное изобретение включает в себя антитела, имеющие одну или несколько мутаций в шарнирной области, в области СН2 или СН3, которые могут быть желательными, например, в производстве, для улучшения выхода желаемой формы антитела.

Антитела по данному изобретению получают предпочтительно с использованием технологии Velocimmune™. Трансгенную мышь, в которой эндогенные вариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина заменены соответствующими вариабельными областями человека, стимулируют представляющим интерес антигеном и извлекают лимфатические клетки (такие как В-клетки) из этих мышей, которые экспрессируют антитела. Эти лимфатические клетки могут быть слиты с миеломной клеточной линией для получения иммортализованных гибридомных клеточных линий, и такие гибридомные клеточные линии подвергают скринингу и отбирают для идентификации гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитела, специфические в отношении представляющего интерес антигена. ДНК, кодирующая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, может быть выделена и связана с желаемыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепи. Такой белок антитела может быть получен в клетке, такой как клетка СНО. Альтернативно, ДНК, кодирующая антиген-специфические химерные антитела или вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, может быть выделена непосредственно из антиген-специфических лимфоцитов.

В одном варианте осуществления, эта трансгенная мышь содержит до 18 функциональных генов вариабельных областей тяжелой цепи человека и 12 функциональных генов вариабельных областей легкой цепи каппа человека. В другом варианте осуществления, эта трансгенная мышь содержит до 39 генов вариабельных областей тяжелой цепи человека и 30 генов вариабельных областей легкой цепи каппа человека. Еще в одном варианте осуществления эта трансгенная мышь содержит до 80 генов вариабельных областей тяжелой цепи человека и 40 генов вариабельных областей легкой цепи каппа человека.

Обычно антитела по данному изобретению обладают очень высокими аффинностями, обычно имея K_D приблизительно 10^-9 - приблизительно 10^-12 M при измерении по связыванию с антигеном либо в виде иммобилизованных на твердой фазе, либо в фазе раствора антител.

Сначала выделяют химерные антитела высокой аффинности, имеющие вариабельную область человека и константную область мыши. Как описано ниже, эти антитела характеризуют и отбирают на желаемые характеристики, включающие в себя связывающую аффинность в отношении hIL-6R, способность блокировать hIL-6 и/или селективность в отношении белка человека. Константные области мыши заменяют желаемой константной областью человека для генерирования полностью человеческого антитела этого изобретения, например, IgG4 или IgG1 дикого типа или модифицированные (например, SEQ ID NO: 242, 243, 244). Хотя выбранная константная область может варьироваться в соответствии с конкретным применением, характеристики связывания антигена с высокой аффинностью и специфичности в отношении мишени локализованы в вариабельной области.

Картирование эпитопов и связанные с ним технологии

Для скрининга на антитела, которые связываются с конкретном эпитопом, может выполняться рутинный перекрестно блокирующий анализ, такой как анализ, описанный в Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane, eds. Другие способы включают в себя аланинсканирующие мутанты, пептидные блоты (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) или анализы пептидного расщепления, описанные в примерах ниже. Кроме того, могут быть использованы такие способы, как вырезание эпитопов, экстракция эпитопов и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Protein Science: 9: 487-496).

Анализ с использованием модификаций (MAP), также известный как анализ антител на основе структуры антигена (ASAP), является способом, который классифицирует большие количества моноклональных антител (mAbs), направленных против одного и того же антигена, в соответствии со сходствами профиля связывания каждого антитела с поверхностями химически или ферментативно модифицированных антигенов (Публикация патента US 2004/0101920). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, либо явно отличающийся от эпитопа, представленного другой категорией, либо частично совпадающий с эпитопом, представленным другой категорией. Эта технология делает возможной быструю фильтрацию генетически идентичных антител, так что характеристика может быть сфокусирована на генетически отличающихся антителах. При использовании скрининга гибридом МАР может облегчать идентификацию редких гибридомных клонов с желаемыми характеристиками. МАР может быть использован для сортинга hIL-6R-антител этого изобретения на группы антител, связывающие различные эпитопы.

Агенты, применимые для изменения структуры иммобилизованного антигена, являются ферментами, такими как, например, протеолитические ферменты, и химическими агентами. Антигенный белок может быть иммобилизован либо на поверхностях биосенсорного чипа, либо на полистироловых гранулах. Последние могут быть обработаны с использованием, например, такого анализа, как мультиплексный анализ детектирования с использованием Luminex™ (Luminex Corp., TX). Поскольку способность Luminex™ выполнять мультиплексный анализ с таким количеством, как до 100 различных типов гранул, Luminex™ обеспечивает почти неограниченные антигенные поверхности с различными модификациями, что приводит к улучшенному разрешению анализа эпитопов антител в сравнении с биосенсорным анализом.

Терапевтическое введение и готовые формы

Введение терапевтических веществ в соответствии с данным изобретением будет выполняться с подходящими носителями, эксципиентами и другими агентами, которые включают в готовые формы для обеспечения улучшенного переноса, доставки, переносимости и т.п. Множество подходящих готовых форм могут быть найдены в фармакологическом справочнике, известном всем фармацевтическим химикам: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1975), в частности, части 87, написанной Blaug, Seymour, в этом справочнике. Эти готовые формы включают в себя, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, липид (катионный или анионный), содержащий пузырьки (такой как Липофектин™), ДНК-конъюгаты, безводные абсорбционные пасты, эмульсии типа масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсии карбовакса (полиэтиленгликолей разных молекулярных масс), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любая из предыдущих смесей может быть подходящей в обработках и терапиях в соответствии с данным изобретением, при условии, что активный ингредиент в этой готовой форме не инактивируется этой готовой формой, и эта готовая форма является физиологически совместимой и переносимой для конкретного способа введения. См. также Powell et al. PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311 и ссылки, цитируемые в этой работе, в отношении дополнительной информации, относящейся к эксципиентам и носителям, хорошо известных фармацевтическим химикам.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предлагаются для обеспечения специалистов с обычной квалификацией в данной области полным раскрытием и описанием, каким образом выполнять и использовать способы и композиции данного изобретения, и не предназначены для ограничения объема материала, рассматриваемого авторами в качестве их изобретения. Были предприняты попытки обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но некоторые экспериментальные ошибки и отклонения должны учитываться. Если нет других указаний, части являются массовыми частями, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура является температурой в градусах по стоградусной шкале Цельсия и давление является атмосферным или почти атмосферным давлением.

Пример 1. Генерирование антител человека к IL-6-рецептору человека.

Иммунизация грызунов может выполняться любыми способами, известными в данной области (см., например, Harlow and Lane (1988) supra; Malik and Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, 1994, CA). В одном предпочтительном варианте осуществления, антиген hIL-6R вводят непосредственно мышам, которые содержат локусы ДНК, кодирующие как вариабельную область тяжелой цепи Ig, так и вариабельную область легкой цепи каппа человека (Velocimmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; US 6596541), с адъювантом для стимуляции иммунной реакции. Такой адъювант включает в себя полный и неполный адъювант Фрейнда, систему адъювантов MPL+TDM (Sigma) или RIBI (мурамилдипептиды) (см. O'Hagan, Vaccine Adjuvant, by Human Press, 2000, NJ). Такой адъювант может предотвращать быстрое рассеяние полипептидов секвестрацией антигена в локальном депо и может содержать факторы, которые могут стимулировать иммунную реакцию хозяина. В одном варианте осуществления, hIL-6R вводят непосредственно в виде ДНК-плазмиды, которая содержит ген hIL-6R и экспрессирует hIL-6R с использованием аппарата экспрессии клеточных белков хозяина с образованием антигенного полипептида in vivo. В обоих подходах схема иммунизации требует нескольких введений с интервалами порядка нескольких недель. Иммунную реакцию в виде антител подвергают мониторингу с использованием стандартного антиген-специфического иммуноанализа. При достижении животными их максимальной иммунной реакции экспрессирующие антитело В-клетки собирали и сливали с мышиными миеломными клетками для сохранения их жизнеспособности, с получением гибридомных клеток. Для отбора функционально желаемых моноклональных антител кондиционированные среды этих гибридомных клеток или трансфицированных клеток подвергали скринингу на специфичность, антигенсвязывающую аффинность и эффективность блокирования связывания hIL-6 с hIL-6R (описано ниже).

Пример 2. Анти-hIL-6R-антитела, генерированные посредством прямого выделения спленоцитов

ДНК, кодирующая домены VH и VL, может быть выделена непосредственно из положительной в отношении единственного антигена В-клетки. Вкратце, иммунизированную hIL-6Rα трансгенную мышь эвтанизировали и собирали спленоциты. Эритроциты удаляли лизисом с последующим осаждением собранных спле