Слитые белки, включающие ферменты, разрушающие клеточную оболочку растений, и их применения

Слитые белки, включающие ферменты, разрушающие клеточную оболочку растений, и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к конструированию и сверхсинтезу полученных методами генной инженерии полифункциональных ферментов, разрушающих клеточную оболочку растений, и к их применениям в качестве усовершенствованного ферментативного инструмента для увеличения ценности сельскохозяйственных побочных продуктов.

Сельскохозяйственные остатки являются большим возобновляемым ресурсом для биоконверсии лигноцеллюлозы. Ежедневно выработка пищевой промышленности создает большое количество таких побочных продуктов, которые считаются загрязняющими отходами и подлежат уничтожению. Проводится множество научных исследований, направленных на увеличение ценности этих побочных продуктов в биотехнологическом секторе. Среди представляющих ценность соединений феруловая кислота (4-гидрокси-3-метокси-коричная кислота) является очень привлекательным фенольным соединением, о котором известно, что это самая распространенная гидроксикоричная кислота в растительном мире. Феруловая кислота, к примеру, может быть использована как антиоксидант (23) или преобразована с помощью бактерий в «натуральный» ванилин, который является дорогостоящей добавкой в пищевой, косметической и фармацевтической промышленностях (4, 26). Среди сельскохозяйственных побочных продуктов кукурузные и пшеничные отруби являются потенциальными субстратами благодаря присутствию большого количества феруловой кислоты в их клеточной стенке - 3% и 1% (вес/вес) соответственно (43). В физиологии растений феруловая кислота является основным структурным компонентом, обладающим важными физическими и химическими свойствами клеточной оболочки растений. В частности, она может выступать в качестве сшивающего агента между лигнином и углеводородами или между самими углеводородами (16), оказывая влияние на целостность клеточной оболочки и тем самым снижая степень биологического разрушения, вызываемого микробными ферментами (6).

Микроорганизмы выработали ферменты, такие как ферулоилэстеразы (EC 3.1.1.73), способные к гидролизу эфирных связей между феруловой кислотой и полисахаридами клеточной оболочки растений. Эти ферменты улучшают доступность для других лигноцеллюлозных ферментов к полисахаридному остову (в качестве обзора см. 12). Предыдущие исследования показывают, что ферулоилэстеразы действуют синергически с разрушающими основную полисахаридную цепь ферментами, такими как β-(1,4)-эндоксиланазы, увеличивая выход феруловой кислоты из клеточных оболочек растений и образуя ее в количестве, достаточном для ряда приложений (2, 15, 50). Мицелиальные грибы, такие как Aspergillus niger, являются хорошо известными продуцентами ферментов, разрушающих клеточную оболочку растений. Два разных гена, кодирующих ферулоилэстеразы из A. niger, уже были клонированы (10, 11), а соответствующие им рекомбинантные белки сверхсинтезированы в Pichia pastoris и A. niger (24, 30, 41). Несколько ферулоилэстераз из грибов были очищены и охарактеризованы (18, 47), но других генов не было клонировано. В предыдущей работе описано получение из Penicillium funiculosum первой коричной эстеразы грибов (тип B) с С-концевым доменом, наиболее сходным с группой 1 углеводородосвязывающих модулей (Carbohydraye-Binding-Module, CBM) (27). Большое количество гликозильных гидролаз из анаэробных и аэробных микроорганизмов имеют модульную структуру. В дополнение к каталитическому домену один или более некаталитических CBM могут быть расположены либо в N-концевой области, либо в C-концевой области, либо в обеих областях. CBM были классифицированы по семействам, исходя из их аминокислотной последовательности и трехмерной структуры (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html). Основная функция CBM заключается в разрушении нерастворимого субстрата (45). Например, они ответственны за поддержание расположения каталитического домена в близости к субстрату, увеличивая продолжительность и близость их контакта. Более того, в некоторых случаях CBM может также изменять микрофибриллярую целлюлозную структуру, ослабляя водородные связи собранных вместе целлюлозных цепей (13, 14, 33).

В настоящем изобретении содержатся соображения о синергическом эффекте между отдельными и слитыми ферментами грибов (таких как A. niger), разрушающими клеточную оболочку растений. В недавнем исследовании, основанном на генно-инженерной бактериальной целлюлозоме, физическая близость двух каталитических компонентов позволяла наблюдать увеличенный синергизм в отношении эволюционно-консервативных субстратов (17). На основании этого авторы сконструировали химерный белок, связывающий грибную ферулоилэстеразу с клостридиальным докериновым доменом, который вместе с другим ферментом пересаживался на бактериальный CBM-содержащий опорный белок (31). Однако выход рекомбинантного белка был недостаточно высок для тестов приложений в промышленном масштабе, и в связи с этим была выработана новая стратегия. В этой работе авторы сделали гибрид (слитый белок) из двух грибных ферментов: ферулоилэстеразы А (FAEA) и ксиланазы B (XYNB) из A. niger, разделенных гипергликозилированным линкерным пептидом, с образованием бифункционального фермента (FLX), который обладает повышенной эффективностью выделения феруловой кислоты. Кроме того, авторы изобретения добавили также вторую конструкцию, содержащую CBM грибов из A. niger целлобиогидролазы B (CBHB) на C-концевом участке указанного бифункционального фермента (FLXLC). Оба гибридных фермента были успешно синтезированы в A. niger и полностью охарактеризованы в отношении биохимических и кинетических аспектов, а также использованы для получения феруловой кислоты из природных субстратов: кукурузных и пшеничных отрубей. Целью этой работы являлось сравнение эффективности выделения феруловой кислоты при использовании отдельных или слитых ферментов для исследования ферментативной синергии, происходящей благодаря физической близости ферментов грибов. Более того, в конструкции FLXLC был исследован эффект присоединения CBM к C-концевой части бифункционального фермента.

Настоящее изобретение основывается на демонстрации синергического эффекта от слияния в один химерный белок ферментов, разрушающих клеточную оболочку растений, в случае когда указанные ферменты не содержат СВМ, при сравнении с использованием одиночных ферментов, разрушающих клеточную оболочку растений.

Таким образом, основной целью настоящего изобретения является создание новых слитых белков, включающих не содержащие СВМ-домен ферменты, разрушающие клеточную оболочку растений.

Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке нового способа получения представляющих интерес соединений, связанных с оболочками растительных клеток путем использования указанных слитых белков на растениях и преимущественно на сельскохозяйственных побочных продуктах, в качестве субстратов.

Настоящее изобретение относится к применению слитых белков, включающих по меньшей мере два фермента, разрушающих оболочки растительных клеток, причем указанные ферменты не содержат углеводородосвязывающей молекулы (Carbohydraye-Binding-Molecule, СВМ) в С-концевой области, и дополнительно СВМ; указанные ферменты и СВМ являются рекомбинантными белками, соответствующими нативным белкам в грибах или их мутированным формам. Слитые белки используются в процессах разрушения растительных клеточных оболочек в рамках приготовления из растений или растительных побочных продуктов, целевых соединений, содержащихся в оболочке растительной клетки, или в рамках отбеливания бумажной массы и бумаги.

Выражение «ферменты, разрушающие растительную клеточную оболочку» относится к ферментам, которые способны осуществлять расщепление компонентов клеточной оболочки, таких как целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин. Разрушающие оболочки растительных клеток ферменты в указанных слитых белках являются одинаковыми или отличными один от другого.

Выражение «C-концевая углеводородосвязывающая молекула» относится к молекуле, обладающей афинностью к целлюлозе, которая направляет связанный с ней фермент к целлюлозе.

Более детально, изобретение относится к определенному выше применению, в котором ферменты, разрушающие растительные клеточные оболочки и не содержащие CBM, являются гидролазами, выбираемыми из:

- целлюлаз, таких как целлобиогидролазы, эндоглюканазы и экзоглюканазы или β-глюкозидазы,

- гемицеллюлаз, таких как ксиланазы,

- лигниназ, способных разрушать лигнины, таких как лакказы, пероксидаза марганца, пероксидаза лигнина, многосторонняя пероксидаза, или вспомогательных ферментов, таких как целлобиоз дезгидрогеназы и спиртовые арил оксидазы,

- гидролаз коричных эфиров, способных выделять коричные кислоты, такие как феруловая кислота, и гидролизовать связи диферуловой кислоты между цепями гемицеллюлозы, таких как ферулоилэстеразы, коричные эстеразы и гидролазы хлорогеновой кислоты.

Более детально, изобретение касается определенного выше применения, в котором ферменты, разрушающие растительные клеточные оболочки и не содержащие CBM, выбирают из ферулоилэстераз и ксиланаз.

Более детально, изобретение относится к определенному выше применению, в котором ферменты, разрушающие растительные клеточные оболочки и не содержащие CBM, соответствуют нативным ферментам, или их мутированным формам, грибов, выбранных из:

* аскомицетов, таких как штаммы как Aspergillus, и более конкретно Aspergillus niger,

* базидиомицетов, таких как штаммы как Pycnoporus или Halociphina, и более конкретно Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus или Halociphina villosa.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения, в котором ферменты, разрушающие растительные клеточные оболочки и не содержащие CBM, соответствуют нативным ферментам, или их мутированным формам, из штаммов Asperagillus, например такого, как Asperagillus niger.

Более конкретно, изобретение относится к определенному выше применению, в котором, по меньшей мере, один из ферментов, разрушающих растительные клеточные оболочки, является ферулоилэстеразой, выбранной из:

- ферулоилэстеразы А из A. niger, представленной SEQ ID NO: 2, кодируемой нуклеиновой кислотой, представленной SEQ ID NO: 1,

- ферулоилэстеразы В из A. niger, представленной SEQ ID NO: 4, кодируемой нуклеиновой кислотой, представленной SEQ ID NO: 3.

Более конкретно, изобретение относится к определенному выше применению, в котором, по меньшей мере, один из ферментов, разрушающих растительные клеточные оболочки, является ксиланазой, определенной выше, такой как ксиланаза В из A. niger, представленной SEQ ID NO: 6, кодируемой нуклеиновой кислотой, представленной SEQ ID NO: 5.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения, в котором ферменты, разрушающие растительные клеточные оболочки и не содержащие СВМ, соответствуют нативным ферментам, или их мутированным формам, грибов, выбранных из аскомицетов, таких штаммов как Asperagillus, и более конкретно, Asperagillus niger.

СВМ, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, принадлежат к группе 1.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения, в котором СВМ представляет собой СВМ, присутствующую в целлобиогидролазе В из A. niger, и представленную SEQ ID NO: 8, кодируемую нуклеиновой кислотой, представленной SEQ ID NO: 7.

Изобретение также относится к определенному выше применению слитых белков, содержащих линкеры между по меньшей мере двумя белками, содержащими указанные слитые белки, причем указанными линкерами являются полипептиды длиной от 10 до 100 аминокислот, преимущественно около 50 аминокислот.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения слитых белков, в котором линкер встроен между каждым из белков, входящих в состав указанных слитых белков.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения, в котором линкером является гипергликозилированный полипептид, такой как имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, содержащуюся в целлобиогидролазе В из А. niger и кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной SEQ ID NO: 9.

Более конкретно, изобретение также относится к определенному выше применению слитых белков между ферулоилэстеразой и ксиланазой и дополнительно СВМ.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения слитых белков, включающих ферулоилэстеразу А из А. niger, представленную SEQ ID NO: 4, или ферулоилэстеразу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 4, и ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6.

Более конкретно, изобретение относится к определенному выше применению слитого белка, включающего ферулоилэстеразу А из А. niger, представленную SEQ ID NO: 2, и ксиланазу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 6, причем указанный слитый белок содержит последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между двумя начальными белками, и представлен SEQ ID NO: 12.

Изобретение относится также к определенному выше применению слитых белков, включающих ферулоилэстеразу А из А. niger, представленную SEQ ID NO: 2, ксиланазу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, содержащуюся в целлобиогидролазе В из А. niger.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения слитого белка, включающего ферулоилэстеразу А из А. niger, представленную SEQ ID NO: 2, ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, причем указанный слитый белок содержит последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между каждым из трех начальных белков, и представлен SEQ ID NO: 14.

Более конкретно, изобретение относится к определенному выше применению слитого белка, включающего ферулоилэстеразу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 4, и ксиланазу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 6, причем указанный слитый белок содержит последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между двумя начальными белками, и представлен SEQ ID NO: 16.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше применения слитых белков, включающих ферулоилэстеразу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 4, ксиланазу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, содержащуюся в целлобиогидролазе В из А. niger.

Более конкретно, изобретение относится к определенному выше применению слитого белка, включающего ферулоилэстеразу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 4, ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, причем указанный слитый белок содержит последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между каждым из трех начальных белков и представлен SEQ ID NO: 18.

Изобретение также относится к определенному выше применению для осуществления способов разрушения растительных клеточных оболочек в рамках получения следующих представляющих интерес соединений:

- биоэтанола,

- антиоксидантов, таких как феруловая кислота или кофейная кислота, которые относятся к коричным кислотам, и гидрокситирозол, или галлиевая кислота,

- вкусоароматических добавок, таких как ванилин или п-гидроксибензалдегид, получаемых биотрансформацией феруловой кислоты или п-кумариновой кислоты соответственно,

- или в рамках отбеливания бумажной массы и бумаги.

Изобретение также относится к определенному выше применению, в котором указанные слитые белки напрямую добавляются к растениям или растительным побочным продуктам в качестве субстрата или секретируются клетками грибов, трансформированными нуклеиновыми кислотами, кодирующими указанные слитые белки, такие как грибы, указанные выше, и в частности A. niger и Pycnoporus cinnabarinus; при этом указанные грибы находятся в прямом контакте с указанными растениями или растительными побочными продуктами в качестве субстратов.

Изобретение также касается способа разрушения растительных клеточных оболочек для получения из растений и растительных побочных продуктов целевых соединений, находящихся в оболочках растительных клеток, отличающегося тем, что он включает следующие стадии:

- ферментативную обработку растений или растительных побочных продуктов и промышленных отходов слитыми белками, определенными выше, или трансформированными клетками грибов, определенными выше,

- дополнительно физическую обработку паром растений или растительных побочных продуктов в сочетании с действием слитых белков,

- дополнительно биотрансформацию соединений, выделяющихся из клеточных оболочек в процессе вышеуказанной ферментативной обработки, с использованием соответствующих микроорганизмов или ферментов,

- выделение и, если необходимо, очистку интересующих соединений, высвобождающихся из клеточных оболочек во время указанной ферментативной обработки или полученных на указанной стадии биотрансформации.

Предпочтительно растения, обработанные слитыми белками в способе по изобретению, выбирают из сахарной свеклы, пшеницы, кукурузы, риса или из любых деревьев, используемых в бумажной промышленности.

Предпочтительно растительные побочные продукты или промышленные отходы, обработанные слитыми белками в способе по изобретению, выбирают из пшеничной соломы, кукурузных отрубей, пшеничных отрубей, рисовых отрубей, яблочных выжимок, кофейных выжимок, кофейных побочных продуктов, отработанной воды оливкового прессования.

Более конкретно, изобретение касается определенного выше способа получения антиоксидантов в качестве целевых соединений, включающего

- обработку растений или растительных побочных продуктов слитыми белками, содержащими, по меньшей мере, два из следующих разрушающих клеточную оболочку ферментов, которые не содержат CBM: ферулоилэстеразы А, ферулоилэстеразы В, гидролазы хлорогеновой кислоты, ксилоназы, в которой слитый белок предпочтительно выбирается из ферулоилэстеразы А-ксиланазы, ферулоилэстеразы В-ксиланазы, ферулоилэстеразы А-ферулоилэстеразы А-ксиланазы, гидролазы хлорогеновой кислоты - ксиланазы.

- выделение и, если необходимо, очистку антиоксидантов, высвобождающихся из клеточных оболочек указанных растений или растительных побочных продуктов.

Более конкретно, изобретение относится к способу, определенному выше, получения коричных кислот, таких как феруловая кислота в качестве интересующего антиоксиданта, в котором используемый слитый белок содержит ферулоилэстеразу и ксиланазу и может содержать CBM, как определено выше, и, в частности, выбирается из SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.

Преимущественно в рамках получения антиоксидантов, таких как феруловая кислота, растения, обрабатываемые вышеописанными слитыми белками, выбирают из следующей группы: сахарная свекла, пшеница, кукуруза, рис; или растительные побочные продукты или промышленные отходы, обрабатываемые вышеописанными слитыми белками, выбирают из следующей группы: пшеничная солома, кукурузные отруби, пшеничные отруби, рисовые отруби, яблочные выжимки, кофейные выжимки, кофейные побочные продукты, отработанная вода оливкового прессования.

Изобретение также относится к способу, определенному выше, получения вкусоароматических добавок в качестве целевых соединений, включающему в себя:

- обработку растений или растительных побочных продуктов слитыми белками, используемыми в рамках получения антиоксидантов, как определено выше,

- биотрансформацию соединений, выделяемых из клеточных оболочек на предшествующей стадии с помощью контакта указанных соединений с неопределенными ферментами, продуцируемыми микроорганизмами, выбранными из аскомицетов или базидиомицетов, таких как A. niger или P. Cinnabarinus соответственно,

- выделение и, если необходимо, очистку вкусоароматических добавок, полученных на предшествующей стадии биотрансформации.

Более конкретно, изобретение относится к способу, определенному выше, получения ванилина в качестве целевой вкусоароматической добавки, в котором используемый слитый белок выбирают из белков, используемых для получения феруловой кислоты как определено выше, и стадию биотрансформации осуществляют приведением в контакт ферулой кислоты, выделяемой из клеточных оболочек, с неопределенными ферментами, продуцируемыми аскомицетами или базидиомицетами, такими как A. niger или P. Cinnabarinus соответственно.

Предпочтительно растения и растительные побочные продукты или промышленные отходы, используемые в рамках получения вкусовых добавок, таких как ванилин, выбирают из тех, которые упоминались выше для получения антиоксидантов.

Изобретение также относится к способу, определенному выше, получения биоэтанола в качестве целевого соединения, включающему:

- обработку растений или растительных побочных продуктов слитыми белками, содержащими, по меньшей мере, два разрушающих растительные клеточные оболочки фермента, которые не имеют CBM, из следующей группы: целлюлазы, гемицеллюлазы, эстеразы, лакказы, пероксидазы, арилалкул оксидазы, причем слитый белок предпочтительно выбирают из эндоглюканазы-экзоглюканазы, лакказы-ксиланазы, ксиланазы-целлюлазы (эндо- или экзоглюканазы), предпочтительно, чтобы указанная обработка сочеталась с физической обработкой указанных растений или растительных побочных продуктов,

- биотрансформацию обработанных растений или растительных побочных продуктов, полученных на предыдущей стадии, в ферментируемые сахара с использованием слитых белков, описанных выше, или трансформированных грибов, секретирующих слитые белки, в сочетании с ферментами, выбираемыми из целлюлаз, гемицеллюлаз, или эстераз, или микроорганизмов, выбираемых из аскомицетов, таких как A. niger или Trichoderma reesei.

- биотрансформацию ферментируемых сахаров в биоэтанол с помощью дрожжей.

Более конкретно, изобретение относится к определенному выше способу получения ферментируемых сахаров для последующего получения биоэтанола, в котором слитый белок выбирается из эндоглюканазы-экзоглюканазы, лакказы-ксиланазы, ксиланазы-целлюлазы (эндо-или экзоглюканазы).

Преимущественно растения и растительные побочные продукты или промышленные отходы, используемые в рамках получения биоэтанола, выбирают из следующих: древесины, однолетние растения или сельскохозяйственные побочные продукты.

Изобретение также относится к способу отбеливания бумажной массы и бумаги, включающему:

- химическую и физическую обработку растений или растительных побочных продуктов в комбинации со слитыми белками, содержащими, по меньшей мере, два разрушающих растительные клеточные оболочки фермента, которые не имеют CBM, из следующей группы: ферулоилэстераза А, ферулоилэстераза В, ксиланаза, лакказа, арилалкул оксидаза, пероксидаза марганца, пероксидаза лигнина, версатиловая пероксидаза или целлобиозная дегидрогеназа.

- дополнительно размягчение обработанных растений или растительных побочных продуктов, полученных на предыдущей стадии, трансформированными грибами, секретирующими слитые белки, содержащие, по меньшей мере, два разрушающих растительные клеточные оболочки фермента, которые не имеют CBM, из следующей группы: ферулоилэстераза А, ферулоилэстераза В, ксиланаза, лакказа, арилалкул оксидаза, пероксидаза марганца, пероксидаза лигнина, версатиловая пероксидаза или целлобиозная дегидрогеназа;

- биоотбеливание обработанных растений или растительных побочных продуктов, полученных на предыдущей стадии, трансформированными грибами, секретирующими слитые белки, содержащие, по меньшей мере, два разрушающих растительные клеточные оболочки фермента, которые не имеют CBM, из следующей группы: ферулоилэстераза А, ферулоилэстераза В, ксиланаза, лакказа, арилалкул оксидаза, пероксидаза марганца, пероксидаза лигнина, версатиловая пероксидаза или целлобиозная дегидрогеназа.

Изобретение более конкретно относится к способу, описанному выше, отбеливания бумажной массы и бумаги, в котором слитый белок, используемый на первой стадии обработки растений и растительных побочных продуктов, выбирают из ферулоилэстеразы А-ксиланазы, ферулоилэстеразы В-ксиланазы, ферулоилэстеразы А-ферулоилэстеразы А-ксиланазы, ферулоилэстеразы А-ферулоилэстеразы В-ксиланазы, лакказы-ксиланазы, арилалкул ксиланазы-пероксидазы марганца; слитый белок, секретируемый трансформированными грибами и используемый на стадии биоразмягчения, выбирают из: ферулоилэстеразы А-ксиланазы, ферулоилэстеразы В-ксиланазы, ферулоилэстеразы А-ферулоилэстеразы А-ксиланазы, ферулоилэстеразы А-ферулоилэстеразы В-ксиланазы, лакказы-ксиланазы, арилалкул ксиланазы-пероксидазы марганца, сверхпродуцируемых Р. Cinnabarinus или A. niger, и слитый белок, используемый на стадии биоотбеливания, выбирают из: ферулоилэстеразы А-ксиланазы, ферулоилэстеразы В-ксиланазы, ферулоилэстеразы А-ферулоилэстеразы А-ксиланазы, ферулоилэстеразы А-ферулоилэстеразы В-ксиланазы, лакказы-ксиланазы, арилалкул ксиланазы-пероксидазы марганца.

Изобретение также относится к слитым белкам, включающим по меньшей мере два разрушающих растительные клеточные оболочки фермента, которые не содержат С-концевую углеводородосвязывающую молекулу (СВМ) и дополнительно СВМ, при этом указанные ферменты и СВМ являются рекомбинантными белками, соответствующими нативным белкам в грибах или их мутированными формами, как определено выше.

Более конкретно, изобретение относится к слитым белкам, определенным выше, включающим в себя линкеры между не менее двумя из белков, входящих в указанные слитые белки, причем эти линкеры определены выше.

Более конкретно, изобретение относится к слитым белкам, определенным выше, включающим ферулоилэстеразу и ксиланазу и дополнительно СВМ.

Изобретение более конкретно касается слитых белков, определенных выше, включающих ферулоилэстеразу А из A. niger, представленную SEQ ID NO: 2, или ферулоилэстеразу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 4, и ксиланазу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 6.

Изобретение более конкретно касается слитых белков, как определено выше, включающих ферулоилэстеразу А из А. niger, представленную SEQ ID NO: 2 и ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6, причем указанные слитые белки содержат последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между двумя начальными белками, и представлены SEQ ID NO: 12.

Изобретение также относится к слитым белкам, как определено выше, включающим ферулоилэстеразу А из А. niger, представленную SEQ ID NO: 2, ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, содержащимся в целлобиогидролазе В из А. niger.

Изобретение более конкретно относится к слитым белкам, как определено выше, включающим ферулоилэстеразу А из А. niger представленную SEQ ID NO: 2 и ксиланазу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, причем указанные составные белки содержат последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между каждым из трех начальных белков, и представлены SEQ ID NO: 14.

Изобретение более конкретно касается слитых белков, как определено выше, включающих ферулоилэстеразу В из A. niger, представленную SEQ ID NO: 4, и ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6, причем указанные слитые белки содержат последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между двумя начальными белками, и представлены SEQ ID NO: 16.

Изобретение также относится к слитым белкам, как определено выше, включающим ферулоилэстеразу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 4, ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, содержащуюся в целлобиогидролазе В из А. niger.

Изобретение более конкретно относится к слитому белку, как определено выше, включающему ферулоилэстеразу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 4 и ксиланазу В из А. niger, представленную SEQ ID NO: 6, и СВМ, представленную SEQ ID NO: 8, причем указанные слитые белки содержат последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 в качестве гипергликозилированного линкера между каждым из трех начальных белков, и представлены SEQ ID NO: 18.

Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим слитый белок, определенный выше.

Изобретение более конкретно относится к нуклеиновым кислотам, представленным SEQ ID NO: 11, 13, 15 и 17, кодирующим слитые белки, представленные SEQ ID NO: 12, 14, 16 и 18 соответственно.

Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, представленным SEQ ID NO: 19 и 21, соответствующим SEQ ID NO: 11 и 13, где последовательность SEQ ID NO: 1 заменена на последовательность SEQ ID NO: 23, кодирующую пре-ферулоилэстеразу А, соответствующую SEQ ID NO: 24, причем указанные нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 19 и 21 кодируют пре-белки слитых белков, соответствующих последовательностям SEQ ID NO: 20 и 22.

Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, представленным SEQ ID NO: 25 и 27, соответствующим SEQ ID NO: 15 и 17, где последовательность SEQ ID NO: 3 заменена на последовательность SEQ ID NO: 29, кодирующую пре-ферулоилэстеразу В, соответствующую SEQ ID NO: 30, причем указанные нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 25 и 27 кодируют пре-белки слитых белков, соответствующих последовательностям SEQ ID NO: 20 и 22.

Изобретение также относится к векторам, таким как pAN 52.3, трансформированным нуклеиновой кислотой, определенной выше.

Изобретение также относится к клеткам-хозяевам, таким как аскомицеты или базодиомицеты, и более конкретно A. niger и P. Cinnabarinus, трансформированным нуклеиновыми кислотами, определенными выше, с использованием вышеуказанных векторов.

Изобретение также относится к способу получения слитых белков, определенных выше, включая культивирование in vitro клеток хозяина, как определено выше, выделение и, если необходимо, очистку слитых белков, продуцируемых указанными клетками-хозяевами в культуре.

Изобретение также иллюстрируется следующим подробным описанием получения и свойств химерных ферментов FLX (SEQ ID NO: 12) и FLXLC (SEQ ID NO: 14).

Два химерных фермента были сконструированы и успешно сверхсинтезированы в Aspergillus niger. Конструкция FLX состоит из последовательностей, кодирующих ферулоилэстеразу А (FAEA), соединенную с эндонуклеазой В (XYNB) из A. niger. С-концевой углеводород-связывающий модуль (CBM семейство 1) был присоединен к FLX, образуя второй гибридный фермент: FLXLC. Между каждым из белков был вставлен линкер для стабилизации конструкции. Гибридные белки очищались до состояния гомогенности, и была произведена оценка их молекулярных масс: 72 кДа и 97 кДа для FLX и FLXLC соответственно. Целостность гибридных ферментов проверялась иммунодетекцией, которая показала единственную форму при использовании антител к FAEA и полигистидиновой метке. Физико-химические свойства каждого каталитического модуля этих бифункциональных ферментов соответствовали свойствам отдельных ферментов. Кроме того, авторами было проверено, что FLXLC демонстрировал высокую афинность к микрокристаллической целлюлозе (Avicel) с параметрами связывания, соответствующими K_d 9,9×10^-8M для константы диссоциации и 0,98 мкмоль/г целлюлозы для емкости связывания. Оба бифункциональных фермента были исследованы для определения их способности к выделению феруловой кислоты из природных субстратов: кукурузных и пшеничных отрубей. По сравнению с отдельными ферментами FAEA и XYNB был получен более высокий синергический эффект при использовании FLX и FLXLC для обоих субстратов. Более того, синергизм выделения феруловой кислоты увеличивался для FLXLC по сравнению с FLX при использовании кукурузных отрубей в качестве субстрата, подтверждая положительную роль CBM. В заключение эти результаты показывают, что образование составных бифункциональных ферментов из природных отдельных гидролаз клеточной оболочки и CBM из A. niger позволяет увеличить синергический эффект разрушения сложных субстратов.

Материалы и методы

Штаммы и культуральные среды

Штамм Escherichia coli JM109 (Promega) использовали для конструирования и культивирования векторов, в то время как A. niger штамм D15#26 (pyrg-) (22) - для продукции рекомбинантных белков. После ко-трансформации векторов, содержащих ген pyrG и экспрессионную кассету FLX или FLXLC соответственно (фиг.1), A. niger выращивался для селекции на твердой минимальной среде (без уридина), содержащей 70 мМ NaNO₃, 7 мМ KCl, 11 мМ KH₂HPO₄, 2 мМ MgSO₄, 1% глюкозы (вес/объем), и следовые элементы [1000x смесь: 76 мМ ZnSO₄, 25 мМ MnCl₂, 18 мМ FeSO₄, 7,1 мМ CoCl₂, 6,4 мМ CuSO₄, 6,2 мМ Na₂MoO₄, 174 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)]. Для скрининга трансформантов на предмет продукции рекомбинантных белков в жидкой среде споры в концентрации 1×10⁶/мл были посеяны в 100 мл культуральной среды, содержащей 70 мМ NaNO₃, 7 мМ KCl, 200 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ MgSO₄, 6% глюкозы (вес/объем) и следовые элементы, в 500 мл колбе с перегородками. Для выделения геномной ДНК использовался штамм BRFM131 (Banque de Ressources Fongiques de Marseille), а полученная ДНК использовалась в качестве матрицы для стратегии ПЦР амплификации линкер-CBM последовательности.

Конструирование экспрессионных векторов и трансформация грибов

Слияние последовательностей, кодирующих FAEA (SEQ ID NO: 19; Y09330), XYNB (SEQ ID NO: 5; AYl 26481), и CBM (SEQ ID NO: 7; AFl 56269) из A. Niger производилось по методу ПЦР с перекрывающейся элонгацией (41), используя 5'-GGACTCATGAAGCAATTCTCTGCAAAATAC-3' (BspHl) в качестве прямого праймера и 5'-ACTGGAGTAAGTCGAGCCCCAAGTACAAGCTCCGCT-3' в качестве обратного праймера. Геномная ДНК, кодирующая линкерную область CBHB (SEQ ID NO: 9; AF156269), была получена амплификацией штамма BRFM131 A. niger с использованием прямого праймера 5'-AGCGGAGCTTGTACTTGGGGCTCGACTTACTCCAGT-3' и обратного праймера 5'-GGTCGAGCTCGGGGTCGACGCCGCCGATGTCGAACT-3'. Наконец, ген xynB был амплифицирован из кДНК (29) с использованием прямого праймера 5'-AGTTCGACATCGGCGGCGTCGACCCCGAGCTCGACC-3' и обратного праймера GGCTAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGAACAGTGATGGACGAAG-S' (Hind III) (His-tag подчеркнут штриховой линией во всех последовательностях). Полученные перекрывающиеся фрагменты смешивались, и составная последовательность синтезировалась в одностадийной реакции с использованием двух внешних праймеров. Конструкция была клонирована в вектор pGEM-T (Promega), а клонированный ПЦР фрагмент проверялся секвенированием. Составной фрагмент был клонирован в NcoI-HindIII линеаризованный и дефосфорилированный pAN52.3 вектор для получения pELX плазмиды (фиг.1А). Плазмида FLXLC была сконструирована с использованием pFLX в качестве матрицы для амплификации фрагмента, кодирующего рекомбинантную последовательность FAEA-линкер-XYNB, с использованием прямого праймера 5'-GGACTCATGAAGCAATTCTCTGCAAAATAC-3' (BspHI) и обратного праймера 5'-ACTGGAGTAAGTCGAGCCCTGAACAGTGATGGACGA-3'. Геномная ДНК из штамма A. niger BRFM131 использовалась в качестве субстрата для ПЦР амплификации последовательности линкер-CBM с помощью двух специфических праймеров, сконструированных на основе имеющейся последовательности cbhB (AF156269): прямой праймер 5'-TCGTCCATCACTGTTCAGGGCTCGACTTACTCCAGT-3' и обратный праймер 5'-ATGCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAAACACTGCGAGTAGTAC-3' (HindIII). Составной фрагмент был синтезирован методом ПЦР с перекрывающейся элонгацией с использованием двух внешних праймеров, проверен сиквенированием и клонирован в вектор pAN52.3 для получения вектора pFLXLC (фиг.1В). В обоих экспрессионных векторах для экспрессии рекомбинантных последовательностей использовались промотор гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (gpdA) A. nidulans, 5' нетранслируемая область мРНК гена gpdA и терминатор trpC A. nidulans. Кроме того, для таргетирования секреции обоих рекомбинантных белков использовался сигнальный пептид (21 аминокислота) из FAEA.

Обе ко-трансформации грибов производились, как описано авторами Punt и van den Hondel (39), с использованием экспрессионных векторов pFLX и pFLXLC соответственно и pAB4-1 (48), содержащим маркер селекции pyrG, в отношении 10:1. Кроме того, штамм D15#26 A. niger был трансформирован геном pyrG без экспрессионного вектора для контрольного эксперимента. Селекция ко-трансформантов на уридиновую прототрофийность проводилась на чашках с селективной минимальной средой (без уридина), которые инкубировались 8 дней при температуре 30°С. Для скрининга трансформантов культивировались и ежедневно проверялись 40 индивидуальных клонов из каждой трансформации.

Скрининг активностей ферулоилэстеразы и ксиланазы

Наблюдения за культурами производились в течение 14 дней при 30°С в инкубаторе со встряхиванием (130 об/мин). pH ежедневно подводился до 5,5 с помощью 1М раствора лимонной кислоты. Каждые культуральные условия повторялись дважды. Ежедневно из жидкой культуральной среды отбирались аликвоты (1 мл), из которых мицелий убирал