Способ индукции дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты

Способ индукции дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу избирательного и эффективного получения кардиомиоцитов из ЭС (ES) клеток и других плюрипотентных стволовых клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

(1) Получение кардиомиоцитов с использованием плюрипотентных стволовых клеток

Как правило, кардиомиоциты претерпевают активное клеточное деление, автономно ритмически сокращаясь, до момента рождения, однако, сразу после рождения они теряют способность к делению, а поскольку у них имеется крайне мало недифференцированных стволовых клеток и клеток-предшественников, чьи способности к росту и дифференциации чрезвычайно низки, то когда кардиомиоциты гибнут, подвергаясь различным формам стресса, включая инфаркт миокарда, миокардит и тому подобное, погибшие кардиомиоциты не могут регенерировать. В результате функция миокарда поддерживается за счет сохранившихся кардиомиоцитов, которые подвергаются компенсаторной гипертрофии и тому подобному, однако, если стресс продолжается и его уровень превышает допустимое пороговое значение, это ведет к дальнейшему истощению и гибели кардиомиоцитов и последующему снижению функции миокарда (то есть сердечной недостаточности).

Сердечная недостаточность и другие типы сердечных заболеваний являются второй по значению причиной смерти в Японии, и прогноз является весьма неблагоприятным при 5-летней выживаемости всего лишь примерно 50% пациентов с сердечными заболеваниями. Поэтому есть надежда, что разработка высокоэффективных способов лечения сердечной недостаточности приведет к значительным успехам в области медицинского обслуживания и экономики здравоохранения. Общепринятые лекарственные средства для терапии сердечной недостаточности включают препараты дигиталиса, которые увеличивают силу сокращения миокарда, а также препараты ксантина и других сердечных стимуляторов, однако, как известно, долгосрочное введение данных лекарственных средств приводит к ухудшению состояния, так как расходуется слишком много энергии миокарда. Совсем недавно основной акцент в терапии сместился в сторону β-блокаторов и ингибиторов АПФ (ACE), которые снижают избыточную нагрузку на сердце за счет стимуляции симпатической нервной системы и системы «ренин-ангиотензин», однако, данные способы действуют только на непосредственные симптомы и не могут восстанавливать поврежденную сердечную ткань. Напротив, трансплантация сердца является фундаментальным лечением тяжелой сердечной недостаточности, однако, ее сложно применять повсеместно вследствие таких проблем, как нехватка доноров сердца, этических вопросов, физической и финансовой нагрузки на пациентов и тому подобного.

Вследствие этого, очевидно, что способы трансплантации для замены ослабленных или погибших кардиомиоцитов будут чрезвычайно полезны для лечения сердечной недостаточности. Действительно, из экспериментов с животными известно, что если незрелые кардиомиоциты, полученные из плода, трансплантировать во взрослую сердечную ткань, трансплантированные клетки функционируют эффективно (см. не патентный документ 1). Однако сложно получать достаточное количество кардиомиоцитов для данного способа и применение его в клинической медицине также осложнено с этической точки зрения.

Вследствие этого в последние годы внимание было сосредоточено на индукции дифференциации стволовых клеток в кардиомиоциты и использовании этих клеток для трансплантации. В настоящее время еще не представляется возможным точно идентифицировать популяцию клеток-предшественников или стволовых клеток, способных образовывать кардиомиоциты в сердечной ткани взрослых особей, так что плюрипотентные стволовые клетки, которые являются менее дифференцированными и способны дифференцироваться в различные клетки, считаются полезными для вышеуказанного способа.

Плюрипотентные стволовые клетки определяют как клетки, которые способны к бесконечной или долговременной клеточной пролиферации в культуре in vitro, оставаясь при этом в недифференцированном состоянии, которые сохраняют нормальные кариотипы и которые обладают способностью дифференцироваться во все три зародышевых слоя (эктодерму, мезодерму и эндодерму) при соответствующих условиях. Три хорошо известных типа плюрипотентных стволовых клеток представляют собой эмбриональные стволовые клетки (ЭС (ES) клетки), происходящие из эмбрионов на ранней стадии развития, эмбриональные зародышевые клетки (ЭЗ (EG) клетки), происходящие из примордиальных зародышевых клеток на эмбриональной стадии, и зародышевые стволовые клетки (ЗС (GS) клетки), происходящие из семенников непосредственно после рождения.

В частности, давно известно, что можно индуцировать дифференциацию ЭС клеток в кардиомиоциты in vitro. В большинстве ранних исследований использовали мышиные ЭС клетки. Если ЭС клетки культивируют в суспензионной культуре как одиночные клетки (отдельные клетки диспергированы без межклеточной адгезии в результате обработки ферментами или т.п.) в отсутствие фактора, ингибирующего дифференциацию, такого как фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), или т.п., ЭС клетки слипаются друг с другом и агрегируют, образуя структуру, называемую эмбриоидные тельца (ЭТ) (EBs), которые похожи на ранние эмбриональные структуры. Также известно, что кардиомиоциты со способностью к спонтанному ритмическому сокращению возникают, когда данные ЭТ культивируют в суспензии или при прикреплении к поверхности устройств для культивирования.

Кардиомиоциты, происходящие из ЭС клеток, полученные как описано выше, обладают свойствами, очень схожими с таковыми у незрелых кардиомиоцитов из сердца плода (см. не патентные документы 2 и 3). Более того, эксперименты на животных подтвердили, что если кардиомиоциты, происходящие из ЭС клеток, трансплантировать во взрослую сердечную ткань, они являются высокоэффективными, демонстрируя результаты, сходные с теми, что получены при трансплантации миокарда плода (см. патентный документ 1, не патентный документ 4).

В 1995 г. Thomson et al. впервые получили линию ЭС клеток из приматов (см. патентный документ 2, не патентный документ 5), благодаря чему регенерационная терапия с использованием кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, стала реальностью. Впоследствии они также добились успеха в выделении и получении линий ЭС клеток человека из человеческих эмбрионов на ранней стадии развития (см. не патентный документ 6). Кроме того, Gearhart et al. получили линии ЭС клеток человека из человеческих примордиальных зародышевых клеток (см. не патентный документ 7, патентный документ 3).

Kehat et al. (см. не патентный документ 8) и Xu et al. (см. патентный документ 4, не патентный документ 9) сообщали, что человеческие ЭС клетки могут дифференцироваться в кардиомиоциты in vitro подобно мышиным ЭС клеткам. Согласно этим сообщениям кардиомиоциты, полученные из человеческих ЭС клеток, не только обладают способностью спонтанно ритмически сокращаться, но также экспрессируют и продуцируют специфические для миокарда белки, такие как тяжелые и легкие цепи миозина, α-актинин, тропонин I и предсердный натрийуретический пептид (ANP), а также специфические для миокарда факторы транскрипции, такие как GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c и т.п., а из результатов гистологических исследований и электрофизиологического анализа следует, что они сохраняют свойства незрелых кардиомиоцитов на стадии плода и могут быть использованы для регенерационной терапии.

Однако, чтобы использовать кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, для терапии методом клеточной трансплантации и других целей, следует решить одну серьезную проблему. Когда ЭТ образуются из ЭС клеток или ЭЗ клеток обычными способами, развиваются не только кардиомиоциты, но также и другие типы дифференцированных клеток, такие как клетки крови, клетки сосудов, нервные клетки, клетки кишечника, костные и хрящевые клетки и тому подобное. Кроме того, относительное содержание кардиомиоцитов в данной популяции дифференцированных клеток не слишком велико, всего лишь примерно от 5% до 20% от общего количества.

Способы выделения только кардиомиоцитов из смеси различных типов клеток включают способ введения искусственной модификации в гены ЭС клеток, придающей устойчивость к лекарственным средствам или эктопическую экспрессию, и отбор клеток, обладающих свойствами кардиомиоцитов или их клеток-предшественников. Например, путем введения генного кластера, способного экспрессировать ген устойчивости к неомицину (G418) под контролем промотора тяжелой цепи α-миозина, в мышиные ЭС клетки Field и его соавторы создали систему, в которой эти ЭС клетки могли выживать в среде, в которую добавлен G418, только когда они дифференцировались в кардиомиоциты и экспрессировали ген тяжелой цепи α-миозина (см. патентный документ 1, не патентный документ 4). Было подтверждено, что 99% или более G418-устойчивых клеток, отобранных с помощью данного способа, представляют собой кардиомиоциты. Однако, хотя в данном способе степень чистоты кардиомиоцитов является чрезвычайно высокой, количество кардиомиоцитов, полученных в итоге, составляет всего несколько процентов от общего количества клеток, что весьма затрудняет получение достаточных для трансплантации количеств кардиомиоцитов.

Xu et al. сообщали, что если человеческие ЭС клетки обработать 5-азацитидином, процентное содержание тропонин I-позитивных клеток (кандидатов в кардиомиоциты) в ЭТ возрастает с 15% до 44% (см. не патентный документ 9), но даже в данном способе процентное содержание кардиомиоцитов в ЭТ не превышает 50%. Кроме того, 5-азацитидин представляет собой деметилирующее вещество, которое изменяет экспрессию генов путем удаления метиловых групп, связанных с ДНК, и поскольку оно действует непосредственно на хромосомы, оно не является подходящим лекарственным средством для получения клеток, предназначенных для клеточной трансплантации.

Другие способы более эффективного получения кардиомиоцитов из ЭС клеток включают, в случае мышиных ЭС клеток, добавление ретиноевой кислоты (см. не патентный документ 10), аскорбиновой кислоты (см. не патентный документ 11), TGF β, BMP-2 (см. не патентный документ 12), PDGF (см. не патентный документ 13) и динорфина B (см. не патентный документ 14), а также обработку для увеличения содержания активных форм кислорода (ROS) (см. не патентный документ 15) и Ca²⁺ (см. не патентный документ 16) в клетках, все эти способы, как известно, положительно влияют на индукцию дифференциации кардиомиоцитов. Однако ни одним из данных способов не удается достичь специфической для кардиомиоцитов или избирательной дифференциации. Недавно исследовательская группа, включая авторов данного изобретения, продемонстрировала, что если ЭС клетки временно обработать антагонистом BMP, дифференциацию в кардиомиоциты можно индуцировать более эффективно и избирательно, чем обычными способами (патентный документ 5, не патентный документ 17).

(2) Функциональные роли белков Wnt в процессе дифференциации и развития кардиомиоцитов

Белки Wnt, которые являются секреторными белками, представляют собой членов семейной группы белков, которые широко представлены не только у позвоночных животных, но также у беспозвоночных животных, таких как нематоды и насекомые, и, как известно, их семейство генов имеет множество молекулярных видов (не патентные документы 18 и 19). Например, до настоящего времени были идентифицированы 19 генов Wnt у человека и мыши (Wnt-1, 2, 2b/13, 3, 3a, 4, 5a, 5b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 10b, 11, 16). Белки Wnt, кодируемые данными генами Wnt, имеют различную тканевую специфичность, но являются сходными по структуре.

Если белки Wnt играют роль лигандов в межклеточных сигнальных системах, они связываются с расположенными на клеточной мембране рецепторами семейства Frizzled (далее сокращенное обозначение Fzd) с семью трансмембранными доменами. Существует несколько метаболических путей в нисходящем направлении от Fzd рецепторов и наиболее важный путь представляет собой ингибирование фосфорилирования β-катенина, опосредованное гликиген синтазой киназой (GSK)-3β. В отсутствие сигналов Wnt β-катенин захватывается вместе с GSK-3β аксином на белке Adenomatous polyposis coli (APC) и быстро фосфорилируется GSK-3β. Фосфорилированный β-катенин подвергается убиквитинированию и опосредованной протеасомами деградации.

С другой стороны, когда белки Wnt связываются с Fzd рецепторами, внутриклеточный фактор Dishevelled активируется для захвата GSK-3β, в результате чего β-катенин не фосфорилируется и остается в свободной форме в цитоплазме, а затем мигрирует в ядро. После миграции в ядро β-катенин связывается с лимфоидным энхансерным фактором-1/T-клеточным фактором (далее сокращенное обозначение LEF-1/TCF), присутствующими в ядре, с образованием транскрипционного активаторного комплекса, тем самым индуцируя транскрипцию целевого гена. Такой путь передачи сигнала, при котором происходит накопление и миграция в ядро β-катенина, называется «классическим» путем Wnt или каноническим сигнальным путем Wnt, а семейство видов молекул (например, Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-8a), способных активировать данный путь, называется каноническими Wnt. Также известно, что активация канонического сигнального пути Wnt индуцируется обработкой различными ингибиторами GSK-3β.

Известно, что лиганды Wnt активируют не только β-катениновый путь, но также и другие сигнальные пути через Fzd рецепторы. Такие сигнальные пути включают путь планарной клеточной полярности (PCP), который активирует JNK (N-концевую киназу Jun), своего рода MAP-киназу, а также Ca²⁺-путь, который приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Ca²⁺ и активирует протеинкиназу C путем активации тримерного G-белка и последующей активации фосфолипазы C (не патентные документы 19 и 20). Данные пути называют «неклассическими» путями Wnt или неканоническими сигнальными путями Wnt в отличие от канонического сигнального пути Wnt. Сообщают, что Wnt-4 и Wnt-11 представляют собой молекулы семейства Wnt, способные активировать такие пути, и эти лиганды Wnt действуют, ингибируя канонический сигнальный путь Wnt.

Следует отметить, что некоторые молекулярные виды белка Wnt обладают способностью активировать как канонический, так и неканонический пути в зависимости от типа клеток-мишеней и стадии их дифференциации, а также различий в Fzd рецепторах, экспрессированных в клетках-мишенях. Например, известно, что Wnt-5a действует как неканонический Wnt в обычно используемых системах анализа, таких как образование вторичной оси в эмбрионах Xenopus laevis и канцерогенез эпителиальных клеток молочной железы, в то время как сообщают также, что Wnt-5a индуцирует стабилизацию β-катенина и его транскрипционную активность в ЭС клетках, то есть активирует канонический сигнальный путь Wnt в ЭС клетках (не патентный документ 21).

Известно, что белки Wnt вовлечены в большое многообразие биологических функций на протяжении развития, роста и дифференциации различных клеток, тканей и злокачественных новообразований. Кардиомиоциты развиваются из части мезодермы боковой пластины на ранней стадии развития, а затем многократно делятся и растут, образуя сердце. Наличие или отсутствие сигналов Wnt играет важную роль в данном процессе, как продемонстрировано в разных случаях. В качестве примера, на ранней стадии развития птиц или Xenopus laevis, эктопическая и/или вынужденная экспрессия гена Wnt-3a или Wnt-8a, который активирует канонический сигнальный путь Wnt, существенно ингибирует формирование сердца (не патентные документы 22 и 23).

С другой стороны, так называемые антагонисты Wnt (например, Frzb, Dkk-1), которые связываются с Wnt-3a или Wnt-8a, ингибируя передачу ими сигнала, способствуют формированию сердца, из чего следует, что канонические сигналы Wnt ингибируют развитие миокарда.

Напротив, известно, что активация неканонических сигнальных путей Wnt, которые антагонистичны каноническим сигналам Wnt, способствует индукции развития и дифференциации кардиомиоцитов. Pandur et al. (не патентный документ 24) показали, что Wnt-11, который активирует неканонические пути без активирования канонического пути, является фактором, необходимым для развития сердца у Xenopus laevis. Впоследствии стимулирующее действие Wnt-11 было также подтверждено в системах индукции миокардиальной дифференциации для мышиных ЭС клеток (не патентный документ 25) и человеческих клеток-предшественников эндотелия сосудов (не патентный документ 26). Что касается активации неканонических сигнальных путей Wnt, то известно также, что можно индуцировать дифференциацию кардиомиоцитов из клеток ткани языка (патентный документ 6).

С другой стороны, в отличие от вышеизложенных случаев, известно, что активация канонического сигнального пути Wnt стимулирует миокардиальную дифференциацию из клеток эмбриональной карциномы (ЭК клетки). Клетки P19CL6, сублиния клеток P19, которые являются своего рода ЭК клетками, обладают свойством дифференцироваться в кардиомиоциты при стимуляции диметилсульфоксидом (DMSO). Когда в среду добавляли Wnt-3a или Wnt-8, клетки P19CL6 были стимулированы к дифференциации в кардиомиоциты поскольку β-катенин был стабилизирован (не патентный документ 27). В данной системе также показано, что период времени, достаточный для добавления белка Wnt, составляет 4 дня сразу же после индукции дифференциации (не патентный документ 28).

Клеточные линии P19 обладают характеристиками, частично схожими с таковыми у ЭС клеток в том, что их можно индуцировать для дифференциации в кардиомиоциты и нейроны. Однако клеточные линии P19 не обладают способностью дифференцироваться в различные клетки или способностью образовывать химеры в отличие от ЭС клеток. Кроме того, клеточные линии P19 сильно отличаются от ЭС клеток по маркерам клеточной поверхности, экспрессированным генам и так далее. То есть клеточные линии P19 можно использовать в качестве модельной системы для ЭС клеток в определенных экспериментах, но они не всегда обладают теми же характеристиками, что ЭС клетки. Таким образом, на основании научных данных было невозможно предсказать, можно ли результаты, полученные в данной экспериментальной системе, напрямую экстраполировать в системы индукции миокардиальной дифференциации для ЭС клеток и других плюрипотентных стволовых клеток.

Недавно сообщалось, что в экспериментальных системах с использованием мышиных ЭС клеток белок Wnt-3a, член канонического Wnt, стимулирует миокардиальную дифференциацию из ЭС клеток, будучи добавлен на 3 дня после начала индукции дифференциации (Naito A. et al., 28th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 2005.12.7 to 2005.12.10, Hakata, Japan; не патентный документ 30). Однако аналогичные исследования, проведенные авторами данного изобретения, свидетельствовали о том, что существенный стимулирующий эффект на дифференциацию отсутствовал (пример 2), и другие исследовательские группы также сообщали, что обработка мышиных ЭС клеток Wnt-3a не приводит к существенному эффекту на индукцию миокардиальной дифференциации (не патентный документ 25) или вызывает ингибиторный эффект на миокардиальную дифференциацию (не патентный документ 29). То есть, не ясно, как активированный канонический путь Wnt влияет на миокардиальную дифференциацию из ЭС клеток или других плюрипотентных стволовых клеток. При данных обстоятельствах не существует разработанного оптимального способа культивирования для индукции миокардиальной дифференциации.

Патентный документ 1: патент США № 6015671

Патентный документ 2: патент США № 5843780

Патентный документ 3: патент США № 6090622

Патентный документ 4: WO03/06950

Патентный документ 5: WO2005/033298

Патентный документ 6: JP 2005-224155 A

Не патентный документ 1: Soonpaa MH et al., Science, 264:98, 1994

Не патентный документ 2: Maltsev VA et al., Mechanism of Development, 44:41, 1993

Не патентный документ 3: Maltsev VA et al., Circulation Research, 75:233, 1994

Не патентный документ 4: Klug MG et al., Journal of Clinical Investigation, 98:216, 1996

Не патентный документ 5: Thomson JA et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92:7844, 1995

Не патентный документ 6: Thomson JA et al., Science, 282:1145, 1998

Не патентный документ 7: Shamblott MJ et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95:13726, 1998

Не патентный документ 8: Kehat I et al., Journal of Clinical Investigation, 108:407, 2001

Не патентный документ 9: Xu C et al., Circulation Research, 91:501, 2002

Не патентный документ 10: Wobus AM et al., Journal of Molecular and cellular Cardiology, 29:1525, 1997

Не патентный документ 11: Takahashi T et al., Circulation, 107:1912, 2003

Не патентный документ 12: Behfar A et al., FASEB Journal, 16:1558, 2002

Не патентный документ 13: Sachinidis et al., Cardiovascular Research, 58:278, 2003

Не патентный документ 14: Ventura C et al., Circulation Research, 92:623, 2003

Не патентный документ 15: Sauer H et al., FEBS Letters, 476:218, 2000

Не патентный документ 16: Li J et al., Journal of Cell Biology, 158:103, 2002

Не патентный документ 17: Yuasa S et al., Nature Biotechnology, 23:607, 2005

Не патентный документ 18: Nusse R, Cell Research, 15:28, 2005

Не патентный документ 19: Widelitz R, Growth Factors, 23:111, 2005

Не патентный документ 20: Kühl M et al., Trends in Genetics, 16:279, 2000

Не патентный документ 21: Hao J et al., Developmental Biology, 290:81, 2006

Не патентный документ 22: Schneider VA & Mercola M, Genes and development, 15:304, 2001

Не патентный документ 23: Marvin MJ et al., Genes and Development, 15:316, 2001

Не патентный документ 24: Pandur P et al., Nature, 418:636, 2002

Не патентный документ 25: Terami H et al., Biochemical and Biophysical Research Communication, 325:968, 2004

Не патентный документ 26: Koyanagi M et al., Journal of Biological Chemistry, 280:16838, 2005

Не патентный документ 27: Nakamura T et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100:5834, 2003

Не патентный документ 28: Naito AT et al., Circulation Research, 97:144, 2005

Не патентный документ 29: Yamashita JK et al., FASEB Journal, 19:1534, 2002

Не патентный документ 30: Naito AT et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103:19812, 2006.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу эффективной и избирательной индукции дифференциации недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты посредством активирования канонического сигнального пути Wnt, а также к кардиомиоцитам, полученным с помощью данного способа, и к способу использования данных клеток для клеточной трансплантации и инъекции, а также других видов терапии, направленной на заболевания сердца.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

В качестве источника стволовых клеток для получения кардиомиоцитов авторы данного изобретения использовали плюрипотентные стволовые клетки, особенно ЭС клетки, которые наиболее часто используют, и в результате интенсивных исследований условий для индукции дифференциации в кардиомиоциты или их клетки-предшественники они совершили настоящее изобретение, когда обнаружили, что если вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt (далее называемое «активатор передачи сигнала Wnt»), добавляли к среде во время определенной ограниченной стадии клеточной культуры, популяции клеток, обладающих способностью ритмично сокращаться, которые были идентифицированы как кардиомиоциты, развивались гораздо более избирательно и эффективно, чем при обычно используемых способах.

Плюрипотентные стволовые клетки, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают ЭС клетки, ЭЗ клетки и ЗС клетки, полученные от млекопитающих, таких как мыши, обезьяны и люди, а также все плюрипотентные стволовые клетки, которые сходны по характеристикам с ЭС клетками. В данном случае сходство по характеристикам с ЭС клетками определяют в контексте клеточно-биологических свойств, уникальных для ЭС клеток, таких как присутствие специфических для ЭС клеток поверхностных маркеров (антигенов), экспрессия специфических для ЭС клеток генов или способность образовывать тератомы или мышей-химер.

По настоящему изобретению конкретные примеры вещества, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, включают различные канонические белки Wnt, ингибиторы GSK-3β и другие низкомолекулярные соединения, способные активировать канонический сигнальный путь Wnt. Можно также использовать гены, способные активировать канонический сигнальный путь Wnt, например различные гены канонических Wnt, а также ген β-катенина или их активные мутанты, которые модифицированы для удаления N-конца или для замены сайтов фосфорилирования GSK-3β нефосфорилированными аминокислотами.

По настоящему изобретению канонические белки Wnt являются членами группы белков семейства Wnt и их определяют как вещества, которые связываются с рецепторами семейства Fzd и ингибируют опосредованное GSK-3β фосфорилирование β-катенина, тем самым стимулируя стабилизацию β-катенина и его способность активировать транскрипцию. Предпочтительные канонические белки Wnt по настоящему изобретению включают, например, Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a и Wnt-8a, а также те, которые имеют гомологию аминокислотной последовательности по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90% с данными белками и обладают способностью активировать β-катенин.

Одной из характерных особенностей настоящего изобретения является то, что ЭС клетки или другие плюрипотентные стволовые клетки временно стимулируют активатором передачи сигнала Wnt, и хотя способ стимулирования особо не ограничен, предпочтительным является способ культивирования клеток в среде, содержащей канонический белок Wnt, например рекомбинантный вариант белка (далее называемый «рекомбинантный белок Wnt»), полученный при экспрессии очищенного гена канонического Wnt. Канонический белок Wnt для использования и ген, кодирующий его, предпочтительно получают от животных тех же видов, которые использовали для получения плюрипотентных стволовых клеток, однако можно использовать и те, что получены от животных других видов. В случае использования рекомбинантного белка Wnt культуральную среду стерильно удаляют и заменяют свежей средой, содержащей рекомбинантный белок Wnt в концентрации от 0,1 нг/мл до 500 нг/мл, предпочтительно от 1 нг/мл до 200 нг/мл, более предпочтительно от 10 нг/мл до 100 нг/мл, и продолжают культивирование.

В соответствии с настоящим изобретением ингибиторы GSK-3β определяют как вещества, которые ингибируют киназную активность белка GSK-3β (например, способность фосфорилировать β-катенин), и к настоящему времени известны более нескольких десятков ингибиторов. Конкретные примеры включают производное индирубина BIO (также называемое ингибитор IX GSK-3β, 6-броминдирубин-3'-оксим), производное малеимида SB216763 (3-(2,4-дихлорфенил)-4-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион), фенил-α-бромметилкетоновое соединение ингибитор VII GSK-3β (4-дибромацетофенон), а также проникающий в клетку фосфорилированный пептид L803-mts (также называемый пептидный ингибитор GSK-3β, Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂). Данные соединения коммерчески доступны от Calbiochem или Biomol и легки в применении, однако список ими не ограничивается.

В случае использования этих ингибиторов GSK-3β, их оптимальная концентрация будет сильно варьировать в зависимости от различий в свойствах соединений. По этой причине необходимо определять оптимальную концентрацию каждого соединения, которое будет использовано. Например, в случае BIO или SB216763, для замены среды используют среду, содержащую ингибитор GSK-3β предпочтительно в концентрации от 10 нмоль/л до 1 мкмоль/л, более предпочтительно от 50 нмоль/л до 200 нмоль/л, и продолжают культивирование. При добавлении ингибитора VII GSK-3β концентрация предпочтительно составляет от 2 мкмоль/л до 100 мкмоль/л и более предпочтительно от 5 мкмоль/л до 20 мкмоль/л. При добавлении L803-mts концентрация предпочтительно составляет от 5 мкмоль/л до 500 мкмоль/л, более предпочтительно от 20 мкмоль/л до 200 мкмоль/л, и еще более предпочтительно от 25 мкмоль/л до 200 мкмоль/л.

Кроме ингибиторов GSK-3β, лекарственные средства, используемые для осуществления настоящего изобретения, могут представлять собой низкомолекулярные соединения, которые стимулируют активацию канонического сигнального пути Wnt (далее называемые «агонисты Wnt»). Предпочтительные примеры включают производное аминопиримидина (2-амино-4-[3,4-(метилендиокси)бензиламино]-6-(3-метоксифенил)пиримидин, Calbiochem) (Liu et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44:1987, 2005). В случае использования такого агониста Wnt, для замены среды используют среду, содержащую агонист Wnt в концентрации от 1 нмоль/л до 1000 нмоль/л, предпочтительно от 10 нмоль/л до 500 нмоль/л, более предпочтительно от 50 нмоль/л до 200 нмоль/л, и продолжают культивирование.

Срок для обработки активатором передачи сигнала Wnt можно определить на основании схем экспрессии различных генов канонических Wnt в процессе дифференциации в плюрипотентных стволовых клетках, используемых для осуществления настоящего изобретения. Более конкретно, индуцируют дифференциацию плюрипотентных стволовых клеток обычным образом и из периодически отобранных образцов выделяют мРНК, чтобы анализировать уровни экспрессии различных генов канонических Wnt стандартными методами, такими как ОТ-ПЦР (RT-PCR). Момент времени, в который уровни экспрессии генов канонических Wnt существенно повышены после индукции дифференциации по сравнению с недифференцированными плюрипотентными столовыми клетками, определяют как «период повышенной экспрессии генов Wnt». Хотя для анализа можно использовать один ген канонического Wnt, предпочтительно использовать два или больше, более предпочтительно три или больше генов.

При осуществлении настоящего изобретения плюрипотентные стволовые клетки культивируют в среде, не содержащей активатора передачи сигнала Wnt на протяжении периода времени между моментом сразу после инициации культуры для индукции миокардиальной дифференциации и 24 часами до периода повышенной экспрессии генов Wnt, определенного как описано выше. Далее плюрипотентные стволовые клетки культивируют в среде, содержащей активатор передачи сигнала Wnt, предпочтительно в течение 24-96 часов, более предпочтительно в течение 48-72 часов, начиная с момента времени, составляющего от 24 до 0 часов, предпочтительно 24 часа до периода повышенной экспрессии генов Wnt, определенного как описано выше. Следует отметить, что период времени, в течение которого клетки обрабатывают активатором передачи сигнала Wnt, можно изменять для достижения оптимального периода (часы) в зависимости от различий в условиях, таких как виды животных, от которых получены клетки, которые будут использованы, тип используемой клеточной линии и/или тип используемого активатора передачи сигнала Wnt.

Кардиомиоциты, полученные из ЭС клеток или других плюрипотентных стволовых клеток вышеуказанным способом, затем можно собрать, выделить и очистить известными способами, чтобы эффективно получить большие количества высокоочищенных кардиомиоцитов. Полученные таким образом кардиомиоциты далее называются кардиомиоцитами, полученными в соответствии с настоящим изобретением.

Кардиомиоциты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой клетки, которые обладают морфологическими, физиологическими и/или иммуноцитологическими характеристиками кардиомиоцитов. В контексте физиологических и/или иммуноцитологических характеристик клетки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут экспрессировать один или более маркеров, специфических для кардиомиоцитов, которые распознаются как кардиомиоциты, однако этим не ограничивается.

Кроме того, кардиомиоциты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать в методах скрининга, направленного на выявление потенциальных химиотерапевтических лекарственных средств или новых факторов, которые стимулируют развитие, дифференциацию, регенерацию, выживание, и тому подобное, кардиомиоцитов.

Кроме того, кардиомиоциты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать в способах лечения сердца, пораженного сердечными заболеваниями.

То есть настоящее изобретение относится, но без ограничения, к следующему.

(1) Способ индукции дифференциации кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток, который включает:

i) культивирование плюрипотентных стволовых клеток в культуральной среде, не содержащей вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, на протяжении периода времени между началом индукции дифференциации и 24 часами перед периодом повышенной экспрессии генов канонических Wnt, а затем

ii) культивирование плюрипотентных стволовых клеток в культуральной среде, содержащей вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, на протяжении периода времени от 24 до 96 часов, начиная с 24 до 0 часов перед периодом повышенной экспрессии генов канонических Wnt.

(2) Способ по п. (1) выше, где плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной среде, содержащей вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, начиная с 24 часов перед периодом повышенной экспрессии генов канонических Wnt.

(3) Способ по п. (1) или (2) выше, где плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной среде, содержащей вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, на протяжении периода времени от 48 до 72 часов.

(4) Способ по любому из п.п. (1)-(3) выше, где вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из канонического белка Wnt, ингибитора GSK3β и агониста Wnt.

(5) Способ по п. (4) выше, где вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, представляет собой канонический белок Wnt.

(6) Способ по п. (5) выше, где канонический белок Wnt представляет собой, по меньшей мере, один белок Wnt, выбранный из группы, состоящей из Wnt-1, Wnt-3a и Wnt-5a.

(7) Способ по п. (5) или (6) выше, где концентрация канонического белка Wnt в культуральной среде составляет от 0,1 нг/мл до 500 нг/мл.

(8) Способ по п. (4) выше, где вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, представляет собой ингибитор GSK3β.

(9) Способ по п. (8) выше, где ингибитор GSK3β представляет собой, по меньшей мере, один ингибитор, выбранный из группы, состоящей из ингибитора VII GSK3β, L803-mts, SB216763 и ингибитора IX GSK3β (BIO).

(10) Способ по п. (8) или (9) выше, где концентрация ингибитора GSK3β в культуральной среде составляет от 2 мкмоль/л до 100 мкмоль/л для ингибитора VII GSK3β, от 5 мкмоль/л до 500 мкмоль/л для L803-mts, от 10 нмоль/л до 1 мкмоль/л для SB216763 или от 10 нмоль/л до 1 мкмоль/л для ингибитора IX GSK3β (BIO).

(11) Способ по п. (4) выше, где вещество, которое стимулирует активацию канонического сигнального пути Wnt, представляет собой агонист Wnt.

(12) Способ по п. (11) выше, где агонист Wnt представляет собой производное аминопиримидина.

(13) Способ по п. (11) или (12) выше, где концентрация агониста Wnt в культуральной среде составляет от 1 нмоль/л до 1000 нмоль/л.

(14) Способ по любому из п.п. (1)-(13) выше, где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, эмбриональные зародышевые клетки или зародышевые стволовые клетки.

(15) Способ по п. (14) выше, где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.

(16) Способ по п. (14) или (15) выше, где плюрипотентные стволовые клетки человеческого происхождения.

ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Используя способ настоящего изобретения, можно очень эффективно и избирательно получать миокардиальные клетки-предшественники и кардиомиоциты из ЭС клеток и других плюрипотентных стволовых клеток. Клетки кардиомиоциты (предшественники), полученные способом настоящего изобретения, можно использовать для поиска и разработки эффективных лекарственных средств для лечения заболеваний сердца и потенциально можно применять для трансплантационной терапии миокарда в случае тяжелого сердечного заболевания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[Фиг. 1A] На фиг. 1A представлены изменения экспрессии гена Wnt в процессе индукции дифференциации в ЭС клетках. Символы на фигуре означают следующее. Белые кружки: необработанная группа, заштрихованные квадраты: группа, обработанная хордином, заштрихованные треугольники: группа, обработанная DAN. Вертикальные оси представляют собой сравнительное отношение уровней экспресии гена Wnt и гена GAPDH, использованного в качестве внутреннего стандарта. Аналогично, звездочкой (*) отмечен момент времени, в который уровень экспрессии гена Wnt был значительно повышен по сравнению с недифференцированными ЭС клетками.

[Фиг. 1B] На фиг. 1B представлены изменения экспрессии гена Wnt в процессе индукции дифференциации в ЭС клетках. Символы на фигуре означают следующее. Белые кружки: необработанная группа, заштрихова