Рекомбинантный слитый человеческий белок epo-fc с продленным временем полужизни и повышенной эритропоэтической активностью in vivo (варианты), димерная белковая конструкция, димерный белок, фармацевтическая композиция, последовательность нуклеиновой кислоты (варианты), вектор экспрессии, клетка, способ получения белка и способ стимуляции эритропоэза у млекопитающего

Рекомбинантный слитый человеческий белок epo-fc с продленным временем полужизни и повышенной эритропоэтической активностью in vivo (варианты), димерная белковая конструкция, димерный белок, фармацевтическая композиция, последовательность нуклеиновой кислоты (варианты), вектор экспрессии, клетка, способ получения белка и способ стимуляции эритропоэза у млекопитающего

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Связанные заявки

Эта заявка относится и основана на заявке на патент США №11/340 661, поданной 27 января 2006 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Данная заявка относится к слитым белкам человеческого эритропоэтина.

Уровень техники

Человеческий эритропоэтин (ЕРО), представитель семейства факторов роста системы эритропоэза, синтезируется в основном в почках взрослых и в печени плода в ответ на гипоксию ткани вследствие сниженной доступности кислорода крови [1]. Принципиальная функция ЕРО состоит в том, чтобы действовать непосредственно на определенных прародителей и предшественников эритроцитов (red blood cells, RBC) в костном мозге, чтобы стимулировать синтез гемоглобина и зрелых RBC. Он также регулирует пролиферацию, дифференциацию и созревание RBC. Был получен рекомбинантный ЕРО, имеющий аминокислотную последовательность природного ЕРО, который был разрешен к применению для лечения связанной с нарушением функции почек анемии, рака и других патологических состояний [2]. Результаты недавних исследований [3] показали, что ЕРО, помимо связанных с эритропоэзом свойств, действует также на клетки не из костного мозга, такие как нейроны, что позволяет предположить наличие у ЕРО других возможных физиологических/патологических функций в центральной нервной системе (ЦНС) и других органах/системах. Поскольку рецепторы ЕРО были обнаружены во многих различных органах, ЕРО может иметь многие биологические функции, такие как действие в качестве антиапоптозного агента.

Человеческий ЕРО представляет собой гликопротеин с молекулярным весом 30,4 кДа. Углеводы составляют приблизительно 39% его общей массы. Ген ЕРО расположен в хромосоме 7q11-22 и занимает область длиной 5,4 тысяч пар нуклеотидов (тыс.п.н.) с 5 экзонами и 4 интронами [4]. Предшественник ЕРО состоит из 193 аминокислот. Отщепление лидерной последовательности и последней аминокислоты Arg в ходе пост-трансляционной модификации дает зрелый ЕРО, имеющий 165 аминокислот. Гликозилирование, с тремя N-сайтами в положениях Asn 24, Asn38, Asn83 и одним O-сайтом в положении Ser-126, играет решающую роль в биосинтезе, образовании третичной структуры и биологической активности in vivo ЕРО [5]. ЕРО функционирует, связываясь с рецептором эритропоэтина - гликозилированным и фосфорилированным трансмембранным полипептидом с молекулярным весом 72-78 кДа. Это связывание запускает гомодимеризацию рецепторов, которая приводит к активации нескольких путей передачи сигнала: системы JAK2/STAT5, белка G, кальциевого канала и киназ. Чтобы достигнуть оптимальной активации рецептора, необходимо одновременное связывание двух молекул белка ЕРО с одной молекулой рецептора [6].

Как первый фактор роста системы гематопоэза, разрешенный для лечения людей, рекомбинантный человеческий ЕРО (rHuEPO) использовали для лечения анемии, являющейся результатом хронической почечной недостаточности, рака (первичной анемии, связанной с химиотерапией), аутоиммунных заболеваний, СПИД, хирургических осложнений, трансплантации костного мозга, миелодиспластических синдромов и т.д. Интересно, что недавние исследования показали также, что rHuEPO имеет функции, не связанные с системой крови, и имеет потенциал для использования в качестве нейропротективного лекарства для лечения церебральной ишемии, травм головного мозга, воспалительных заболеваний и нервно-дегенеративных расстройств [7].

В настоящее время в продаже имеются три типа rHuEPO или аналогов rHuEPO, а именно rHuEPO-α, rНuЕРО-β и дарбепоэтин-α([8]. Эти три рекомбинантных белка связываются с одним и тем же рецептором эритропоэтина, но различаются по структуре, степени гликозилирования, сродству в связывании с рецептором и метаболизму in vivo. Co времени начала использования rHuEPO-α в 1980-х гг. клиницисты быстро установили, что существенным недостатком лекарства является необходимость частых инъекций дозы. Средние времена полужизни in vivo rHuEPO-α и rHuEPO-β при внутривенном или подкожном введении составляют соответственно только 8,5 и 17 ч [9, 10]. Поэтому пациентам необходимо производить инъекции ежедневно, дважды в неделю или три раза в неделю, что создает трудности как для пациентов, так и для работников здравоохранения. Поэтому имеется давняя потребность в разработке рекомбинантных аналогов ЕРО, имеющих более долгое время полужизни in vivo и/или повышенную активность в эритропоэзе.

В предшествующей практике делались попытки генетически изменить или химически модифицировать структуру нативного белка ЕРО, чтобы либо замедлить его метаболизм in vivo, либо улучшить его терапевтические свойства. Например, оказывается, что имеется прямая корреляция между количеством в молекуле ЕРО углеводов, содержащих сиаловые кислоты, и его метаболизмом и функциональной активностью in vivo. Поэтому повышение содержания углеводов в молекуле ЕРО приводит к удлинению времени полужизни и повышению активности in vivo [11, 12]. Фирма Amgen сконструировала аналог rHuEPO дарбепоэтин-α так, чтобы включить в rHuEPO в положении 5N две дополнительные углеводные цепи.

Дарбепоэтин-α известен также как «Новый белок, стимулирующий эритропоэз» (Erythropoiesis Stimulating Protein, NESP), и продается под торговой маркой Aranesp^TM. Дарбепоэтин-α отличается от нативного человеческого ЕРО в пяти положениях аминокислот (Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn, Pro90Thr), что позволяет присоединить два дополнительных N-присоединенных олигосахарида к остаткам аспарагина в положениях 30 и 88. Дарбепоэтин-α связывается с рецептором ЕРО в идентичной нативному ЕРО манере, индуцируя внутриклеточную сигнальную цепь с участием фосфорилирования тирозина киназой JAK-2 и тех же самых внутриклеточных молекул Ras/MAP-k, P13-K и STAT-5. Благодаря повышенному содержанию углеводов, время полужизни дарбепоэтина-α у животных и человека почти втрое длиннее, чем у rHuEPO-α (25,3 ч против 8,5 ч) [9]. Оказывается также, что дарбепоэтин-α (Aranespa^TM) имеет повышенную биологическую активность по сравнению с природным или рекомбинантным человеческим ЕРО in vivo [13] и был разрешен к применению Американским фармакологическим комитетом (FDA) как лекарство rHuEPO второго поколения. Это лекарство необходимо вводить только один раз в неделю, чтобы получить такое же терапевтическое действие, как и при инъекциях 2-3 раза в неделю rHuEPO [10, 14, 15].

Делались другие попытки удлинить время полужизни ЕРО, сосредоточенные на повышении молекулярного веса белка ЕРО с помощью химической конъюгации с полиэтиленгликолем («ПЭГилирование») и подобных методов. ПЭГилированный ЕРО имеет намного больший молекулярный вес, защищен от выведения из кровотока и поэтому имеет более длительное время полужизни в плазме [16]. Однако ПЭГилирование может изменять структуру белка, что может привести к нежелательным изменениям функции и специфичности части ЕРО молекулы. Имеются также сведения об увеличении молекулярного веса ЕРО другими методами - такими как связывание молекулы ЕРО с белком-носителем (человеческим альбумином), или путем гомодимеризации двух полных молекул ЕРО с помощью пептидных мостиков (длиной 3-17 аминокислот) или химических сшивающих реагентов [17,18, 19, 20]. Хотя все эти способы привели к некоторому успеху в продлении времени полужизни и повышении активности ЕРО, комбинирование молекулы ЕРО с фрагментом Fc человеческого иммуноглобулина (IgG) в слитом белке, как это описано в настоящей заявке, обеспечивает уникальные преимущества.

Человеческий иммуноглобулин IgG состоит из четырех полипептидов (по две идентичных копии легкой цепи и тяжелой цепи), соединенных ковалентно дисульфидными связями. Протеолиз молекулы IgG папаином дает два фрагмента Fab и один фрагмент Fc. Фрагмент Fc состоит из двух полипептидов, соединенных дисульфидными связями. Каждый полипептид от N-конца к С-концу состоит из шарнирной области, домена СН2 и домена СНЗ. Структура фрагмента Fc почти одинакова у всех подтипов человеческого иммуноглобулина. IgG входит в число самых преобладающих белков человеческой крови и составляет от 70 до 75% всех иммуноглобулинов в человеческой сыворотке. Время полужизни IgG в кровотоке наибольшее среди всех пяти типов иммуноглобулина и может достигать 21 дня.

Современная технология биоинженерии была с успехом применена для создания слитых белков, состоящих из фрагментов терапевтических белков, таких как цитокины и растворимые рецепторы, и фрагмента Fc человеческого IgG [21, 22, 23, 24]. Эти слитые белки имеют значительно большее время полужизни in vivo и при этом сохраняют свои биологические и терапевтические свойства. Поэтому содержащие фрагмент Fc слитые белки были с успехом разработаны как биологические лекарственные вещества и разрешены FDA для лечения ревматоидного артрита и хронического бляшечного псориаза [25, 26].

Предыдущими исследованиями было показано, что димеры двух молекул ЕРО, соединенные либо химической сшивкой, либо полипептидом, обладают повышенной активностью in vivo и продленным временем полужизни [17, 19]. Повышенная активность может быть следствием более эффективного связывания димера ЕРО с одним рецептором, а продленное время полужизни in vivo может быть связано с большим размером белка-димера. Однако процесс химической сшивки мало эффективен и его трудно контролировать. Кроме того, пептидный мостик в димере ЕРО может изменять трехмерную структуру молекулы ЕРО, а сам пептид может стимулировать иммуногенные реакции in vivo. Эти недостатки снижают терапевтический потенциал димеров ЕРО, особенно для пациентов с расстройством почек, у которых заместительная терапия ЕРО длится всю жизнь.

Поэтому возникла потребность в аналогах ЕРО, имеющих продленное время полужизни и повышенную эритропоэтическую активность in vivo, но не обладающих усиленными иммуногенными свойствами.

Сущность изобретения

В соответствии с изобретением описан рекомбинантный слитый белок, содержащий эритропоэтиновую пептидную часть из пептида человеческого эритропоэтина, присоединенную к иммуноглобулиновой пептидной части. Слитый белок имеет продленное время полужизни in vivo по сравнению с природным или рекомбинантным нативным человеческим эритопоэтином. В одном из вариантов осуществления изобретения белок имеет время полужизни in vivo, по меньшей мере в 3 раза превышающее время полужизни нативного человеческого эритропоэтина. Слитый белок может также обладать повышенной эритропоэтической биологической активностью по сравнению с нативным человеческим эритропоэтином.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноглобулиновая пептидная часть является фрагментом Fc, таким как фрагмент lgG1. Фрагмент Fc включает домены СН2 и СН3 и шарнирную область. ЕРО пептидная часть может быть непосредственно присоединена к шарнирной области. Предпочтительно шарнирная область имеет длину по меньшей мере 9 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения ЕРО пептидная часть имеет остаток цистеина, ближайший к его С-концу, а шарнирная область включает остаток цистеина, расположенный ближе всего к ЕРО пептидной части. Предпочтительно эти два остатка цистеина разделены между собой по меньшей мере 12 аминокислотами. В одном из вариантов осуществления изобретения ЕРО пептидная часть может представлять собой полную молекулу ЕРО, непосредственно присоединенную к иммуноглобулиновой части (то есть между ЕРО и иммуноглобулиновой частями нет никаких чужеродных пептидных мостиков).

Изобретение относится также к мультимерным белковым конструкциям, содержащим несколько единиц слитого белка согласно настоящему изобретению.

Например, два слитых белка могут быть смонтированы в виде димера, причем шарнирные области белков соединены дисульфидными связями. Димер имеет общую форму молекулы IgG и более стабилен, чем свободные молекулы ЕРО.

Изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, кодирующей слитый белок, к соответствующей аминокислотной последовательности и к линиям трансфицированных клеток и способам получения слитого белка. Далее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие слитый белок, и способы использования слитого белка и/или фармацевтических композиций, например, для стимулирования эритропоэза у нуждающихся в лечении индивидуумов.

Краткое описание фигур

Подразумевается, что фигуры, иллюстрирующие различные варианты осуществления изобретения, не должны рассматриваться в ограничивающем смысле.

Фиг.1А - схематическая диаграмма, показывающая общую структуру рекомбинантного человеческого слитого белка EPO-Fc (rHuEPO-Fc) согласно настоящему изобретению.

Фиг.1Б - список последовательностей, показывающий нуклеотидную последовательность и выведенную из нее аминокислотную последовательность белка rHuEPO-Fc. Полная длина ДНК равна 1281 п.н. В выведенной белковой последовательности 426 аминокислот (ак) включают 27 ак для сигнального пептида и 399 ак для полного белка rHuEPO-Fc. Полный белок rHuEPO-Fc состоит из домена человеческого ЕРО (166 ак), шарнирной области (16 ак, подчеркнуты) и доменов СН2 и СН3 (217 ак) фрагмента Fc человеческого lgG1. Рассчитанный молекулярный вес полипептида зрелого слитого белка rHuEPO-Fc равен 44,6 кДа, часть которого 18,5 кДа (41,4%) относится к фрагменту ЕРО, а 26,1 кДа (58,6%) - это фрагмент Fc lgG1. Гомодимер образован с помощью двух дисульфидных связей с участием двух остатков цистеина (заключены в рамку) в шарнирной области. В положении 172 зрелого слитого белка (то есть в 6-й аминокислоте шарнирной области) нативный остаток цистеина был замещен глицином (выделен жирным шрифтом).

Фиг.2 - схематическая диаграмма, показывающая структуру и особенности экспрессирующей плазмиды млекопитающих pCD1, использованной для введения последовательности ДНК, кодирующей полипептид слитого белка rHuEPO-Fc, и для трансфекции клеток СНО, экспрессирующих слитый белок rHuEPO-Fc.

Фиг.3 - изображение зон после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), показывающее установленные анализом в SDS-PAGE размеры димерной формы чистого белка rHuEPO-Fc в условиях отсутствия восстановления и мономерной формы чистого белка rHuEPO-Fc при восстановлении. Очищенный белок rHuEPO-Fc из надосадочных жидкостей культивированной линии клеток СНО, экспрессирующих rHuEPO-FC, существует в основном в виде димерной формы и имеет молекулярный вес приблизительно 180 кДа в 8% геле в буфере бис-трис без восстановления. При восстановлении (100 мМ дитиотреитол, DTT), разрушающем дисульфидные связи, димер распадается на 2 идентичные мономерные единицы с молекулярным весом 75 кДа.

Фигуры 4А и 4Б - графики, показывающие зависящее от дозы повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у нормальных мышей, получавших 3 раза в неделю подкожную (п/к) инъекцию rHuEPO-Fc или rHuEPO. Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе (6 мышей). Уровни в день 0 представляют уровни Hb перед воздействием. А: мыши получали rHuEPO-Fc. Б: мыши получали нативный rHuEPO.

Фигуры 5А и 5Б - графики, показывающие зависящее от дозы повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у нормальных мышей, получавших 1 раз в неделю п/к rHuEPO-Fc или rHuEPO. Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе (6 мышей). Уровни в день 0 представляют уровни Hb перед воздействием. А: мыши получали rHuEPO-Fc. Б: мыши получали нативный rHuEPO.

Фигуры 6А и 6Б - графики, показывающие повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у нормальных мышей, получавших внутривенную (в/в) инъекцию 12,5 мкг/кг rHuEPO-Fc или rHuEPO. Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе (6 мышей). Уровни в день 0 представляют уровни Hb перед воздействием. А: мыши получали инъекцию 1 раз в неделю. Б: мыши получали инъекцию 3 раза в неделю.

Фиг.7 - график, показывающий зависящее от дозы повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у крыс с нефроэктомией 5/6, получавших п/к 1 раз в неделю rHuEPO-Fc, rHuEPO или дарбопоэтин-α (обозначение Darbe). Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе. Нормальный контроль представлен нормальными крысами с инъекцией раствора носителя. Модельный контроль - это крысы с нефроэктомией 5/6, получавшие инъекции раствора носителя. Уровни в неделю 0 представляют уровни Hb до начала воздействия. Звездочкой * отмечены недели после воздействия.

Фиг.8 - график, показывающий зависящее от дозы повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у крыс с нефроэктомией 5/6, получавших п/к 1 раз в 2 недели rHuEPO-Fc, rHuEPO или дарбопоэтин-α (обозначение Darbe). Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе. Нормальный контроль представлен нормальными крысами с инъекцией раствора носителя. Модельный контроль - это крысы с нефроэктомией 5/6, получавшие инъекции раствора носителя. Уровни в неделю 0 представляют уровни Hb до начала воздействия. Звездочкой * отмечены недели после воздействия.

Фиг.9 - график, показывающий зависящее от дозы повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у крыс с нефроэктомией 5/6, получавших в/в 1 раз в 2 недели 62,5 мкг/кг rHuEPO-Fc, rHuEPO или дарбопоэтина-α (обозначение Darbe). Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе. Нормальный контроль представлен нормальными крысами с инъекцией раствора носителя. Модельный контроль - это крысы с нефроэктомией 5/6, получавшие инъекции раствора носителя. Уровни в неделю 0 представляют уровни Hb до начала воздействия. Звездочкой * отмечены недели после воздействия.

Фигуры с 10А по 10Б показывают сравнение активности rHuEPO-Fc, rHuEPO и дарбопоэтина-α в стимуляции образования колоний CFU-E и BFU-E у крыс с нефроэктомией 5/6, которым вводили разные дозы препаратов в разных режимах. Введение rHuEPO-Fc и дарбопоэтина-α (обозначение Darbe) выявило их одинаковую зависящую от дозы активность в образования колоний CFU-E и BFU-E, а rHuEPO был менее активен. А: п/к введение 1 раз в неделю. Б: п/к введение 1 раз в 2 недели. В: в/в введение 1 раз в 2 недели.

Фиг.11 - график, показывающий уровни содержания в сыворотке rHuEPO-Fc и rHuEPO после внутривенной инъекции обезьянам резус 5 мкг/кг rHuEPO-Fc или rHuEPO (средние уровни у 5 обезьян).

Фиг.12 - список последовательностей, показывающий нуклеотидную последовательность и выведенную аминокислотную последовательность белка rHuEPO-FcC дикого типа. Детали последовательностей такие же, как показаны на фиг.1, за исключением того, что в положении 172 зрелого слитого белка (т.е. в положении аминокислоты 6 шарнирной области) указан остаток цистеина, соответствующий нативному белку дикого типа.

Фиг.13 - график, показывающий зависящее от дозы повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у нормальных мышей, получавших 3 раза в неделю п/к инъекцию rHuEPO-Fc (мутантный слитый белок согласно настоящему изобретению), rHuEPO- FcC (слитый белок дикого типа) и rHuEPO. Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе (8 мышей). Нормальный контроль представлен нормальными мышами, которым вводили раствор носителя. День 0 представляет уровни Hb до воздействия.

Фиг.14 - график, показывающий зависящее от дозы повышение уровней содержания гемоглобина (Hb) у нормальных мышей, получавших 1 раз в неделю п/к инъекцию rHuEPO-Fc, rHuEPO-FcC и rHuEPO. Каждая точка представляет средний уровень Hb в группе (8 мышей). Нормальный контроль представлен нормальными мышами, которым вводили раствор носителя. День 0 представляет уровни Hb до воздействия.

Детальное описание изобретения

На протяжении последующего описания для лучшего понимания изобретения приводятся конкретные детали. Однако изобретение может быть осуществлено без этих деталей. В других случаях хорошо известные элементы не были показаны или подробно описаны, чтобы избежать нагромождения деталей, которое помешает понять настоящее изобретение. Поэтому описание и фигуры следует рассматривать в иллюстративном, а не в ограничивающем смысле.

Эта заявка относится к новому слитому белку, имеющему эритропоэтические свойства. Слитый белок, обозначенный здесь как rHuEPO-Fc, содержит молекулу человеческого эритропоэтина (ЕРО) с помощью рекомбинантной технологии соединенную с фрагментом Fc иммуноглобулина. Как обсуждается далее, слитый белок может быть в форме димера, состоящего из двух идентичных полипептидных субъединиц. В варианте осуществления изобретения, схематически представленном на фиг.1А, каждая полипептидная субъединица от N-конца к С-концу состоит из полипептидной последовательности молекулы человеческого ЕРО и полипептидной последовательности шарнирной области, домена СН2 и домена СН3 фрагмента Fc человеческого иммуноглобулина lgG1. Две полипептидные субъединицы для образования димерной структуры соединены друг с другом дисульфидными связями между соответственными шарнирными областями. Поэтому димер имеет такую же общую форму, как и молекула IgG, и обладает лучшей стабильностью, чем свободные молекулы ЕРО, что обсуждается далее в примерах.

Как будет очевидно для специалиста в данной области, шарнирная область интактного иммуноглобулина придает белку достаточную гибкость для эффективного связывания антиген-антитело. Подобным же образом в настоящем изобретении шарнирная область включена в конструирование слитого белка rHuEPO-Fc, чтобы сохранить его гибкость, особенно когда слитый белок находится в димерной форме. Как описано далее, это обеспечивает нормальное связывание части ЕРО слитого белка rHuEPO-Fc с рецепторами ЕРО для активации биологических функций ЕРО. Можно с уверенностью считать, что димерная форма слитого белка rHuEPO-FC, предоставляющая две молекулы ЕРО, способна индуцировать оптимальную активацию рецепторов ЕРО (например, способствуя сшивке рецепторов).

Как показано в приведенных далее примерах, слитый белок rHuEPO-Fc был успешно синтезирован с помощью техники рекомбинантной ДНК. В исследованиях на мышах, крысах и приматах было установлено, что слитый белок имеет продленное время полужизни in vivo и повышенную эритропоэтическую активность по сравнению с природным или рекомбинантным нативным человеческим ЕРО. Термины «нативный человеческий эритропоэтин» и «нативный человеческий ЕРО», как они использованы в данной патентной заявке, обозначают ЕРО, имеющий немодифицированную структуру дикого типа. Как понятно специалисту в данной области, нативный человеческий ЕРО может быть природным или полученным по рекомбинантной технологии (например rHuEPOα). Термин «нативный человеческий ЕРО» не включает аналоги rHuEPO, такие как дарбепоэтин-α, где структура ЕРО была существенно модифицирована, как например путем гипергликозилирования.

Последовательность нуклеиновой кислоты для слитого белка rHuEPO-Fc согласно настоящему изобретению представлена как SEQ ID No. 1. Соответствующая выведенная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID No. 2. Длина полного слитого белка rHuEPO-Fc составляет 399 аминокислот. Как показано на фиг.1Б, полный слитый белок rHuEPO-Fc состоит из домена ЕРО (166 аминокислот), шарнирной области (16 аминокислот, подчеркнуты) и доменов СН2 и СН3 (217 аминокислот). Сигнальная и лидерная пептидная последовательность, состоящая из 27 аминокислот, также показана на фиг.1Б. Сигнальный пептид отщепляется в ходе синтеза rHuEPO-Fc. Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность rHuEPO-Fc, включая сигнальный или лидерный пептид, показана соответственно в SEQ ID No. 3 и SEQ ID No. 4.

Как видно лучше всего на фиг.1Б и в последовательности SEQ ID No. 2, домен ЕРО содержит остаток цистеина вблизи его С-конца в положении 161 аминокислотной последовательности. Шарнирная область включает 2 остатка цистеина в положениях 178 и 181 аминокислотной последовательности, которые на фиг.1Б заключены в рамку. Остатки цистеина шарнирной области образуют дисульфидные связи между полипептидными субъединицами гомодимера, как обсуждалось выше. Природная шарнирная область фрагмента человеческого lgG1 также имеет остаток цистеина в положении 6 части шарнирной области (отсчитанном от N-конца). В настоящем изобретении остаток цистеина 6 в шарнирной области был заменен нецистеиновым остатком. В частности, в варианте осуществления изобретения, представленном на фиг.1Б и в последовательности SEQ ID No. 2, аминокислота цистеин была заменена глицином (в положении 172 аминокислотной последовательности rHuEPO-Fc, которое соответствует остатку 6 шарнирной области). Как будет очевидно для специалиста в данной области, цистеин в этом положении может быть также замещен другими нецистеиновыми остатками, чтобы предотвратить образование дисульфидной связи.

В результате аминокислотной замены в положении 172 первый остаток цистеина шарнирной области (в положении 178) отделен 17 аминокислотами от описанного выше остатка цистеина домена ЕРО (в положении 161). Заявители уверены, что минимальное расстояние между остатком цистеина 161 домена ЕРО и первым остатком цистеина шарнирной области должно составлять по меньшей мере 12 аминокислот, чтобы обеспечить успешную сборку и/или связывание с рецептором ЕРО гомодимера rHuEPO-Fc. To есть, если остаток в положении 172 - это остаток цистеина, то возможно образование нежелательной дисульфидной связи, такой как между остатками цистеина 161 и 172. Это может изменить трехмерную структуру молекулы ЕРО, что приведет к исчезновению или снижению биологической активности.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен ЕРО присоединен непосредственно к части, соответствующей фрагменту Fc слитого белка. Исключение чужеродного пептида-мостика сохраняет предпочтительную трехмерную структуру слитого пептида rHuEPO-Fc и сводит к минимуму запуск нежелательной иммуногенной реакции. Шарнирная область фрагмента Fc предпочтительно имеет длину по меньшей мере 9 аминокислот и предпочтительно его длина составляет приблизительно 10-20 аминокислот.

Следующие примеры будут дополнительно иллюстрировать изобретение более детально, хотя следует признать, что изобретение не ограничено конкретными примерами.

Примеры

Пример 1. Конструирование рекомбинантой плазмиды pCdEpo-Fc. кодирующей слитый белок HuEPO-Fc

Молекулу ДНК полной длины, которая кодирует аминокислотную последовательность полипептида rHuEPO-Fc, создавали путем перекрывающей полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров (QIAGEN Inc., US):

Последовательности указанных выше праймеров представлены соответственно в последовательностях с SEQ ID No. 5 по SEQ ID No. 8.

Сайты рестрикции EcoR I и Not I ввели соответственно в EF5 и EF3.

Для оптимальной экспрессии белка HuEPO-Fc в клетках млекопитающих в EF5 ввели также последовательность Kozak (GCCACCATGG). EFL5 и EFL3 - это комплементарные последовательности, состоящие из 3'-концевой последовательности ДНК ЕРО (22 п.н.) и 5'-концевой последовательности ДНК для шарнира lgG1 (22 п.н.).

Сначала фрагмент ДНК ЕРО размером 0,6 тыс.нуклеотидов амплифицировали в ПЦР (Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity) с праймерами EF5 и EFL3 из плазмиды р9Е, содержащей кДНК полной длины для человеческого ЕРО, а фрагмент Fc размером 0,7 тыс.нуклеотидов амплифицировали с праймерами EF3 и EFL5 с плазмиды pD, содержащей последовательность кДНК полной длины для человеческого lgG1 (р9Е и pD были получены в лаборатории заявителей). Затем оба фрагмента очищали и смешивали в равных количествах. Используя смесь в качестве матрицы, ДНК rHuEPO-Fc полной длины размером 1,3 тыс.нуклеотидов амплифицировали с праймерами EF5 и EF3. Очищенный фрагмент длиной 1,3 тыс.нуклеотидов расщепляли рестриктазами EcoR I и Not I (New England Biolab Inc. US) и затем клонировали в расщепленный EcoR I/Not I экспрессирующий вектор млекопитающих pCDI (фиг.2). Полученный рекомбинантный вектор был назван pCdEpo-Fc, введенная в него последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотную последовательность HuEPO-Fc, была подтверждена секвенированием ДНК.

Пример 2. Получение линии клеток, экспрессирующей rHuEPO-Fc

В качестве клеток-хозяев для экспрессии rHuEPO-Fc использовали клетки яичников китайского хомячка, дефектные по дигидрофолат-редуктазе (dhfr) (CHO/dhfr^-, ATCC No. CRL-9096), которые разрешены FDA для продукции биологических веществ.

Клетки CHO/dhfr^- трансфицировали рекомбинантным вектором pCdEpo-Fc с использованием липофектамина (Gibco, Cat. No: 18292-037, USA). Надосадочные жидкости из культур отобранных клонов анализировали методом ELISA (Roche, Cat. No: 1-693417, Canada) для определения активности ЕРО. Далее позитивные клоны подвергали скринингу при повышающейся нагрузке метотрексата (МТХ). Одна линия клеток с наиболее высокой экспрессией белка rHuEPO-Fc была отобрана как экспрессирующая rHuEPO-Fc линия клеток СНО и постепенно адаптирована к среде без сыворотки (CD СНО Medium, Gibco, Cat. No: 10743-029, USA). Эта экспрессирующая rHuEPO-Fc линия клеток СНО была использована для продукции белка rHuEPO-Fc.

Пример 3. Очистка белка rHuEPO-Fc

Молекулы белка rHuEPO-Fc, содержащиеся в надосадочных жидкостях, собранных после культивирования экспрессирующих rHuEPO-Fc клеток СНО в среде без сыворотки, были выделены вначале с помощью аффинной хроматографии на белке A (Amersham, Cat. No: 17-0402- 01, Canada). Выделенные белки были дополнительно очищены гель-хроматографией на колонке HiLoad 16/60 Superdex 200pg (Amersham, Cat. No: 17-1069-01, Canada). Чистота белка rHuEPO-Fc была более 98% на основании электрофореза.

Пример 4. Определение размера чистого белка rHuEPO-Fc

Сначала для определения размера чистого белка rHuEPO-Fc был проведен SDS-PAGE. Как показано на фиг.3, при электрофорезе в 8% геле с бис-трис буфером без восстановления, который позволяет измерить общий размер белка с дисульфидными связями, получена одна зона с молекулярным весом около 180 кДа. Это указывает на то, что основная часть молекул белка rHuEPO-Fc продуцируется в димерной форме, как и ожидалось на основании конструирования слитого белка. Если анализ SDS-PAGE проводили в восстанавливающих условиях (100 мМ DTT) для разрушения дисульфидных связей, была идентифицирована только одна линия с молекулярным весом 75 кДа, что согласуется с оценкой молекулярного веса для одиночной полипептидной цепи состава HuEPO-шарнирная область-СН2-СН3.

Точный молекулярный вес чистого слитого белка rHuEPO-Fc с гликозилированием, определенный масс-спектрометрией (MALDI-TOF-MS), составил 111099 Да (111,1 кДа). В этом анализе наблюдался только один пик белка, что указывает на близкую к 100% чистоту белка rHuEPO-Fc. Анализ последовательности белка позволил определить 15 аминокислот N-конца чистого белка rHuEPO-Fc как APPRLICDSRVLERY. Это согласуется с последовательностью первых 15 аминокислот полипептида нативного человеческого ЕРО и подтверждает, что очищенный белок rHuEPO-Fc действительно имеет правильную и полную последовательность молекулы ЕРО, как предсказано по последовательности ДНК, кодирующей аминокислотные последовательности слитого белка rHuEPO-Fc.

Пример 5. Повышенная эритропоэтическая активность rHuEPO-Fc у нормальных мышей

Для подтверждения сохранения эритропоэтической активности белка rHuEPO-Fc и определения его активности в сравнении с rHuEPO и дарбепоэтином-α были проведены опыты in vivo на мышах. В целях сравнения все дозы трех использованных в описанных опытах на животных ЕРО: rHuEPO-Fc согласно настоящему изобретению, rHuEPO (нативный человеческий ЕРО) и дарбепоэтина-α были выражены количествами части только молекулы ЕРО на основании размера молекулы. Для белка rHuEPO-Fc часть ЕРО составляет 41,4% от полного молекулярного веса rHuEPO-Fc, что вычислено на основании веса аминокислот ЕРО и веса всех аминокислот в целой молекуле rHuEPO-Fc (160 ак из общего числа 399 ак). Поэтому количество ЕРО в rHuEPO-Fc было сочтено равным 41,4% от общего количества белка rHuEPO-Fc.

rHuEPO-Fc (концентрация рабочего раствора 0,5 мг/мл, чистота 98,6%) и нативный человеческий rHuEPO (т.е. со структурой природного человеческого ЕРО) (6000 ед./0,5 мл, продукция фирмы Kirin Brewery Co., Japan) разбавляли в растворе носителя (2,5 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, 5,8 мг/мл цитрата натрия, 0,06 мг/мл лимонной кислоты и 5,8 мг/мл хлорида натрия, рН 5,5-5,6). Количественную дозу rHuEPO рассчитывали согласно известному для него соотношению активность/количество. Мыши BALB/c (возраст 6-8 недель, вес 18-22 г, равное количество самцов и самок, получены из Experiment Animal Center, AMMS, China) были случайным образом распределены в группы по 6 мышей в каждой группе. Каждая из групп мышей получала одну комбинацию из одной дозы (0,1, 0,5, 2,5, 12,5, 62,5 мкг/кг), одного пути введения (в/в в хвостовую вену или п/к) и одного режима инъекций (3 раза в неделю или 1 раз в неделю). Контрольной группе мышей вводили равный объем раствора носителя. Воздействие длилось в течение 3 недель, а общее время наблюдения составляло 5 недель. Образцы периферической крови (из хвостовой вены) для измерений отбирали перед началом воздействия, на 4-й и на 7-й день каждой недели в течение 5 недель. Количество Hb измеряли показателем абсорбциометрии. Средние стандартные отклонения рассчитывали для данных каждой группы, для сравнения различных групп использовали r-тест.

Введение ЕРО мышам 3 раза в неделю, при условии, что эти ЕРО имеют нормальную эритропоэтическую активность, будет с насыщением индуцировать стимуляцию эритропоэза. Как показано на фиг.4, в обеих группах, подвергавшихся воздействию 3 раза в неделю, наблюдалось существенное повышение уровней даже при дозе 2,5 мкг/кг. Этот опыт показал, что эритропоэтическая активность rHuEPO-Fc in vivo столь же высока, как и у rHuEPO. Повышение уровней Hb в подвергшихся воздействию группах зависело от дозы. Однако насыщение в повышении уровней Hb достигалось у мышей при дозе rHuEPO-Fc 12,5 мкг/кг, тогда как такое же насыщенное повышение уровней Hb при введении rHuEPO достигалось лишь при дозе 62,5 мкг/кг. Индуцируемое rHuEPO-Fc при дозе 2,5 мкг/кг повышение уровней Hb было также выше, чем повышение при индукции rHuEPO при дозе 2,5 мкг/кг. Эти результаты позволяют предположить более сильную стимуляцию эритропоэза при действии rHuEPO-Fc, чем при действии rHuEPO.

Эритропоэтический потенциал rHuEPO-Fc был далее использован для снижения числа п/к инъекций до 1 в неделю. Как показано на фиг.5, в получавших rHuEPO-Fc группах наблюдалось зависящее от дозы повышение уровней Hb при дозах 12,5 или 62,5 мкг/кг. Обе дозы (12,5 и 62,5 мкг/кг) rHuEPO также индуцировали повышение уровней Hb до близкого значения, которое было намного ниже, чем уровни, индуцируемые 62,5 мкг/кг rHuEPO-Fc. Это несомненно указывает на то, что rHuEPO-Fc имеет повышенную эритропоэтическую активность in vivo. Возможно, это является следствием либо продленного времени полужизни rHuEPO-Fc in vivo, либо усиления связывания/активации рецепторов ЕРО димерами молекул ЕРО в белке rHuEPO-Fc, либо объединенными эффектами обоих факторов.

Если такие же дозы (12,5 мкг/кг) rHuEPO-Fc или rHuEPO вводили внутривенно или 3 раза в неделю, или 1 раз в неделю, во всех подвергнутых воздействию группах наблюдалось повышение уровней Hb (фиг.6). Однако в/в введение rHuEPO-Fc 1 раз в неделю индуцировало более значительное и более стойкое повышение уровней Hb, которое длилось дольше после окончания воздействия. Эти данные дополнительно поддерживают мнение о более высокой эритропоэтической активности белка rHuEPO-Fc по сравнению с rHuEPO, имеющим структуру природного белка ЕРО.

Пример 6. Повышенная эритропоэтическая активность rHuEPO-Fc у 5/6 крыс с нефрэктомией

Опыты на нормальных мышах подтвердили повышенную эритропоэтическую активность rHuEPO-Fc in vivo. Чтобы дополнительно проверить эффективность rHuEPO-Fc в стимуляции эритропоэза, были проведены исследования фармакодинамики у крыс с экспериментальной почечной анемией, полученной путем 5/6 нефрэктомии. Эффективность rHuEPO-Fc сравнивали с эффективностью rHuEPO и дарбепоэтина-α (60 мкг/мл, партия №N079, производство фирмы Kirin Brewery Co., Japan).

В данном изобретении для получения модели анемии вследствие нарушения функции почек путем двухэтапной нефрэктомии [27] использовали крыс Wistar (равное число самцов и самок, вес 160-180 г, получены от Vitalriver Experiment Animal Inc., Beijing, China. Licence No. SCXKI 1-00-0008). У крыс под общим наркозом проводили нефрэктомию 5/6 в двух отдельных операциях в стерильных условиях. После резекции 2/3 левой почки крыс оставляли для восстановления в течение 20 дней. Затем аккуратно удаляли правую почку. Для предотвращения инфекции после каждой операции вводили антибиотики. В конечном итоге были удалены 5/6 почечной ткани. У крыс после нефрэктомии постепенно развивались недостаточность функции почек и анемия. Стабильное состояние анемии у крыс достигалось через 50 дней после нефрэктомии, после чего их распределяли случайным образом по группам (9 крыс в группе) для введения препаратов ЕРО. Каждая группа крыс получала одну комбинацию одной дозы (2,5, 12,5, 62,5 мкг/кг), одного пути введения (в/в через хвостовую вену или п/к) и одного режима инъекций (1 раз в неделю или 1 раз в 2 недели). Контрольной группе и модельной группе крыс вводили равный объем раствора носителя. Воздействие продолжали в течение 4 недель, а общее время наблюдения составляло 6 недель.

Все дозы (2,5, 12,5, 62,5 мкг/кг) rHuEPO-Fc, вводимого подкожно 1 раз в неделю, индуцировали зависящее от д