Применение и получение стабильной при хранении нейтральной металлопротеиназы

Применение и получение стабильной при хранении нейтральной металлопротеиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет находящейся на рассмотрении предварительной патентной заявки США серийный No. 60/726448, поданной 12 октября 2005 г.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, включающим в себя по меньшей мере один фермент - нейтральную металлопротеиназу, обладающий улучшенной стабильностью при хранении. В некоторых вариантах осуществления нейтральную металлопротеиназу используют для очистки и других применений. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам и композициям, содержащим нейтральную металлопротеиназу (металлопротеиназы), полученную из Bacillus sp. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа получена из B. amyloliquefaciens. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа представляет собой вариант нейтральной металлопротеиназы B. amyloliquefaciens. В дополнительных вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа представляет собой гомолог нейтральной металлопротеиназы B. amyloliquefaciens. Настоящее изобретение находит особенный спрос в применениях, включающих в себя в качестве неограничивающих примеров очистку, отбеливание и дезинфекцию.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Моющие средства и другие очищающие композиции, как правило, включают в себя сложное сочетание активных ингредиентов. Например, большинство очищающих продуктов содержат систему поверхностно-активного вещества, ферменты для очистки, отбеливающие средства, добавки для повышения моющего действия, средства для подавления пенообразования, суспендирующие грязь вещества, грязеотталкивающие средства, оптические отбеливатели, смягчающие средства, диспергирующие вещества, ингибирующие перенос красителя соединения, абразивные вещества, антибактериальные средства и отдушки. Несмотря на комплексность современных существующих в настоящее время моющих средств, существует много загрязнений, которые трудно полностью удалить. Более того, часто присутствует остаточное накопление, приводящее к изменению цвета (например, пожелтению) и снижению эстетики из-за неполного очищения. Эти проблемы усугубляются увеличением использования холодных (например, холодная вода) температур стирки и укороченных циклов стирки. Более того, многие загрязнения состоят из сложных смесей волокнистого материала, в основном содержащего углеводы и производные углеводов, волокна, и компоненты клеточной стенки (например, растительный материал, дерево, землю на основе ила/глины и фрукты). Эти загрязнения представляют сложные задачи для составления и использования очищающих композиций.

Кроме того, окрашенная одежда проявляет тенденцию изнашиваться и проявлять потерю внешнего вида. Часть этой потери окраски происходит из-за способа стирки, в частности, в автоматических стиральных и сушильных машинах. Более того, потеря прочности ткани на разрыв, по-видимому, является неизбежным результатом механического и химического воздействия из-за использования, ношения и/или стирки и сушки. Таким образом, необходимы способы эффективной и действенной стирки окрашенной одежды, так чтобы минимизировать эти потери внешнего вида.

В целом, несмотря на улучшения в мощности очищающих композиций, в данной области остается необходимость в моющих средствах, которые удаляют загрязнения, поддерживают цвет ткани и внешний вид и предотвращают перенос красителя. Кроме того, остается необходимость в композициях моющих средств и/или композициях для ухода за тканью, предоставляющих и/или сохраняющих прочность на разрыв, также как предоставляющих ткани свойства против складок, против скатывания и/или против усадки, также как предоставляющих статический контроль, мягкость ткани, поддерживающих желательный внешний вид окраски, и свойства и преимущества ткани против изнашивания. В частности, остается необходимость включения композиций, способных удалять окрашенные компоненты загрязнений, которые часто остаются прикрепленными к стираемым тканям. Кроме того, остается необходимость улучшенных способов и композиций, подходящих для отбеливания ткани.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, содержащим по меньшей мере один фермент - нейтральную металлопротеиназу, обладающий улучшенной стабильностью при хранении. В некоторых вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа находит применение для очистки и других применений. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам и композициям, включающим в себя нейтральную металлопротеиназу (металлопротеиназы), полученную из Bacillus sp. В некоторых более предпочтительных вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа получена из B. amyloliquefaciens. В еще более предпочтительных вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа представляет собой вариант нейтральной металлопротеиназы из B. amyloliquefaciens. В дополнительных вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа представляет собой гомолог нейтральной металлопротеиназы B. amyloliquefaciens. Настоящее изобретение находит практическое использование в применениях, включающих в себя в качестве неограничивающих примеров очистку, отбеливание и дезинфекцию.

Настоящее изобретение относится к новым нейтральным металлопротеиназам, новому генетическому материалу, кодирующему ферменты нейтральные металлопротеиназы, и белкам нейтральным металлопротеиназам, полученным из Bacillus sp., в частности, B. amyloliquefaciens, и вариантам белков, полученным из них. В частности, настоящее изобретение относится к композициям нейтральной металлопротеиназы, полученной из Bacillus sp., в частности, B. amyloliquefaciens, к ДНК, кодирующей протеиназу, к векторам, содержащим ДНК, кодирующую нейтральную металлопротеиназу, к клеткам-хозяевам, трансформированным векторной ДНК, и к ферменту, продуцируемому клетками-хозяевами. Настоящее изобретение также относится к очищающим композициям (например, композициям моющих средств), к композициям для кормления животных и к композициям для обработки ткани и кожи, содержащим нейтральную металлопротеиназу (металлопротеиназы), полученную из видов Bacillus, в частности, B. amyloliquefaciens. В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мутантным (т.е. измененным) нейтральным металлопротеиназам, полученным из нейтральных металлопротеиназ дикого типа, описанных здесь. Эти мутантные нейтральные металлопротеиназы также находят использование для многих применений.

Настоящее изобретение относится к выделенным нейтральным металлопротеиназам, полученным из видов Bacillus, в частности, B. amyloliquefaciens. В дополнительных вариантах осуществления нейтральная металлопротеиназа содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным нейтральным металлопротеиназам, обладающим по меньшей мере 45% идентичностью аминокислот с нейтральной металлопротеиназой, содержащей SEQ ID NO:3, 4 или 18. В некоторых вариантах осуществления выделенные нейтральные металлопротеиназы обладают по меньшей мере 50% идентичностью, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 65%, даже более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно 85%, еще более предпочтительно 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно 99% идентичностью с нейтральной металлопротеиназой, содержащей SEQ ID NO:3, 4 или 18.

Настоящее изобретение также относится к выделенным нейтральным металлопротеиназам, обладающим иммунологической перекрестной реактивностью с металлопротеиназой, полученной из B. amyloliquefaciens, также как к композициям, содержащим эти нейтральные металлопротеиназы. В альтернативных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы обладают иммунологической перекрестной реактивностью с нейтральными металлопротеиназами, содержащими аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В дополнительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы обладают перекрестной реактивностью с фрагментами (т.е. частями) нейтральной металлопротеиназы B. amyloliquefaciens и/или нейтральной металлопротеиназы, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 или 18. Действительно, предполагают, что настоящее изобретение относится к фрагментам (например, эпитопам) металлопротеиназы B. amyloliquefaciens, стимулирующим иммунный ответ у животных (включая в качестве неограничивающих примеров человека), и/или узнаваемым антителами любого класса. Кроме того, настоящее изобретение относится к эпитопам металлопротеиназы, которые являются перекрестно реактивными с эпитопами металлопротеиназы B. amyloliquefaciens. В некоторых вариантах осуществления эпитопы металлопротеиназы являются узнаваемыми антителами, но не стимулируют иммунный ответ у животных (включая в качестве неограничивающих примеров человека), в то время как в других вариантах осуществления, эпитопы металлопротеиназы стимулируют иммунный ответ по меньшей мере у одного вида животных (включая в качестве неограничивающих примеров человека) и являются узнаваемыми антителами любого класса. Настоящее изобретение также относится к способам и композициям для идентификации и оценки перекрестно-реактивных эпитопов.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В альтернативных вариантах осуществления последовательность содержит замены по меньшей мере в одном положении аминокислоты в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В некоторых особенно предпочтительных альтернативных вариантах осуществления последовательность содержит замены по меньшей мере в одном положении аминокислоты в SEQ ID NO:18. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вариантам нейтральной металлопротеиназы, обладающим аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе B. amyloliquefaciens, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вариантам нейтральной металлопротеиназы, обладающим аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе B. amyloliquefaciens, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:18. В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вариантам нейтральной металлопротеиназы, обладающим аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе B. amyloliquefaciens, содержащей по меньшей мере часть SEQ ID NO:3, 4 или 18. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы содержат множественные мутации по меньшей мере в части SEQ ID NO:3, 4 или 18. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы содержат множественные мутации по меньшей мере в части SEQ ID NO:18.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:18. В альтернативных вариантах осуществления последовательность содержит замены по меньшей мере в одном положении аминокислоты в SEQ ID NO:18. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вариантам нейтральной металлопротеиназы, обладающим аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе B. amyloliquefaciens, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:18. В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вариантам нейтральной металлопротеиназы, обладающим аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе B. amyloliquefaciens, содержащей по меньшей мере часть SEQ ID NO:18. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы содержат множественные мутации по меньшей мере в части SEQ ID NO:18.

В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления эти варианты обладают улучшенной производительностью по сравнению с нейтральной металлопротеиназой B. amyloliquefaciens дикого типа. Настоящее изобретение также относится к вариантам нейтральной металлопротеиназы, обладающим по меньшей мере одним улучшенным признаком по сравнению с нейтральной металлопротеиназой дикого типа. В некоторых дополнительных особенно предпочтительных вариантах осуществления эти варианты обладают улучшенной стабильностью по сравнению с нейтральной металлопротеиназой B. amyloliquefaciens дикого типа. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления эти варианты обладают улучшенной термостабильностью по сравнению с нейтральной металлопротеиназой B. amyloliquefaciens дикого типа. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления эти варианты обладают улучшенной производительностью в условиях более низкого или более высокого pH по сравнению с нейтральной металлопротеиназой B. amyloliquefaciens дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к нейтральным металлопротеиназам, содержащим по меньшей мере часть аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие эти нейтральные металлопротеиназы, содержат нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, 2, 12 и/или 13. В некоторых вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы представляют собой варианты, обладающие аминокислотными последовательностями, сходными с последовательностями, указанными в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В дополнительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы представляют собой варианты и/или гомологи. В дополнительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы представляют собой металлопротеиназы, указанные на любой из фиг.3-5. В других вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы представляют собой варианты металлопротеиназ, указанных на фиг.3, 4 и/или 5.

Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере часть нейтральной металлопротеиназы, указанной в SEQ ID NO:3, 4 или 18. Кроме того, настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, содержащим полинуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один вариант нейтральной металлопротеиназы, обладающий аминокислотной последовательностью (последовательностями), содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе Bacillus, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 или 18. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим эти экспрессирующие векторы. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления клетки-хозяева выбраны из группы, состоящей из Bacillus sp. Настоящее изобретение также относится к нейтральным металлопротеиназам, продуцируемым клетками-хозяевами.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере часть выделенной нейтральной металлопротеиназы, полученной из Bacillus sp., в частности, B. amyloliquefaciens, где по меньшей мере часть нейтральной металлопротеиназы кодирует полинуклеотидная последовательность, выбранная из SEQ ID NO:1, 2, 12 и/или 13. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим эти экспрессирующие векторы. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой Bacillus sp. Настоящее изобретение также относится к нейтральным металлопротеиназам, продуцируемым клетками-хозяевами.

Настоящее изобретение также относится к вариантам нейтральных металлопротеиназ, где нейтральные металлопротеиназы содержат по меньшей мере одну замену, соответствующую положениям аминокислот в SEQ ID NO:3 и/или SEQ ID NO:18, и где варианты металлопротеиназ обладают улучшенной производительностью по меньшей мере для одного признака по сравнению с металлопротеиназой B. amyloliquefaciens дикого типа. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к вариантам нейтральных металлопротеиназ, где нейтральные металлопротеиназы содержат по меньшей мере одну замену, соответствующую положениям аминокислот в SEQ ID NO:18, и где варианты металлопротеиназы обладают улучшенной производительностью по меньшей мере для одного признака по сравнению с металлопротеиназой B. amyloliquefaciens дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к вариантам аминокислот, где варианты содержат по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе, содержащей аминокислоту, указанную в SEQ ID NO:18, где положение (положения) представляют собой положения 1, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 69, 70, 76, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 117, 119, 127, 128, 129, 130, 132, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 169, 173, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 190, 191, 192, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 210, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 228, 229, 237, 239, 240, 243, 244, 245, 248, 252, 253, 260, 261, 263, 264, 265, 267, 269, 270, 273, 277, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289, 290, 292, 293, 296, 297 и 299 или выбраны из них.

Настоящее изобретение также относится к выделенным вариантам нейтральной металлопротеиназы, обладающим аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления выделенные варианты нейтральной металлопротеиназы обладают заменами, выполненными в положениях, эквивалентных положениям 1, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 69, 70, 76, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 117, 119, 127, 128, 129, 130, 132, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 169, 173, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 190, 191, 192, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 210, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 228, 229, 237, 239, 240, 243, 244, 245, 248, 252, 253, 260, 261, 263, 264, 265, 267, 269, 270, 273, 277, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289, 290, 292, 293, 296, 297 и 299 нейтральной металлопротеиназы, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:18.

В дополнительных вариантах осуществления выделенный вариант нейтральной металлопротеиназы содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из T004C, T004E, T004H, T004I, T004K, T004L, T004M, T004N, T004P, T004R, T004S, T004V, T004W, T004Y, G012D, G012E, G012I, G012K, G012L, G012M, G012Q, G012R, G012T, G012V, G012W, K013A, K013C, K013D, K013E, K013F, K013G, K013H, K013I, K013L, K013M, K013N, K013Q, K013S, K013T, K013V, K013Y, T014F, T014G, T014H, T014I, T014K, T014L, T014M, T014P, T014Q, T014R, T014S, T014V, T014W, T014Y, S023A, S023D, S023F, S023G, S023I, S023K, S023L, S023M, S023N, S023P, S023Q, S023R, S023S, S023T, S023V, S023W, S023Y, G024A, G024D, G024F, G024G, G024H, G024I, G024K, G024L, G024M, G024N, G024P, G024R, G024S, G024T, G024V, G024W, G024Y, K033H, Q045C, Q045D, Q045E, Q045F, Q045H, Q045I, Q045K, Q045L, Q045M, Q045N, Q045P, Q045R, Q045T, Q045W, N046A, N046C, N046E, N046F, N046G, N046H, N046I, N046K, N046L, N046M, N046P, N046Q, N046R, N046S, N046T, N046V, N046W, N046Y, R047E, R047K, R047L, R047M, R47Q, R047S, R047T, Y049A, Y049C, Y049D, Y049E, Y049F, Y049H, Y049I, Y049K, Y049L, Y049N, Y049R, Y049S, Y049T, Y049V, Y049W, N050D, N050F, N050G, N050H, N050I, N050K, N050L, N050M, N050P, N050Q, N050R, N050W, N050Y, T054C, T054D, T054E, T054F, T054G, T054H, T054I, T054K, T054L, T054M, T054N, T054P, T054Q, T054R, T054S, T054V, T054W, T054Y, S058D, S058H, S058I, S058L, S058N, S058P, S058Q, T059A, T059C, T059E, T059G, T059H, T059I, T059K, T059L, T059M, T059N, T059P, T059Q, T059R, T059S, T059V, T059W, T060D, T060F, T060I, T060K, T060L, T060N, T060Q, T060R, T060V, T060W, T060Y, T065C, T065E, T065F, T065H, T065I, T065K, T065L, T065M, T065P, T065Q, T065R, T065V, T065Y, S066C, S066D, S066E, S066F, S066H, S066I, S066K, S066L, S066N, S066P, S066Q, S066R, S066T, S066V, S066W, S066Y, Q087A, Q087D, Q087E, Q087H, Q087I, Q087K, Q087L, Q087M, Q087N, Q087R, Q087S, Q087T, Q087V, Q087W, N090C, N090D, N090E, N090F, N090G, N090H, N090K, N090L, N090R, N090T, N096G, N096H, N096K, N096R, K097H, K097Q, K097W, K100A, K100D, K100E, K100F, K100H, K100N, K100P, K100Q, K100R, K100S, K100V, K100Y, R110A, R110C, R110E, R110H, R110K, R110L, R110M, R110N, R110Q, R110S, R110Y, D119E, D119H, D119I, D119L, D119Q, D119R, D119S, D119T, D119V, D119W, G128C, G128F, G128H, G128K, G128L, G128M, G128N, G128Q, G128R, G128W, G128Y, S129A, S129C, S129D, S129F, S129G, S129H, S129I, S129K, S129L, S129M, S129Q, S129R, S129T, S129V, S129W, S129Y, F130I, F130K, F130L, F130M, F130Q, F130R, F130T, F130V, F130Y, S135P, G136I, G136L, G136P, G136V, G136W, G136Y, S137A, M138I, M138K, M138L, M138Q, M138V, D139A, D139C, D139E, D139G, D139H, D139I, D139K, D139L, D139M, D139P, D139R, D139S, D139V, D139W, D139Y, V140C, Q151I, E152A, E152C, E152D, E152F, E152G, E152H, E152L, E152M, E152N, E152R, E152S, E152W, N155D, N155K, N155Q, N155R, D178A, D178C, D178G, D178H, D178K, D178L, D178M, D178N, D178P, D178Q, D178R, D178S, D178T, D178V, D178W, D178Y, T179A, T179F, T179H, T179I, T179K, T179L, T179M, T179N, T179P, T179Q, T179R, T179S, T179V, T179W, T179Y, E186A, E186C, E186D, E186G, E186H, E186K, E186L, E186M, E186N, E186P, E186Q, E186R, E186S, E186T, E186V, E186W, E186Y, V190H, V190I, V190K, V190L, V190Q, V190R, S191F, S191G, S191H, S191I, S191K, S191L, S191N, S191Q, S191R, S191W, L198M, L198V, S199C, S199D, S199E, S199F, S199I, S199K, S199L, S199N, S199Q, S199R, S199V, Y204H, Y204T, G205F, G205H, G205L, G205M, G205N, G205R, G205S, G205Y, K211A, K211C, K211D, K211G, K211M, K211N, K211Q, K211R, K211S, K211T, K211V, K214A, K214C, K214E, K214I, K214L, K214M, K214N, K214Q, K214R, K214S, K214V, L216A, L216C, L216F, L216H, L216Q, L216R, L216S, L216Y, N218K, N218P, T219D, D220A, D220E, D220H, D220K, D220N, D220P, A221D, A221E, A221F, A221I, A221K, A221L, A221M, A221N, A221S, A221V, A221Y, G222C, G222H, G222N, G222R, Y224F, Y224H, Y224N, Y224R, T243C, T243G, T243H, T243I, T243K, T243L, T243Q, T243R, T243W, T243Y, K244A, K244C, K244D, K244E, K244F, K244G, K244L, K244M, K244N, K244Q, K244S, K244T, K244V, K244W, K244Y, V260A, V260D, V260E, V260G, V260H, V260I, V260K, V260L, V260M, V260P, V260Q, V260R, V260S, V260T, V260W, V260Y, Y261C, Y261F, Y261I, Y261L, T263E, T263F, T263H, T263I, T263L, T263M, T263Q, T263V, T263W, T263Y, S265A, S265C, S265D, S265E, S265K, S265N, S265P, S265Q, S265R, S265T, S265V, S265W, K269E, K269F, K269G, K269H, K269I, K269L, K269M, K269N, K269P, K269Q, K269S, K269T, K269V, K269W, K269Y, A273C, A273D, A273H, A273I, A273K, A273L, A273N, A273Q, A273R, A273Y, R280A, R280C, R280D, R280E, R280F, R280G, R280H, R280K, R280L, R280M, R280S, R280T, R280V, R280W, R280Y, L282F, L282G, L282H, L282I, L282K, L282M, L282N, L282Q, L282R, L282V, L282Y, S285A, S285C, S285D, S285E, S285K, S285P, S285Q, S285R, S285W, Q286A, Q286D, Q286E, Q286K, Q286P, Q286R, A289C, A289D, A289E, A289K, A289L, A289R, A293C, A293R, N296C, N296D, N296E, N296K, N296R, N296V, A297C, A297K, A297N, A297Q, A297R и G299N.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным вариантам нейтральных металлопротеиназ, где металлопротеиназы содержат множественные мутации, выбранные из S023W/G024M, T004V/S023W/G024W, S023W/G024Y/A288V, T004L/S023W/G024Y, N046Q/N050F/T054L, N050Y/T059R/S129Q, S023W/G024W, A273H/S285P/E292G, S023Y/G024Y, S023Y/G024W, T004S/S023Y/G024W, N046Q/T054K, S023W/G024Y, T004V/S023W, T059K/S066N, N046Q/N050W/T054H/T153A, T004V/S023W/G024Y, L282M/Q286P/A289R, N046Q/R047K/N050Y/T054K, L044Q/T263W/S285R, T004L/S023W/G024W, R047K/N050F/T054K, A273H/S285R, N050Y/T059K/S066Q, T054K/Q192K, N046Q/N050W, L282M/Q286K, T059K/S066Q, T004S/S023W, L282M/Q286R/A289R/K011N, L282M/A289R, N046Q/N050W/T054H, T059K/S129Q, T004S/S023N/G024Y/F210L, T004V/S023W/G024M/A289V, L282M/Q286K/A289R/S132T, N050W/T054H, L282M/Q286R, L282F/Q286K/A289R, T059R/S066Q, R047K/N050W/T054H, S265P/L282M/Q286K/A289R, L282M/Q286R/T229S, L282F/Q286K, T263W/S285R, S265P/L282M/Q286K, T263H/A273H/S285R, T059R/S129V, S032T/T263H/A273H/S285R, T059R/S066Q/S129Q, T004S/G024W, T004V/S023W/G024M, T059K/S066Q/S129Q, L282M/Q286K/A289R/I253V, T004V/S023Y/G024W, T059R/S066N/S129Q, N050F/T054L, T004S/S023N/G024W, T059R/S066N, T059R/S066N/S129V, Q286R/A289R, N046Q/R047K/N050F/T054K, S265P/L282M/Q286P/A289R, S265P/L282M/Q286R/A289R, Q062K/S066Q/S129I, S023N/G024W, N046Q/R047K/N050W/T054H, R047K/T054K, T004L/G024W, T014M/T059R/S129V, T059R/S066Q/N092S/S129I, R047K/N050W/T054K, T004V/G024W, N047K/N050F/T054K, S265P/L282F/Q286K/N061Y, L282F/Q286K/E159V, T004V/S023Y/G024M, S265P/L282F/A289R/T065S, T059K/F063L/S066N/S129V, T004L/S023W, N050F/T054H, T059R/S066Q/S129V, V190I/D220E/S265W/L282F, T004S/S023Y/G024M, T004L/S023N/G024Y, T059K/S066N/S129I, T059R/S066N/S129I, L282M/Q286R/A289R/P162S, N046Q/N050F/T179N, T059K/Y082C/S129V, T059K/S129I, N050Y/T054K, T059K/S066Q/V102A/S129Q, T059R/S066Q/S129I, T059W/S066N/S129V/S290R, T059R/S129I, T059K/S066Q/S129I, T059K/S066Q/S129V, S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N, T004V/S023N/G024W, S265P/Q286K, S265P/L282F/A289R, D220P/S265W, L055F/T059W/S129V, T059R/S129Q/S191R, N050W/T054K, T004S/S023W/G024M, R047K/N050F/T054H, T059K/S066N/K088E, T059K/S066Q/S129I/V291L, L282M/Q286R/A289R, T059R/S066N/F085S/S129I, L282F/Q286P/A289R, L282F/Q286R/A289R, G099D/S265P/L282F/Q286K/A289R, N046Q/N050F, N050Y/T059W/S066N/S129V, T009I/D220P/S265N, V190F/D220P/S265W, N157Y/T263W/A273H/S285R, T263W/A273H/S285R, T263W/S285W, T004V/S023Y, N046Q/R047K/N050W, N050W/T054L, N200Y/S265P/L282F/Q286P/A289R, T059R/S066Q/P264Q, T004V/G024Y, T004L/G024Y, N050Y/S191I, N050Y/T054L, T004L/S023W/G024Y/N155K, F169I/L282F/Q286R/A289R, L282M/Q286K/A289R, F130L/M138L/E152W/D183N, N046Q/R047K/N050Y/T054H, T004V/G024M, N050Y/T059W/S066Q/S129V, S023N/G024Y, T054H/P162Q, T004S/S023W/G024Y, N050Y/T054H, L282F/Q286R/A289R/F169I, R047K/N050W, V190F/D220P, L282M/F173Y, T004L/S023Y, N050W/A288D, V190I/D220P/S265Q, S265P/L282F/Q286P/A289R, S265P/L282F/Q286R/A289R, N046Q/N050Y/T054K, T059W/S066Q, T263W/A273H/S285W, T263W/A273H/S285P, S023Y/G024M, T004L/S023N/G024W, T004V/S023N/G024Y, T059W/S066N/S129Q, T004S/S023Y, T004S/S023N/G024M, T059W/S066N/A070T, T059W/S066Q/S129Q, T263W/A273H, A273H/285P, N046Q/R047K/N050Y/T054L, N046Q/R047K/N050Y, R047K/N050Y, T263H/S285W, R047K/N050F, N046Q/R047K/N050F/T054H, S023N/G024M, T004S/G024Y, R047K/N050Y/T054H, T059W/S066N/S129I, R047K/T054L, T004S/S023W/G024W, M138L/E152F/T146S, D220P/S265N, T004S/G024M, T004V/S023N, N046Q/N050F/T054K, N046Q/N050Y/T054H, Q062H/S066Q/S129Q, T059W/S129Q, T059W/S129V, N050F/T054K, R047K/N050F/T054L, V190I/D220P/S265W, N112I/T263H/A273H/S285R, T059W/S066N/S129V, T059W/S066Q/S129I, T059W/S129I, T263W/S285P, V190I/D220P, A289V/T263H/A273H, T263H/A273H/S285P, N90S/A273H/S285P, R047K/N050Y/T054L, T004S/S023N, T059R/S129Q, N046Q/R047K/T054H, T059W/S066Q/S129V, E152W/T179P, N050Y/S066Q/S129V, T202S/T263W/A273H, T263W/A273H/S285P, M138L/E152W/T179P, N046Q/R047K, N046Q/T054H/F176L, T004L/G024M, T004S/L282M, T263H/A273H, T263H/A273H/S285W, T004L/S023Y/G024M, L282F/Q286P, T004V/S023Y/G024Y, V190F/S265W, M138L/E152F, V190F/D220E/S265W, N046Q/N050F/T054H, N157Y/S285W, T004F/S023Y/G024M, T004V/S023N/G024M, L198I/D220E/S265Q, N046Q/N050Y/T054K/A154T, S016L/D220E/S265W, D220E/S265W, D220E/A237S/S265W, S066Q/S129Q, V190F/D220E/S265Q/T267I, L282M/F173Y/T219S, E152F/T179P, V190I/S265W, M138L/S066Q, M138L/E152W, T059W/S066Q/A070T/S129I, V190F/D220E/S265N, V190F/S265N, N046Q/N050Y и M138L/E152F/T179P.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным вариантам нейтральных металлопротеиназ, где металлопротеиназы содержат множественные мутации, выбранные из V190I/D220P, V190I/D220P/S265Q, V190L/D220E, V190I/D220E/S265Q, V190I/D220E/S265W/L282F, V190L/D220E/S265Q, V190I/D220E/S265W, V190L/D220E/S265N, T059R/S066Q/S129I, V190I/D220E/S265N, V190L/D220E/S265W, V190I/D220E, T059W/S066N/S129V, T059K/S066Q/S129V, T059K/Y082C/S129V, T059R/S066N/S129I, S066Q/S129V, T059R/S066Q/S129V, T059R/S129I, N050Y/T059W/S066N/S129V, D220P/S265N, S066Q/S129I, T059W/S066Q/S129V, T059K/S066Q/S129I, T059R/S129V, N050Y/S066Q/S129V, T059W/S066Q/S129I, N050Y/T059W/S066Q/S129V, T059K/S129I, D220P/S265W, F130L/M138L/T179P, S066N/S129I, T059R/S066N/S129V, F130I/M138L/T179P, T059R/S066Q/N092S/S129I, S066N/S129V, D220E/S265Q, F130L/M138L/E152W/T179P, T059W/S129V, S265P/L282M/Q286R/A289R, S265P/L282F/Q286R/A289R, T059W/S066N/S129I, V190I/D220P/S265W, F130L/E152W/T179P, F130L/M138L/E152F/T179P, Q062K/S066Q/S129I, T059K/S066N/S129I, E152H/T179P, S265P/L282M/Q286K/A289R, F130L/M138L/E152H/T179P, T263W/A273H/S285R, D220E/S265N, F130I/M138L/E152H/T179P, F130V/M138L/E152W/T179P, F130I/M138L/E152W/T179P, T059W/S129I, D220E/S265W, F130V/M138L/T179P, F130L/E152V/T179P, T059R/S129Q, T263W/S285P, F130I/M138L/E152F/T179P, E152W/T179P, V190L/S265Q, F130L/E152F/T179P, L282M/Q286R/A289R/P162S, D220P/S265Q, M138L/E152F/T179P, F130I/E152H/T179P, M138L/E152W/T179P, F130L/T179P, F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H, F130L/M138L/E152H, T263W/A273H/S285W, S265P/Q286K, T059W/S066Q/S129Q, T263W/S285R, T059W/S066N/S129Q, T263W/S285W, T059R/S066N/S129Q, S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N, T059W/S129Q, Q062H/S066Q/S129Q, L282M/Q286R/A289R, V190L/D220E/S265N/V291I, V190L/S265N, F130L/M138L/E152W, N050Y/T059R/S129Q, F130I/T179P, T059K/S066Q/S129Q, T059K/S129Q, S265P/L282M/Q286P/A289R, S265P/L282F/Q286P/A289R, T263W/A273H/S285P, S265P/L282M/Q286K, S016L/D220E/S265W, S066Q/S129Q, S265P/L282M/Q286P, L282F/Q286R/A289R, F130V/E152W/T179P, L044Q/T263W/S285R, L055F/T059W/S129V, V190L/S265W, Q286R/A289R, G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R, F130L/M138L/E152F, T059R/S066Q/S129Q, F130L/E152H, S066N/S129Q, T004S/S023N/G024M/K269N, S265P/L282M, E152F/T179P, T059W/S066N/S129V/S290R, L282F/Q286K/A289R, F130L/M138L, F130I/M138L/E152W, S265P/L282F, F130I/M138L/E152H, F130V/M138L/E152H, V190I/S265Q, M138L/E152M, S265P/L282F/Q286P, M138L/E152H, T059K/S066N/K088E, V190I/S265W, F130L/E152W, L282M/Q286K/A289R, L282M/Q286K/A289R/I253V, T263W/A273H, V190I/S265N, M138L/E152W, A273H/S285R, F130I/M138L, F130L/E152F, F130V/M138L/E152W, T059K/S066Q/V102A/S129Q, F130V/E152H/T179P, F130I/M138L/E152F, F130V/M138L/E152F, M138L/E152F, L282M/Q286R, F130I/E152H, S265P/L282F/A289R/T065S, T263H/A273H/S285R, F130V/M138L, T014M/T059R/S129V, L282M/Q286R/A289R/K11N, A273H/S285P, L282M/Q286K/A289R/S132T, T263H/A273H/S285W, F130V/E152W, S265P/L282F/Q286K/N061Y, F130I/E152W, L198I/D220E/S265Q, V190I/S265L, T263H/S285W, S265P/L282F/A289R, M138L/S066Q, F130I/E152F, N90S/A273H/S285P, S032T/T263H/A273H/S285R, L282F/Q286P/A289R, N157Y/T263W/A273H/S285R, V105A/S129V, T263H/A273H/S285P, S129Q/L282H, T059W/S066Q, F130V/E152H, S023W/G024Y, T004V/S023N, T059R/S066Q, N050W/T054L, L282M/Q286P/A289R, A115V/V190L/S265W, L282M/Q286K, T059R/S066N, L282F/Q286P, T004V/S023W/G024M, S265P/L282F/Q286R/L78H, L282F/Q286K, T004V/S023W/G024Y, S023W/G024M, T059R/R256S, F130V/E152F, T004V/G024W, N050W/T054K, S023Y/G024M, T004V/S023Y, T004V/S023Y/G024M, N050Y/T054H, S023W/G024W, T004V/S023Y/G024Y, T004V/S023N/G024W, F130L/M138L/E152F/T179P/V291I, N050Y/T059K/S066Q, T004V/S023Y/G024W, T059K/S066N, T004V/S023N/G024Y, S023Y/G024W, N050F/T054L, R047K/T054K, S023N/G024W, L282M/A289R, S023Y/G024Y, T004V/G024M, R047K/N050F/T054K, N050F/T054K, T059K/S066Q, S023N/G024M, S023N/G024Y, T004L/S023N, R047K/N050W/T054H, T004L/S023W/G024Y, T004S/S023W, N046Q/N050W/T054H/A142T, T004L/S023Y, T004V/S023W, N050W/T054H, T004S/S023N, T004S/L282M, T004L/S023W, N050F/T054H, N050Y/T054L и R047K/N050W/T054K.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным нейтральным металлопротеиназам, содержащим множественные мутации, выбранные из S066Q/S129V, S066Q/S129I, N050Y/S066Q/S129V, S066N/S129I, T059K/S066Q/S129V, S066N/S129V, F130L/E152W/T179P, S265P/L282M/Q286R/A289R, F130L/E152V/T179P, T059K/S066Q/S129I, T263W/S285P, T059K/S066N/S129I, T263W/A273H/S285P, S265P/L282F/Q286R/A289R, F130V/E152W/T179P, T263W/A273H/S285R, V190I/D220P/S265W, F130L/E152H, S066N/S129Q, S265P/L282M/Q286K/A289R, V190I/D220E, T059R/S066N/S129I, V190I/D220E/S265W, T059K/S129I, T059R/S066Q/S129I, F130I/M138L/E152H/T179P, F130I/T179P, T263W/A273H/S285W, S016L/D220E/S265W, S066Q/S129Q, V190I/D220E/S265Q, T059R/S066Q/S129V, D220E/S265N, V190L/D220E, D220E/S265W, V190I/D220P, V190L/D220E/S265N, L044Q/T263W/S285R, S265P/L282M/Q286P/A289R, F130L/M138L/E152H/T179P, T263W/S285R, L282M/Q286R/A289R, T263W/S285W, F130I/E152H/T179P, V190I/D220E/S265N, V190L/D220E/S265W, V190I/D220P/S265Q, T059R/S066N/S129V, V190L/D220E/S265Q, E152H/T179P, F130L/M138L/E152F/T179P, Q062H/S066Q/S129Q, T059R/S129V, V190I/D220E/S265W/L282F, V190I/S265Q, F130L/E152F/T179P, D220E/S265Q, E152W/T179P, T059K/S066Q/S129Q, F130L/M138L/T179P, F130I/M138L/E152F/T179P, F130L/M138L/E152W/T179P, N050Y/T059W/S066Q/S129V, S265P/L282M/Q286K, T059R/S129I, F130V/E152H/T179P, D220P/S265N, S265P/L282M/Q286P, F130I/E152H, T059R/S066Q/N092S/S129I, F130L/T179P, G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R, T263W/A273H, V190I/S265N, D220P/S265W, F130L/E152W, F130L/M138L/E152H, S265P/L282M, V190I/S265Q, F130L/E152F, T059K/S129Q, Q286R/A289R, M138L/E152W/T179P, F130I/M138L/E152H, D220P/S265Q, V190L/S265N, F130I/M138L/E152W, S265P/Q286K, V190L/S265Q, V190I/S265W, F130L/M138L/E152F, F130V/E152H, E152F/T179P, N050Y/T059W/S066N/S129V, T059R/S066N/S129Q, F130I/E152W, F130V/E152W, T059R/S066Q/S129Q, T263H/A273H/S285P, N90S/A273H/S285P, V190L/D220E/S265N/V291I, T059R/S129Q, A273H/S285P, F130I/M138L/E152W/T179P, F130V/M138L/E152F, N050Y/T059R/S129Q, T059W/S066Q/S129I, F130V/M138L/T179P, F130V/M138L/E152W/T179P, V190L/S265W, F130V/M138L/E152W, T059W/S066Q/S129V, V190I/S265Q, F130V/M138L/E152H, F130I/E152F, N157Y/T263W/A273H/S285R, T263H/S285W, M138L/E152F/T179P, A115V/V190L/S265W, M138L/E152M, T263H/A273H/S285W, F130L/M138L/E152W, T059K/S066N/K088E, F130I/M138L/E152F, F130I/M138L/T179P, T004V/S023N, T059K/S066Q/V102A/S129Q, F130L/M138L, N047K/N050F/T054K, T263H/A273H/S285R, F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H, M138L/E152H, M138L/S066Q, L282M/Q286R/A289R/P162S, L282F/Q286R/A289R, Q062K/S066Q/S129I, A273H/S285R, S265P/L282F/Q286P, S265P/L282F/Q286P/A289R, S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N, T059W/S066N/S129I, V190I/S265L, T059W/S066N/S129V, F130I/M138L, L282M/Q286K/A289R/I253V, R047K/N050F/T054K, M138L/E152F, N050W/T054K, L198I/D220E/S265Q, L282F/Q286K/A289R, N050F/T054K, L282M/Q286R, M138L/E152W, S265P/L282F, F130V/E152F, T059W/S066N/S129Q, F130V/M138L, T263H/A273H, L282M/Q286K/A289R, N046Q/N050W/T054H/A142T, T059W/S066Q/S129Q, S265P/L282F/A289R/T065S, N050F/T054H, S129Q/L282H, L282M/Q286K/A289R/S132T, L282M/Q286R/A289R/K11N, T059K/S066N, R047K/N050W/T054K, T059K/S066Q, T004V/S023Y, T059W/S066N/S129V/S290R, N050Y/T059K/S066Q и R047K/N050Y.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность, (i) обладающую по меньшей мере 70% идентичностью с SEQ ID NO:1, 2, 12 и/или 13, или (ii) способную гибридизоваться с зондом, полученным из любой из нуклеотидных последовательностей, указанной здесь, включая последовательности праймеров, приведенные в примерах, в условиях от средней до высокой жесткости, или (iii) комплементарную нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, 2, 12 и/или 13. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, кодирующим по меньшей мере один такой полинуклеотид. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим эти экспрессирующие векторы. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой Bacillus sp. Настоящее изобретение также относится к нейтральным металлопротеиназам, продуцируемым клетками-хозяевами. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, комплементарным по меньшей мере части последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, 2, 12 и/или 13.

Настоящее изобретение также относится к способам получения фермента, обладающего активностью нейтральной металлопротеиназы, включающим в себя трансформацию клетки-хозяина экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:1, 2, 12 и/или 13; культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих клеткой-хозяином. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой виды Bacillus.

Настоящее изобретение также относится к зондам, содержащим последовательность от 4 до 150 нуклеотидов, в основном идентичных соответствующему фрагменту SEQ ID NO:1, 2, 12 и/или 13, где зонд используют для детекции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, обладающий активностью металлопротеиназы. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты получена из Bacillus sp.

Настоящее изобретение также относится к очищающим композициям, содержащим по меньшей мере одну нейтральную металлопротеиназу, полученную из Bacillus sp. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна нейтральная металлопротеиназа получена из B. amyloliquefaciens. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере одна нейтральная металлопротеиназа содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 и/или 18. В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным нейтральным металлопротеиназам, содержащим по меньшей мере 45% аминокислот, идентичных нейтральной металлопротеиназе, содержащей SEQ ID NO:3, 4 и/или 18. В некоторых вариантах осуществления выделенные нейтральные металлопротеиназы обладают по меньшей мере 50% идентичностью, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 65%, даже более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно 85%, еще более предпочтительно 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно 99% идентичностью с SEQ ID NO:3, 4 и/или 18.

Кроме того, настоящее изобретение относится к очищающим композициям, содержащим по меньшей мере одну нейтральную металлопротеиназу, где по меньшей мере одна из нейтральных металлопротеиназ обладает иммунологической перекрестной реактивностью с нейтральной металлопротеиназой, полученной из Bacillus sp. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы обладают иммунологической перекрестной реактивностью с нейтральной металлопротеиназой, полученной из B. amyloliquefaciens. В альтернативных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы обладают иммунологической перекрестной реактивностью с нейтральной металлопротеиназой, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 и/или 18. В дополнительных вариантах осуществления нейтральные металлопротеиназы обладают перекрестной реактивностью с фрагментами (т.е. частями) нейтральной металлопротеиназы Bacillus sp. и/или нейтральной металлопротеиназы, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 и/или 18. Кроме того, настоящее изобретение относится к очищающим композициям, содержащим по меньшей мере одну нейтральную металлопротеиназу, где нейтральная металлопротеиназа представляет собой вариант нейтральной металлопротеиназы, обладающий аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению в нейтральной металлопротеиназе Bacillus sp., обладающей аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3, 4 и/или 18, в частности, нейтральной металлопротеиназе B. amyloliquefaciens. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к очищающим композициям, содержащим по меньшей мере одну нейтральную металлопротеиназу, где нейтральная металлопротеиназа представляет собой вариант нейтральной металлопротеиназы, обладающий аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты, выполненную в положении, эквивалентном положению нейтральной металлопротеиназы Bacillus sp., обладающей аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:18, в частности, нейтральной металлопротеиназы B. amyloliquefaciens.

В дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции содержат по меньшей мере одну нейтральную металлопротеиназу, содержащую набор мутаций в SEQ ID NO:3, 4 и/или 18. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления варианты нейтральной металлопротеиназы содержат по меньшей мере одну замену, соответствующую положениям аминокислот в SEQ ID NO:3, 4 и/или 18, где варианты нейтральных металлопротеиназ обладают улучшенной производительностью по меньшей мере по одному признаку по сравнению с нейтральной металлопротеиназой B. amyloliquefaciens дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к очищающим композициям, содержащим эффективное для очистки количество по меньшей мере одного металлопротеиназного фермента, где фермент содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:3, 4 и/или 18, и подходящий очищающий состав. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления очищающие композиции дополнительно содержат один или несколько дополнительных ферментов или производных ферментов, выбранных из группы, состоящей из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну нейтральную металлопротеиназу, полученную из Bacillus sp., в частности, B. amyloliquefaciens, где композиции дополнительно содержат по меньшей мере один стабилизатор. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор выбран из боракса, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формата кальция. В некоторых вариантах осуществления настоя