Биспецифические связывающие агенты для модулирования биологической активности

Биспецифические связывающие агенты для модулирования биологической активности

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЛЫКИ НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 60/568656, поданной 5 мая 2004 г., содержание которой включено сюда в качестве ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ В ОТНОШЕНИИ ПРАВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ, СДЕЛАННЫЕ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ И РАЗРАБОТКЕ, КОТОРЫЕ ФИНАНСИРУЮТСЯ ГОСУДАРСТВОМ

Не прилагается

ССЫЛКА НА «СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ», ТАБЛИЦУ, ИЛИ КОМПЬЮТЕРНУЮ ПРОГРАММУ, ПРЕДСТАВЛЯЕМЫЕ В ПРИЛОЖЕНИИ НА КОМПАКТ-ДИСКЕ.

Не прилагается

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Многие заболевания и нарушения вызваны неподходящей или избыточной активацией путей передачи сигнала, вызванной активацией рецепторов клеточной поверхности, например связыванием рецептор-специфичных лигандов. Рецепторы, вовлеченные в инициацию или прогрессию заболеваний или нарушений, таких как злокачественные опухоли или аутоиммунные нарушения, выдвинуты в качестве приоритетных мишеней для разработки терапевтических средств, которые снижают или предотвращают активацию рецепторов.

Примеры рецепторов-мишеней включают, например, рецептор эпидермального фактора роста («EGFR»), рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 («IGF1-R») и рецептор фактора роста тромбоцитарного происхождения («PDGRF»), которые имеют тенденцию к избыточной экспрессии или отклоняющейся от нормы активации во многих патологических состояниях, таких как обычные солидные опухоли, включая немелкоклеточный рак легких и злокачественные опухоли молочной железы, предстательной железы и толстого кишечника, и при многих аутоиммунных заболеваниях, таких как миастения-гравис, системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Активация рецептора приводит к аутофосфорилированию, которое направляет пути передачи сигнала, которые ведут к прогрессии заболевания.

Плодотворные исследования с использованием ингибиторов рецепторов четко показали, что путем предотвращения активации рецептора, ассоциированного с патологическим состоянием, развитие данного патологического состояния может быть изменено. В общем, однако, рецептор или рецепторы, ответственные за патологическое состояние, экспрессированы на многих различных клетках и тканях в дополнение к поврежденным клеткам или тканям. Хотя ингибиторы рецепторов, например герцептин®, мишенью которого является ErbB2 («HER-2»), становятся доступными для клинического применения, новые трудности включают идентификацию терапевтического средства, которое будет эффективно действовать на поврежденные клетки или ткани без направленного действия на незатронутые клетки и ткани.

Одним из подходов для направленного действия агентов специфично на пораженные клетки является применение биспецифических связывающих агентов, иногда обозначаемых здесь как «bsBA». Биспецифические связывающие агенты включают два связывающих домена, каждый из которых специфично распознает отдельную молекулу и связывается с ней (для удобства молекула, специфично связанная каждым соответствующим связывающим доменом, может обозначаться как «лиганд» для связанного домена). В разное время были сделаны попытки получения биспецифических связывающих агентов, примером чего служат Schmidt M, et al., "A bivalent single-chain antibody-toxin specific for ErbB-2 and the EGF receptor", Int J Cancer, 65 (4):538-46 (1996), Lu D, et al., "Simultaneous blockade of both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor signaling pathways in cancer cells with a fully human recombinant bispecific antibody", J Biol Chem. 279 (4):2856-65 and Francois C, et al., "Antibodies directed at mouse IL-2-R alpha and beta chains act in synergy to abolish T-cell proliferation in vitro and delayed type hypersensitivity reaction in vivo", Transpl Int. 9(1):46-50 (1996). Поскольку в bsBA часто используются антитела в качестве одного или обоих связывающих доменов, bsBA иногда включаются в класс агентов, обозначенных как иммунотерапевтические средства.

К сожалению, множество молекул, которые могут использоваться в качестве мишеней для bsBA, ограничено. Только относительно малое число молекул экспрессированы на патологических клетках, но не на нормальных клетках, и поэтому могут использоваться для направленного действия агентов исключительно на поврежденные клетки. Дополнительные молекулы экспрессированны в большем количестве на патологических клетках, чем на нормальных клетках. Данные молекулы могут позволить осуществление предпочтительной доставки агентов к патологическим клеткам по сравнению с нормальными клетками в зависимости от степени, в которой молекула избыточно экспрессирована в нормальных клетках.

Однако даже при существенной гиперэкспрессии молекулы-мишени на клетках-мишенях доставка направленных терапевтических средств часто сопровождается неблагоприятными побочными эффектами вследствие связывания агента с нормальными клетками, экспрессирующими молекулу-мишень. Например, рецептор HER2 (erbB2), представляющий собой мишень для одобренного FDA средства иммунотерапии герцептина®, повышенно экспрессируется в раковых клетках на уровне в 10-100 раз выше, чем экспрессия рецептора HER2 в нераковых клетках. Тем не менее, у некоторой доли пациентов развивается сердечная аритмия и другие неблагоприятные побочные эффекты вследствие связывания герцептина® с нормальными клетками.

Таким образом, необходимо расширить терапевтический диапазон средств для иммунотерапии путем разработки bsBA с улучшенной способностью связываться с клетками-мишенями без связывания с не относящимся к мишеням клетками.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым композициям биспецифических связывающих агентов, а также к содержащим их наборам и способам и применению, относящимся к данным агентам.

В первой группе вариантов осуществления изобретение относится к способам модулирования биологической активности клетки-мишени с использованием биспецифического связывающего агента, (i) имеющего первый связывающий домен, характеризующийся K_d в отношении первой молекулы-мишени на поверхности указанной клетки, равной, по меньшей мере, 10^-7 M, и второй связывающий домен, характеризующийся сродством в отношении второй молекулы-мишени на поверхности указанной клетки, (ii) причем вторая молекула-мишень отличается от указанной первой молекулы-мишени, (iii) где указанное сродство указанного второго связывающего домена в отношении второй молекулы-мишени, по меньшей мере, в 10 раз ниже, чем K_d указанного первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени, и (iv), далее, где если молекула-мишень для указанного первого связывающего домена представляет собой ErbB2, молекула-мишень для указанного второго связывающего домена представляет собой не ErbB3, причем способы предусматривают контактирование биспецифического связывающего агента с клеткой-мишенью в условиях, которые позволяют первому и второму связывающим доменам связываться с первой и второй молекулами-мишенями соответственно, где связывание второго связывающего домена с второй молекулой-мишенью модулирует биологическую активность второй молекулы-мишени с модулированием за счет этого биологической активности клетки-мишени, и, далее, где связывание указанного первого связывающего домена с первой молекулой-мишенью не модулирует биологическую активность клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления биспецифический связывающий агент включает два антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой диатела, два одноцепочечных Fv, связанных непосредственно или посредством линкера, Fv со стабилизированными дисульфидами или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой клетку злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, цитокиновый рецептор или рецептор фактора роста. В некоторых вариантах осуществления ассоциированный с опухолью антиген выбран из группы, состоящей из MART-1, gp100 и MAGE-1. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ракового эмбрионального антигена (CEA), ErbB2, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, простатаспецифичного мембранного антигена (PSMA) и TAG72. В некоторых вариантах осуществления вторая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ErbB3, ErbB4, любого из FGF-рецепторов 1-4, HGF-рецептора, IGF1-R, PDGF рецепторов альфа и бета и C-KIT. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой клетку рака молочной железы, и молекула-мишень представляет собой рецепторную тирозинкиназу, выбранную из группы, состоящей из: рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4). В некоторых вариантах осуществления K_d первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени составляет от 10^-8 до 10^-12 М. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена в отношении второй молекулы-мишени, по меньшей мере, в 20 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени.

Изобретение далее относится к способам модулирования биологической активности молекулы-мишени на клетке-мишени в организме, имеющем клетки-мишени и клетки, не относящиеся к мишеням, где клетки-мишени имеют первую молекулу-мишень на их внешней поверхности и вторую молекулу-мишень на их внешней поверхности и где (i) первая и вторая молекулы-мишени не имеют общего лиганда, (ii) первая молекула-мишень, по меньшей мере, в 10 раз больше представлена на поверхности клеток-мишеней, чем на поверхности клеток, не являющихся мишенями, которые также несут вторую молекулу-мишень, (iii) вторая молекула-мишень имеет биологическую активность, но первая молекула-мишень не имеет ее, и (iv) где молекула-мишень первого связывающего домена представляет собой ErbB2 (HER2), молекула-мишень второго связывающего домена не является ErbB3 (HER3), причем способы предусматривают применение биспецифического связывающего агента, имеющего первый связывающий домен, характеризующийся константой диссоциации (K_d) в отношении первой молекулы-мишени, равной, по меньшей мере, 10^-7 M, и второй связывающий домен, характеризующейся K_d в отношении второй молекулы-мишени, которая, по меньшей мере, в 10 ниже K_d первого связывающего домена, и контактирование биспецифического связывающего агента с клеткой-мишенью в условиях, которые позволяют первому и второму связывающим доменам связываться с первой и второй молекулами-мишенями соответственно, где связывание указанного второго связывающего домена модулирует биологическую активность указанной второй молекулы-мишени на указанной клетке-мишени. В некоторых вариантах осуществления биспецифический связывающий агент включает два антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой диатела, два одноцепочечных Fv, связанных непосредственно или посредством линкера, Fv со стабилизированными дисульфидами или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой клетку злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, цитокиновый рецептор или рецептор фактора роста. В некоторых вариантах осуществления ассоциированный с опухолью антиген выбран из группы, состоящей из MART-1, gp100 и MAGE-1. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ракового эмбрионального антигена (CEA), ErbB2, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, простатаспецифичного мембранного антигена (PSMA) и TAG72. В некоторых вариантах осуществления вторая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ErbB3, ErbB4, любого из FGF-рецепторов 1-4, HGF-рецептора, IGF1-R, PDGF рецепторов альфа и бета и C-KIT. В некоторых вариантах осуществления K_d первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени составляет от 10^-8 до 10^-12 М. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена в отношении второй молекулы-мишени, по меньшей мере, в 20 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена в отношении второй молекулы-мишени, по меньшей мере, в 50 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени. В некоторых вариантах осуществления модулирование представляет собой снижение активности рецепторной тирозинкиназы.

В другой группе вариантов осуществления изобретение относится к биспецифическим связывающим агентам (bsBA), включающим первый связывающий домен, характеризующийся константой диссоциации (K_d) в отношении первой молекулы-мишени на клетке-мишени, равной, по меньшей мере, 10^-7 M, и второй связывающий домен, характеризующийся K_d в отношении второй молекулы-мишени на клетке-мишени, которая, по меньшей мере, в 10 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени, где (i) первая и вторая молекулы-мишени не имеют одного и того же природного лиганда, (ii) вторая, но не первая молекула-мишень имеет биологическую активность и (iii) где молекула-мишень первого связывающего домена представляет собой ErbB2 (HER2), молекула-мишень второго связывающего домена не является ErbB3 (HER3) и, далее, где второй связывающий домен при связывании со второй молекулой-мишенью, модулирует биологическую активность второй молекулы-мишени. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена более чем в 50 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена в 100 или более раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления bsBA включает два антитела. В некоторых из данных вариантов осуществления антитела представляют собой диатела, два одноцепочечных Fv, связанных непосредственно или посредством линкера, Fv со стабилизированными дисульфидами или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, цитокиновый рецептор или рецептор фактора роста. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ракового эмбрионального антигена (CEA), ErbB2, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, простатаспецифичного мембранного антигена (PSMA) и TAG72. В некоторых вариантах осуществления вторая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ErbB3, ErbB4, любого из FGF-рецепторов 1-4, HGF-рецептора, IGF1-R, PDGF рецепторов альфа и бета и C-KIT. В некоторых вариантах осуществления K_d первого связывающего домена составляет от 10^-8 до 10^-12 М. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень гиперэкспрессирована на клетке-мишени, по меньшей мере, в 10 раз по сравнению с ее экспрессией на нормальных клетках.

В другой группе вариантов осуществления изобретение относится к композициям (a) биспецифического связывающего агента (bsBA), содержащего первый связывающий домен, имеющий константу диссоциации (K_d) в отношении первой молекулы-мишени на клетке-мишени, равную, по меньшей мере 10^-7 M, и второй связывающий домен, имеющий K_d в отношении второй молекулы-мишени на клетке-мишени, которая, по меньшей мере, в 10 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена, где первая и вторая молекулы-мишени не имеют одного и того же природного лиганда и где (i) вторая, но не первая молекула-мишень имеет биологическую активность, (ii) где второй связывающий домен при связывании со второй молекулой-мишенью модулирует биологическую активность второй молекулы-мишени и (iii) когда молекула-мишень первого связывающего домена представляет собой ErbB2 (HER2), молекула-мишень второго связывающего домена не является ErbB3 (HER3), и (b) фармацевтически приемлемого носителя. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена в отношении второй молекулы-мишени, по меньшей мере, в 50 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена, по меньшей мере, в 100 или более раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления bsBA включает два антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой диатела, два одноцепочечных Fv, связанных непосредственно или посредством линкера, Fv со стабилизированными дисульфидами или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, цитокиновый рецептор или рецептор фактора роста. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ракового эмбрионального антигена (CEA), ErbB2, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, простатаспецифичного мембранного антигена (PSMA) и TAG72. В некоторых вариантах осуществления вторая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ErbB3, ErbB4, любого из FGF-рецепторов 1-4, HGF-рецептора, IGF1-R, PDGF рецепторов альфа и бета и C-KIT. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень гиперэкспрессирована на клетках-мишенях, по меньшей мере, в 10 раз сильнее по сравнению с ее экспрессией на клетках, не относящихся к мишени, которые также несут вторую молекулу-мишень.

В другой группе вариантов осуществления изобретение относится к вариантам применения биспецифического связывающего агента (bsBA), содержащего первый связывающий домен, имеющий константу диссоциации (K_d) в отношении первой молекулы-мишени на клетке-мишени, равную, по меньшей мере 10^-7 M, и второй связывающий домен, имеющий K_d в отношении второй молекулы-мишени, которая, по меньшей мере, в 10 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена, где (i) первая и вторая молекулы-мишени не имеют одного и того же природного лиганда и где (ii) вторая, но не первая молекула-мишень имеет биологическую активность, (iii) где второй связывающий домен при связывании со второй молекулой-мишенью модулирует биологическую активность второй молекулы-мишени, и (iv) когда молекула-мишень первого связывающего домена представляет собой ErbB2 (HER2), молекула-мишень второго связывающего домена не является ErbB3 (HER3), для производства лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления K_d указанного второго связывающего домена, по меньшей мере, в 50 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления K_d указанного второго связывающего домена, по меньшей мере, в 100 или более раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления bsBA включает два антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой диатела, два одноцепочечных Fv, связанных непосредственно или посредством линкера, Fv со стабилизированными дисульфидами или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления молекулы-мишени, связываемые первым связывающим доменом и вторым связывающим доменом, независимо выбраны из группы, состоящей из ассоциированного с опухолью антигена, цитокинового рецептора и рецептора фактора роста, при условии что первый связывающий домен и второй связывающий домен не связываются с одним и тем же ассоциированным с опухолью антигеном, цитокиновым рецептором или рецептором фактора роста. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство предназначено для ингибирования пролиферации злокачественных клеток. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень гиперэкспрессирована на клетках-мишенях, по меньшей мере, в 10 раз сильнее по сравнению с ее экспрессией на клетках, не относящихся к мишени, каковые также несут вторую молекулу-мишень.

Далее изобретение относится к наборам, содержащим (a) контейнер, и (b) биспецифический связывающий агент (bsBA), содержащий первый связывающий домен, имеющий константу диссоциации (K_d) в отношении первой молекулы-мишени на клетке-мишени, равную, по меньшей мере 10^-7 M, и второй связывающий домен, имеющий K_d в отношении второй молекулы-мишени на клетке-мишени, которая, по меньшей мере, в 10 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена в отношении первой молекулы-мишени, где (i) первая и вторая молекулы-мишени не имеют одного и того же природного лиганда и где (ii) вторая, но не первая молекула-мишень имеет биологическую активность, (iii) где второй связывающий домен при связывании со второй молекулой-мишенью модулирует биологическую активность второй молекулы-мишени, и (iv) когда молекула-мишень первого связывающего домена представляет собой ErbB2 (HER2), молекула-мишень второго связывающего домена не является ErbB3 (HER3). В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена более чем в 50 раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления K_d второго связывающего домена в 100 или более раз ниже, чем K_d первого связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления bsBA включает два антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой диатела, два одноцепочечных Fv, связанных непосредственно или посредством линкера, Fv со стабилизированными дисульфидами или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, цитокиновый рецептор или рецептор фактора роста. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ракового эмбрионального антигена (CEA), ErbB2, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, простатаспецифичного мембранного антигена (PSMA) и TAG72. В некоторых вариантах осуществления вторая молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из ErbB3, ErbB4, любого из FGF-рецепторов 1-4, HGF-рецептора, IGF1-R, PDGF рецепторов альфа и бета и C-KIT. В некоторых вариантах осуществления K_d первого связывающего домена составляет от 10^-8 до 10^-12 М. В некоторых вариантах осуществления первая молекула-мишень гиперэкспрессирована на клетке-мишени, по меньшей мере, в 10 раз по сравнению с ее экспрессией на нормальных клетках.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Введение

Одна из проблем современных средств иммунотерапии состоит в том, что их тенденция связываться с нормальными клетками, так же как и с поврежденными клетками вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Таким образом, одной из целей научного сообщества является разработка иммунотерапевтических средств с улучшенной способностью к связыванию клеток-мишеней (например, патологических клеток) без связывания при этом не относящихся к мишени клеток (то есть нормальных клеток).

Настоящее изобретение относится к композициям и способам улучшения специфичности одного из классов иммунотерапевтических средств в плане связывания клеток-мишеней. Данные способы и композиции обеспечивают улучшенную способность модулировать биологическую активность клеток-мишеней без влияния на соответствующую активность клеток, не относящихся к мишеням. Неожиданно в настоящее время было открыто, что специфичность направленного действия на патологические клетки иммунотерапевтических средств, известных как биспецифические связывающие агенты («bsBA»), может быть увеличена путем контроля различия в сродстве связывания двух связывающих доменов bsBA. bsBA по изобретению, таким образом, могут использоваться для повышения или снижения биологической активности молекулы-мишени на клетках-мишенях и обеспечения таким образом улучшенной способности модулировать биологическую активность клеток-мишеней со сниженным, если вообще присутствующим воздействием на соответствующую активность клеток, не относящихся к мишени.

Как указано в их названии, bsBA имеют два связывающих домена, каждый из них специфичен для отдельной молекулы-мишени (для удобства молекула, специфично связываемая связывающим доменом, может обозначаться как «лиганд» для связывающего домена). Первый связывающий домен, в общем, используется для направленного действия bsBA на выбранную клетку, иногда обозначенную как «клетка-мишень». Таким образом, данный связывающий домен также обозначен здесь как «направляющий домен». В способах настоящего изобретения связывание направляющего домена со своей молекулой-мишенью не индуцирует значимого биологического эффекта в клетке-мишени. Второй связывающий домен связывается со второй молекулой-мишенью на клетке-мишени. Связывание второго связывающего домена со своим лигандом, как подразумевается, модулирует конкретный биологический эффект (то есть увеличение или ингибирование биологической активности). Связывающие домены со способностью модулировать виды биологической активности различными путями известны в данной области.

Часто виды биологической активности ингибируются связыванием связывающего домена со своей молекулой-мишенью. Например, если молекула, связанная со связывающим доменом, является частью цитокинового рецептора, связывание связывающего домена с таким рецептором может блокировать доступ цитокина к его рецептору, ингибируя таким образом биологическую активность, которая может в ином случае индуцироваться данным связыванием. Сходным образом, связывание связывающего домена с рецептором может предотвращать данный рецептор от образования гетеродимера, что требуется для полной активации некоторых цитокиновых рецепторов, например рецептора интерлейкина («IL»)-2. В ином случае связывание связывающего домена может изменить конформацию рецептора, так что он не может связывать свой природный лиганд и за счет этого активироваться. Связывающий домен может быть, наоборот, выбран по своей способности повышать биологическую активность путем связывания с рецептором. Например, связывание связывающего домена с рецептором может имитировать эффект природного лиганда данного рецептора, так что связывание активирует рецептор, или связывание связывающего домена может индуцировать конформационное изменение, которое делает низкоаффинный рецептор высокоаффинным в отношении его природного лиганда.

Как отмечалось, первый связывающий домен bsBA по изобретению служит для направленного действия bsBA на клетку-мишень, в то время как второй служит преимущественно для индукции эффекта на клетку-мишень. Поэтому для удобства различения двух доменов первый связывающий домен обозначается здесь как «направляющий домен», тогда как второй связывающий домен иногда обозначается здесь как «эффекторный домен». Сходным образом, для удобства различения молекул, связывающихся с данными двумя связывающими доменами, молекулы-мишени для эффекторного домена иногда обозначаются как «эффекторные молекулы-мишени», тогда как термин «молекула-мишень» сам по себе относится к мишени направляющего домена.

Предыдущие bsBA были обычно сконструированы с использованием связывающих доменов с наивысшим доступным сродством для каждой из соответствующих молекул-мишеней. Специалистам в данной области понятна малая вероятность того, что один домен будет иметь точно то же сродство в отношении соответствующей ему мишени, что и другой, и поэтому два связывающих домена обычно будут отличаться по сродству. Однако в предыдущих bsBA различия в сродстве обычно были невелики и могли быть значимыми в плане действительного эффекта связывания или незначимыми в этом плане.

Тем не менее, в способах и композициях по изобретению направляющий домен выбран так, что он имеет, по меньшей мере, на порядок большее сродство связывания, чем эффекторный домен в отношении своего лиганда. То есть направляющий домен имеет сродство, по меньшей мере, в 10 раз более высокое в отношении распознаваемой и связываемой им молекулы, чем эффекторный домен имеет в отношении распознаваемой и связываемой им молекулы. В некоторых вариантах осуществления сродство направляющего домена в отношении его лиганда составляет, по меньшей мере, в 15 раз выше, чем таковое эффекторного домена, в других вариантах оно выше в 20 раз или более, в других вариантах осуществления оно выше в 25 раз или более и в некоторых вариантах осуществления он имеет сродство выше в 30, 40, 50 или даже в 100 раз или более, чем сродство эффекторного домена в отношении его мишени, притом что каждое относительно более высокое сродство является более предпочтительным. Поскольку имеется различие по сродству связывания двух связывающих доменов bsBA по изобретению, по меньшей мере, на порядок, данные bsBA иногда обозначаются здесь как «hi-lo» bsBA.

Намеренная и существенная разница в сродстве связывания между направляющим связывающим доменом и эффекторным связывающим доменом предоставляет неожиданные и неизвестные ранее преимущества над известными ранее биспецифическими молекулами. Как отмечалось выше, известные ранее биспецифические агенты имели связывающие радикалы с максимально возможным сродством в отношении лиганда-мишени. Однако биспецифические молекулы со связывающими радикалами, которые имеют сходное сродство, ограничены молекулами, на которые они направлены, и ситуациями, в которых они могут использоваться, по сравнению с композициями и способами по изобретению. Некоторые из преимуществ изобретения могут рассматриваться ссылкой на гипотетический пример.

Рассмотрим случай раковой клетки, которая имеет два рецептора, рецептор A, гиперэкспрессированный на данной раковой клетке по сравнению нормальной клеткой, и рецептор B, который экспрессирован на нормальных клетках примерно в том же количестве копий, которое присутствует на раковой клетке. Биспецифический связывающий агент со связывающими доменами примерно с равным сродством в отношении обоих рецепторов будет иметь тенденцию по наличию примерно равных эффектов в отношении раковых клеток и нормальных, нераковых клеток. Это особенно верно в случае, когда достигаются высокие концентрации bsBA, поскольку bsBA будут стремиться насытить оба рецептора путем моновалентного связывания.

bsBA по изобретению, имеющие более направляющий домен с более высоким сродством, направленный на рецептор A, и эффекторный домен с более низким сродством, направленный на рецептор B, и имеющие преимущество в сродстве для рецептора А в 10, 20, 30 или более раз по сравнению с рецептором B, наоборот, будут преимущественно связываться с раковыми клетками и после обычных кинетических взаимодействий будут связываться в большем количестве с раковыми клетками по сравнению с нормальными клетками. Поэтому вместо неразборчивого связывания с клетками, несущими рецептор B, включающими существенные количества нормальных клеток, эффекторный домен будет избирательно доставляться к раковым клеткам. Так, изобретение обеспечивает более селективное направленное действие эффекторного домена на клетки-мишени.

Далее, связывание более высокоаффинного домена с рецептором А удерживает эффекторный домен вблизи клеточной поверхности, где он доступен для взаимодействия с рецептором B в течение некоторого времени. Это позволяет эффекторному домену связывать рецептор B даже несмотря на то, что его относительно низкого сродства к рецептору B обычно может быть недостаточно для удержания его на рецепторе, когда эффекторный домен представляется в виде «свободной», «моновалентной» (или «унивалентной») молекулы.

Специалистам в данной области понятно, что константа диссоциации («Kd») антитела или другого лиганда определяется k_on и k_off лиганда. То есть K_d представляет баланс между временем, в течение которого антитело или другой лиганд является связанным с молекулой-мишенью, и временем, когда оно не связано с ней. Поэтому низкоаффинный связывающий домен часто имеет низкое сродство именно из-за своей тенденции диссоциировать со своей молекулы-мишени. В течение периода, когда связывающий домен диссоциирует со своей молекулы-мишени, он может двигаться прочь за счет броуновского движения, тока жидкости или других кинетических сил, действующих на молекулу связывающего домена. Удержание низкоаффинного домена высокоаффинным доменом bsBA способствует поддержанию низкоаффинного домена вблизи рецептора, на который направлен низкоаффинный домен, и, таким образом, имеется тенденция повышения вероятности того, что в какой-либо момент времени низкоаффинный домен сможет связаться со своей молекулой-мишенью. Поскольку молекула-мишень низкоаффинного домена bsBA по изобретению в данном предположении является рецепторной киназой, имеется тенденция повышения способности bsBA связываться с данной рецепторной киназой-мишенью, и поэтому повышается его биологическое действие на клетки-мишени.

В предпочтительных вариантах осуществления два связывающих домена bsBA по изобретению связывают молекулы-мишени, которые обычно не связываются одним и тем же лигандом. Специалисты в данной области понимают, что некоторые лиганды, например интерлейкин IL-2, связываются двумя различными рецепторными цепями и что эти две цепи, связав IL-2, после этого взаимодействуют с образованием полностью биологически активной единицы. Когда bsBA, направленные на две рецепторные цепи, могут за счет этого предотвращать полную активацию такого рецептора, оба связывающих домена таких bsBA, конечно, направлены на один рецептор.

Наконец, образование тримера между bsBA и двумя молекулами-мишенями, связанными связывающими доменами, имеет дополнительное преимущество связывания молекул-мишеней в близости одной от другой и предотвращения их нормальной диффузии через липидный бислой клеточной мембраны. Перекрестное связывание различных рецепторов за счет bsBA само по себе, как полагают, вносит вклад в цитотоксические или цитостатические эффекты bsBA на клетки-мишени. Например, каскады передачи сигнала обычно активируются двумя белками, связывающимися друг с другом с образованием гетеродимера, или киназой, которая модулирует (обычно фосфорилированием) следующий белок в каскаде инициации. Перекрестное связывание различных рецепторов может препятствовать способности рецепторов образовывать их нормальные гетеродимеры или модулировать белок, которые обычно являются следующей стадией каскада инициации.

В одной группе вариантов осуществления направляющий домен bsBA связывается с рецептором клеточной поверхности, который преимущественно экспрессируется или избыточно экспрессируется на клетке-мишени, ассоциированной с заболеванием или нарушением (например, клетке рака молочной железы), а эффекторный домен связывается с рецептором клеточной поверхности, который экспрессирован повсеместно или везде на клетках-мишенях или клетках, не относящихся к мишени. Типовые рецепторы клеточной поверхности, на которые может действовать bsBA по изобретению, описаны ниже. В предпочтительных вариантах осуществления молекула, подлежащая связыванию направляющим доменом, экспрессируется на клетках-мишенях на уровне, более высоком по сравнению с уровнем молекулы, подлежащей связыванию эффекторным доменом. Так, bsBA и способы по изобретению особенно подходят для улучшения специфичной доставки эффекторных молекул к клеткам с молекулами-мишенями, которые могут связываться без различия обычными антителами или биспецифическими агентами или и тем, и тем. Специалистам в данной области понятно, что клетки различных злокачественных опухолей могут избыточно экспрессировать различные антигены или могут избыточно экспрессировать один и тот же антиген в различных степенях, как это делают клетки различных типов злокачественных опухолей. Таким образом, при конструировании bsBA по изобретению имеется в виду, что специалист-практик выберет направляющий домен, который направлен на рецептор клеточной поверхности, избыточно экспрессированный на конкретных клетках, подлежащих действию конкретного bsBA.

В некоторых вариантах осуществления направляющий домен bsBA связывается с первым рецептором клеточной поверхности, который преимущественно экспрессирован или избыточно экспрессирован на клетке-мишени, ассоциированной с заболеванием или нарушением (например, на раковой клетке), а эффекторный домен связывается со вторым рецептором клеточной поверхности, который избыточно экспрессирован на патологической клетке (например, на раковой клетке) по сравнению с нормальными клетками, но экспрессирован на более низком уровне, чем первый рецептор клеточной поверхности. В данных вариантах осуществления различие в уровне экспрессии между первым и вторым рецепторами клеточной поверхности опять улучшает специфичную доставку эффекторных молекул к клеткам с молекулами-мишенями.

Как отмечалось в описании предшествующего уровня техники, даже н