Комбинированные вакцины с низкой дозой конъюгата hib

Комбинированные вакцины с низкой дозой конъюгата hib

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Все процитированные документы включены в настоящее описание посредством ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области комбинированных вакцин, в частности вакцин для защиты от дифтерии, столбняка, коклюша и Н.influenzae типа b ("Hib").

Предшествующий уровень техники

Известны комбинированные вакцины, содержащие антигены для иммунизации против дифтерии, столбняка, коклюша и Hib (вакцины "DTP-Hib"). Три вакцины этого типа доступны на рынке под названиями TETRAMUNE™ и QUATTVAXEM™ (содержащие клеточные антигены коклюша "DTwP-Hib") и INFANRDC-Hib™ (содержащие бесклеточные антигены коклюша "DTaP-Hib").

Включение Hib-конъюгатов в вакцины DTwP-Hib было связано со снижением ответа анти-Hib [1, 2]. Кроме того, Hib-конъюгаты нестабильны в водной среде и не выдерживают долгого хранения в такой форме [3]. По этой причине обычной практикой является предоставление Hib компонента в виде лиофилизированного порошка, который перед применением смешивают с жидкой композицией, содержащей другие антигены.

Hib-конъюгатные антигены недешевы в производстве, и существует опасение, что их стоимость будет сдерживать широкое распространение в развивающихся странах, поэтому были разработаны альтернативные стратегии для применения Hib-конъюгатов [4-6]. Один подход для расширения дальнейшего использования этих конъюгатов заключается во введении двух доз (например, в возрасте 3 и 5 месяцев [5] или 4 и 6 месяцев [6]) по сравнению с обычными тремя дозами (в 2, 4 и 6 месяцев [7]). В другом подходе использовали более низкие дозы (обычно дробные дозы 1/2, 1/3, 1/4 и т.д.) [4, 6], в то время как обычно Hib-конъюгаты используют в дозе 10 мкг/дозу. Например, в работе [6] Hib-конъюгаты вводили в дозе 5 мкг/дозу или 3,33 мкг/дозу.

Такой же подход распространяется и на применение Hib-конъюгатов в составе вакцин DTP-Hib. Например, в работе [8] сравнивают применение Hib-конъюгата в полной дозе, половине и одной трети дозы в комбинации с вакциной DTwP, и, хотя средние геометрические концентрации антител анти-PRP были ниже у пациентов, получавших комбинированные вакцины DTP-Hib по сравнению с пациентами, получавшими отдельно DTP и Hib, во всех случаях наблюдались приемлемые протективные анти-Hib иммунные ответы. В работе [9] использовали 10-кратное разведение дозы Hib-конъюгата при восстановлении одной дозы Hib в 10-дозовом флаконе с DTwP. В работе [10] описано восстановление лиофилизированного Hib-конъюгата в полной дозе, половине или четверти дозы при использовании вакцины TRTTANRIX™ DTwP-HBsAg.

Однако в каждом из этих случаев Hib-конъюгат находился в лиофилизированной форме, и его нужно было восстанавливать в водном растворе антигенов DTP перед применением. Таким образом, эти вакцины должны поставляться в двух отдельных контейнерах (в одном - водный раствор DTP, в другом - лиофилизированный Hib), что влечет за собой дополнительные расходы и логистические требования на стадии упаковки, транспортировки, хранения и применения. Поскольку вакцины со сниженной дозой предназначены для сокращения расходов и поощрения применения в развивающихся странах, эти дополнительные требования являются значительным недостатком. Необходимость этапа восстановления также означает наличие риска ошибки конечного пользователя, тенденции к нестандартным дозировкам, риска загрязнения смешанного продукта и необходимости обучения персонала процедуре восстановления. Все эти проблемы препятствуют продвижению на целевой рынок, т.е. развивающийся мир.

Таким образом, остается потребность в комбинированной вакцине, содержащей низкую дозу Hib-конъюгатного антигена и не требующей отдельной упаковки Hib антигена.

Раскрытие изобретения

Изобретение обеспечивает комбинированную вакцину, включающую антигены для защиты субъекта от, по меньшей мере, дифтерии (′D′), столбняка (′Т′), коклюша (′Р′) и H.influenzae типа b (′Hib′), в которой: (а) антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib; (b) концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл; и (с) конъюгат Hib никогда не лиофилизируют. Было обнаружено, что вакцины по изобретению безопасны и высокоиммуногенны по сравнению с иммунными ответами, наблюдаемыми в ссылках 6, 8 и 9.

Изобретение также обеспечивает комбинированную вакцину, включающую антигены для защиты от, по меньшей мере, дифтерии (′D′), столбняка (′Т′), коклюша (′Р′) и H.influenzae типа b (′Hib′), в которой: (а) антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib; (b) концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл; и (с) вакцина (i) не содержит гидроксида алюминия в качестве адъюванта и/или (ii) не содержит сульфата алюминия калия в качестве адъюванта. Считается, что гидроксид алюминия участвует в деградации конъюгатов сахаридов Hib, поэтому в качестве адъюванта вакцина предпочтительно включает фосфат алюминия. Если присутствует алюминиевый адъювант (например, фосфат алюминия в качестве адъюванта), предпочтительно, чтобы Hib-конъюгат не адсорбировался на нем.

Изобретение также обеспечивает флакон с прокалываемой герметичной крышкой и содержащий комбинированную вакцину, причем эта комбинированная вакцина содержит антигены для защиты субъекта от, по меньшей мере, дифтерии, столбняка, коклюша и H.influenzae типа b (′Hib′), в которой антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib; и в которой: (а) концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл, и (b) прокалываемая герметичная крышка флакона не была проколота.

Изобретение также обеспечивает герметично закрытый контейнер, содержащий комбинированную вакцину, включающую антигены для защиты субъекта от, по меньшей мере, дифтерии, столбняка, коклюша и H.influenzae типа b (′Hib′), причем антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib, и концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл.

Изобретение также обеспечивает способ получения комбинированной вакцины, включающей антигены для защиты субъекта от, по меньшей мере, дифтерии (′D′), столбняка (′Т′), коклюша (′Р′) и H.influenzae типа b (′Hib′), причем антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib, и концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл, и где: (а) способ включает этап смешивания указанных антигенов для защиты от D, Т, Р и Hib, и (b) процесс (i) не включает этап лиофилизации Hib-конъюгатного антигена, и/или (ii) не включает этап упаковки дифтерийных, столбнячных и коклюшных антигенов в смешанной форме отдельно от антигена - Hib-конъюгата.

Изобретение также обеспечивает способ помещения комбинированной вакцины в контейнер, причем: (а) вакцина включает антигены для защиты субъекта от, по меньшей мере, дифтерии, столбняка, коклюша и H.influenzae типа b (′Hib,); (b) антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib; и (с) концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл.

Изобретение также обеспечивает способ прикрепления этикетки на контейнер, причем:

(а) контейнер содержит комбинированную вакцину, включающую антигены для защиты субъекта от, по меньшей мере, дифтерии, столбняка, коклюша и H.influenzae типа b (THib,); (b) антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib; и (с) концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл. Этикетка может указывать на то, что в контейнере содержится вакцина.

Изобретение также обеспечивает способ помещения комбинированной вакцины в контейнер и последующего извлечения вакцины из контейнера, причем: (а) вакцина включает антигены для защиты субъекта от, по меньшей мере, дифтерии, столбняка, коклюша и H.influenzae типа b ('Hib,); (b) антиген для защиты от Hib представляет собой конъюгат капсульного сахарида Hib; и (с) концентрация конъюгата Hib в вакцине <15 мкг/мл.

Компоненты DTP

Антиген дифтерии предпочтительно представляет собой дифтерийный токсоид. Получение дифтерийных токсоидов хорошо описано [например, глава 13 ссылки 11]. Можно использовать любой подходящий дифтерийный токсоид. Концентрация дифтерийного токсоида обычно находится в пределах от 5 до 100 Lf/мл (флоккулирующих единиц/мл). Предпочтительная концентрация находится в пределах от 10 до 50 Lf/мл. Более предпочтительная концентрация находится в пределах от 20 до 40 Lf/мл, наиболее предпочтительная концентрация составляет приблизительно 30 Lf/мл. Как вариант, предпочтительная концентрация находится в пределах от 5 до 25 Lf/мл, более предпочтительная концентрация находится в пределах от 10 до 20 Lf/мл, и наиболее предпочтительная концентрация составляет около 15 Lf/мл. Однако если используется бесклеточный антиген коклюша, то предпочтительная концентрация дифтерийного токсоида составляет около 50 Lf/мл.

Антиген столбняка предпочтительно представляет собой столбнячный токсоид. Получение токсоидов столбняка хорошо описано [например, глава 27 ссылки 11]. Можно использовать любой подходящий столбнячный токсоид. Концентрация токсоида столбняка обычно находится в пределах от 1 до 50 Lf/мл. Предпочтительная концентрация находится в пределах от 2 до 9 Lf/мл. Более предпочтительная концентрация находится в пределах от 5 до 8 Lf/мл. Наиболее предпочтительная концентрация составляет около 6,5 Lf/мл. Однако если используется внеклеточный антиген коклюша, то предпочтительная концентрация столбнячного токсоида составляет около 20 Lf/мл.

Антиген коклюша, используемый согласно изобретению, может быть клеточным (например, цельноклеточным) или бесклеточным.

Получение обоих типов антигена хорошо описано [например, см. главу 21 ссылки 11; см. ссылку 12]. Для клеточных антигенов коклюша концентрация антигенов коклюша обычно составляет от 5 до 50 ОЕ/мл. Предпочтительная концентрация составляет от 10 до 40 ОЕ/мл. Более предпочтительная концентрация составляет от 25 до 35 ОЕ/мл. Наиболее предпочтительная концентрация составляет приблизительно 30 ОЕ/мл. Если используются внеклеточные антигены, то предпочтительно использовать голотоксин коклюша (РТ) и филаментный гемагглютинин (FHA), более предпочтительно в комбинации с пертактином (также известным как PRN или 69кДа антиген) и, при необходимости, с агглютиногенами (также известными как фимбрии) 2 и 3 [13]. Типичные уровни антигенов коклюша в дозе вакцины (например, в 0,5 мл) составляют: 10 мкг РТ, 5 мкг FHA, 3 мкг или 5 мкг PRN, 5 мкг объединенных фимбрий. РТ представляет собой токсический белок, и, если он присутствует в антигене коклюша, его предпочтительно детоксицируют. Детоксикация может быть осуществлена химическими и/или генетическими методами. Предпочтительным детоксицированным мутантом является двойной мутант 9K/129G [14].

Конъюгат Hib

Антиген H.influenzae типа b, используемый в вакцинах изобретения, включает антиген капсульного сахарида Hib. Антигены сахарида H.influenzae b хорошо известны [например, глава 14 ссылки 11]. Hib-сахарид конъюгирован с белком-носителем для усиления его иммуногенности, особенно у детей. Получение капсульного сахарида Hib хорошо описано [например, ссылки с 15 по 24]. В изобретении можно использовать любой подходящий Hib-конъюгат. Подходящие белки-носители описаны выше, предпочтительными носителями для сахаридов Hib являются CRM₁₉₇ (′HbOC′), токсоид столбняка (′PRP-T′) и комплекс наружной мембраны N.meningitidis (TRP-OMP').

Сахаридный фрагмент конъюгата может представлять собой полисахарид (например, полноразмерный полирибозилрибитол фосфат (PRP)), но предпочтительно использовать олигосахариды (например, с молекулярной массой от ~1 до ~5 кДа). Их удобно получать фрагментацией очищенного PRP (например, гидролизом), за которой обычно следует выделение фрагментов желательного размера. Если композиция по изобретению включает конъюгированный олигосахарид, получение олигосахарида должно предшествовать конъюгированию.

Предпочтительные белки-носители для ковалентного конъюгирования представляют собой бактериальные токсины или токсоиды, такие как токсоид дифтерии или токсоид столбняка. Особенно предпочтителен мутант токсина дифтерии CRM₁₉₇ [25-27]. К другим подходящим белкам-носителям относятся белок наружной мембраны N.meningitidis [28], синтетические пептиды [29, 30], белки теплового шока [31, 32], белки коклюша [33, 34], цитокины [35], лимфокины [35], гормоны [35], факторы роста [35], искусственные белки, включающие множественные эпитопы CD4+ Т-клеток человека от различных антигенов, производных от патогенов [36], белок D H.influenzae [37, 38], пневмококковый поверхностный белок PspA [39], белки поглощения железа [40], токсин А или В С.difficile [41], и т.д. Предпочтительными носителями являются токсоид дифтерии, токсоид столбняка и CRM₁₉₇.

Можно использовать конъюгаты с соотношением сахарид:белок (по массе) от 1:5 (то есть избыток белка) до 5:1 (то есть избыток сахарида), например соотношения от 1:2 до 5:1 и соотношения от 1:1,25 до 1:2,5.

Конъюгаты могут использоваться в сочетании со свободным белком-носителем [42]. Если данный белок-носитель присутствует в композиции изобретения как в свободной, так и в конъюгированной форме, то неконъюгированная форма предпочтительно составляет не более 5% общего количества белка-носителя в композиции в целом и более предпочтительно составляет не более 2 мас.%.

Можно использовать любую подходящую реакцию конъюгирования, при необходимости - с любым подходящим линкером.

Перед конъюгированием сахарид обычно активизируют или функционализируют. Активация может включать, например, цианилирующие реагенты, такие как CDAP (например, 1-циано-4-диметиламино пиридиния тетрафторборат [43, 44 и т.д.]). В других подходящих методах используют цианамиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU; см. также введение к ссылке 22).

Связи через линкерную группу могут быть образованы при использовании любой известной методики, например, методами, описанными в ссылках 45 и 46. Один тип связи включает восстановительное аминирование полисахарида, соединение получившейся аминогруппы с одним концом линкерной группы, представляющей собой адипиновую кислоту, и затем соединение белка с другим концом линкерной группы, представляющей собой адипиновую кислоту [20, 47, 48]. К другим линкерам относятся В-пропионамидо [49], нитрофенил-этиламин [50], галоацил галиды [51], гликозидные связи [52], 6-аминокапроновая кислота [53], ADH [54], C₄-C₁₂ фрагменты [55] и т.д. Как альтернатива использованию линкера, можно использовать прямое связывание. Прямое связывание с белком может включать окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием белком, как описано, например, в ссылках 56 и 57.

Предпочтительным является процесс, включающий введение аминогрупп в сахарид (например, путем замены концевых =O групп на -NH₂), с последующей дериватизацией адипиновым диэфиром (например, N-гидроксисукцинимидный диэфир адипиновой кислоты) и реакцией с белком-носителем. Другая предпочтительная реакция включает активацию CDAP с белком-носителем D.

После конъюгирования свободные и конъюгированные сахариды можно разделить. Для такого разделения подходит множество методов, включая гидрофобную хроматографию, тангенциальную ультрафильтрацию, диафильтрацию, и т.д. [см. также ссылки 58 и 59 и т.д.]. Если вакцина включает данный сахарид как в свободной, так и в конъюгированной форме, неконъюгированная форма предпочтительно составляет не более 20 мас.% от общего количества сахарида в композиции в целом (например, ≤15%, ≤10%, ≤5%, ≤2%, ≤1%).

Предпочтительный конъюгат содержит олигосахарид Hib, ковалентно связанный с CRM₁₉₇ через линкер, представляющий собой адипиновую кислоту [60, 61]. Токсоид столбняка также является предпочтительным носителем.

Введение Hib антигена предпочтительно приводит к концентрации антител анти-PRP≥0,15 мкг/мл и более предпочтительно ≥1 мкг/мл. Это стандартные приемлемые пороги реакции.

Концентрация конъюгата Hib в вакцинах изобретения <15 мкг/мл, например ≤14 мкг/мл, ≤12 мкг/мл, ≤10 мкг/мл, ≤7,5 мкг/мл, ≤5 мкг/мл, ≤4 мкг/мл, ≤3 мкг/мл, ≤2 мкг/мл, ≤1 мкг/мл и т.д. Если белок-носитель не представляет собой ОМРС, то можно использовать немного более высокие дозы, например <20 мкг/мл, ≤19 мкг/мл, ≤18 мкг/мл, ≤17 мкг/мл, ≤16 мкг/мл и т.д. Концентрация конъюгата Hib в вакцинах по изобретению обычно составляет, по меньшей мере, 0,1 мкг/мл, например ≥0,2 мкг/мл, ≥0,3 мкг/мл, ≥0,4 мкг/мл, ≥0,5 мкг/мл, ≥0,6 мкг/мл, ≥0,7 мкг/мл, ≥0,8 мкг/мл, ≥0,9 мкг/мл, ≥1,0 мкг/мл, ≥1,25 мкг/мл, ≥1,5 мкг/мл, ≥2,0 мкг/мл, ≥3,5 мкг/мл и.т.д. Таким образом, предпочтительные пределы концентраций Hib конъюгата в вакцинах составляют от d₁ до d₂ мкг/мл, где: (i) d₁<d₂, (ii) d₁ выбирают из группы, включающей 0,1, 02, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5 и 4,0; и (iii) d₂ выбирают из группы, включающей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15.

Концентрации Hib конъюгатов определены в описании и формуле изобретения в терминах массы сахарида (т.е. доза конъюгата (носителя+сахарида) в целом выше указанной дозы) во избежание вариаций из-за выбора носителя.

Антигены Hib конъюгата по изобретению не являются и никогда не были лиофилизированными.

Адъюванты

Считается, что гидроксид алюминия участвует в деградации конъюгатов Hib сахарида [62], поэтому предпочтительно, чтобы вакцина содержала в качестве адъюванта фосфат алюминия.

Если в качестве адъюванта присутствует фосфат алюминия, то предпочтительно, чтобы конъюгат Hib не адсорбировался на нем, в противоположность ссылке [63]. Отсутствие адсорбции может быть достигнуто при получении путем подбора соответствующего порядка смешивания, подбора соответствующего уровня рН при смешивании антигена с адъювантом и/или подбора адъюванта с соответствующей точкой нулевого заряда (PZC) [64] (см. ниже).

Если присутствует фосфат алюминия, то токсоид дифтерии обычно адсорбирован на фосфат алюминия. Предпочтительно, чтобы адсорбция являлась частичной, например, из общего количества токсоида дифтерии в композици около 30-80 мас.% адсорбировано (например, около 40%-70%, около 50%-60% и т.д.). Адсорбция токсоида дифтерии повышается с течением времени при хранении приблизительно при 37°С. Токсоид столбняка обычно адсорбирован на фосфат алюминия. Предпочтительно, чтобы адсорбция являлась частичной, например, из общего количества токсоида столбняка в композици не более 40 мас.% адсорбировано (например, не более 30%, не более 20%, не более 10% и т.д.). Уровни адсорбции токсоида столбняка могут составлять около 0%. Hib-конъюгат остается неадсорбированным на алюминиевом адъюванте. Предпочтительно, чтобы не более 15 мас.% Hib-конъюгата в композиции было адсорбировано на фосфате алюминия (например, не больше 10%, не больше 5%, не больше 4%, не больше 3%, не больше 2% или не больше 1%).

Термин "фосфат алюминия" в настоящем описании включает фосфат алюминия, гидроксифосфат алюминия и гидроксифосфат сульфат алюминия. Предпочтительной формой фосфата алюминия для использования по настоящему изобретению является гидроксифосфатная соль.

Молярное соотношение РO₄/Аl³⁺ в фосфате алюминия обычно составляет от 0,3 до 1,2, предпочтительно от 0,8 до 1,2 и более предпочтительно 0,95±0,1. Типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным соотношением РO₄/Аl между 0,84 и 0,92, включая 0,6 мг Al³⁺/мл. Обычно фосфат алюминия аморфен, особенно гидроксифосфатные соли. Обычно фосфат алюминия находится в форме частиц. Обычные диаметры частиц находятся в пределах 0,5-20 мкм (например, около 5-10 мкм) после адсорбции любого антигена.

Точка нулевого заряда (PZC) фосфата алюминия обратно связана со степенью замещения фосфата на гидроксил, и эта степень замещения может изменяться в зависимости от условий реакции и концентрации реагентов, использованных для получения соли преципитацией. Точка PZC также изменяется при изменении концентрации свободных фосфатных ионов в растворе (чем больше фосфата, тем более кислая точка PZC) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (делает точку PZC более основной). Фосфаты алюминия, используемые по изобретению, обычно имеют точку PZC между 5,0 и 7,0, более предпочтительно между 5,5 и 6,0, например приблизительно 5,7.

Фосфат алюминия предпочтительно используют в форме водного раствора, к которому добавлены антигены (примечание: принято обозначать водный фосфат алюминия как "раствор", хотя, в строгом физико-химическом представлении, соль нерастворима и образует суспензию). Предпочтительно разбавлять фосфат алюминия до заданной концентрации и обеспечивать гомогенность раствора перед добавлением антигенных компонентов.

Концентрация Al³⁺ перед добавлением антигенов обычно составляет от 0 до 10 мг/мл. Предпочтительная концентрация составляет от 2 до 6 мг/мл. Более предпочтительная концентрация составляет от 4 до 5 мг/мл, например 4,4 мг/мл (соответствующая концентрации фосфата алюминия 20 мг/мл). Концентрация Al³⁺ в конечных вакцинах по изобретению обычно составляет от 0,1 до 2,0 мг/мл. Предпочтительная концентрация составляет от 0,2 до 1,5 мг/мл. Более предпочтительная концентрация составляет от 0,3 до 1,0 мг/мл. Наиболее предпочтительная концентрация около 0,6 мг/мл.

Раствор фосфата алюминия, используемый для получения вакцин по изобретению, может содержать буфер (например, фосфатный или гистидиновый буфер), но это не является необходимым. Раствор фосфата алюминия предпочтительно является стерильным и апирогенным. Раствор фосфата алюминия может содержать свободные водные ионы фосфата, например, в концентрации от 1,0 до 20 мМ, предпочтительно от 5 до 15 мМ и более предпочтительно около 10 мМ. Раствор фосфата алюминия может также содержать хлорид натрия. Концентрация хлорида натрия находится предпочтительно в пределах от 0,1 до 100 мг/мл (например, 0,5-50 мг/мл, 1-20 мг/мл, 2-10 мг/мл) и более предпочтительно составляет около 3±1 мг/мл. Наличие NaCl облегчает правильное измерение рН перед адсорбцией антигенов.

Хотя использование алюминиевых солей в качестве единственного адъюванта нормально, к другим адъювантам, которые могут быть включены в вакцины по настоящему изобретению, относятся, без ограничения:

А. Композиции, содержащие минерал

К композициям, содержащим минерал, подходящим для использования в качестве адъювантов по изобретению, относятся минеральные соли, такие как алюминиевые соли и кальциевые соли. Изобретение включает минеральные соли, такие как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [например, см. главы 8 и 9 ссылки 65], или смеси различных минеральных соединений, причем соединения могут быть в любой подходящей форме (например, гель, кристалл, аморфное вещество и т.д.), причем адсорбция является предпочтительной. Композиции, содержащие минералы, также могут быть приведены в форму частиц соли металла [66].

Предпочтительно, чтобы вакцинные композиции по изобретению были по существу свободны от гидроксидов алюминия (например, оксигидроксидов алюминия). Концентрация гидроксидов алюминия в композиции обычно составляет менее 100 мкг/мл, предпочтительно менее 50 мкг/мл, более предпочтительно менее 10 мкг/мл и наиболее предпочтительно менее 1 мкг/мл. В частности, антиген НIb-конъюгата предпочтительно не адсорбирован на гидроксид алюминия.

В качестве адъюванта можно использовать фосфат кальция.

В. Масляные эмульсии

К масляным эмульсиям, подходящим для использования в качестве адъювантов по изобретению, относятся сквален-водные эмульсии, такие как MF59 [глава 10 ссылки 65; см. также ссылку 67] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, приведенные к виду субмикронных частиц при использовании микрофлюидайзера). Также можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA).

С. Сапониновые составы [глава 22 ссылки 65]

В качестве адъюванта по изобретению также можно использовать сапониновые составы. Сапонины представляют собой гетерологичную группу стериновых гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые обнаружены в коре, листьях, стволах, корнях и даже цветах широкого спектра растений. Сапонин из коры мыльного дерева Quillaia saponaria Molina широко изучался в качестве адъюванта. Сапонин также можно получать из Smilax ornata (сарсапарели), Gypsophilla paniculata (невестиной вуали) и Saponaria officianalis (мыльного корня). Составы с сапониновыми адъювантами включают как очищенные составы, такие как QS21, так и липидные составы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). QS21 представлен на рынке как Stimulon™.

Сапониновые композиции очищают при помощи ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и обращено-фазовой ВЭЖХ. При использовании этих методов были идентифицированы специфические фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-А, QH-B и QH-C. Предпочтительно сапонин представляет собой QS21. Метод получения QS21 описан в ссылке [68]. Сапониновые составы также могут включать стерин, например холестерин [69].

Комбинации сапонинов и холестеринов можно использовать для образования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM, "ИСКОМ") [глава 23 ссылки 65]. Иммуностимулирующие комплексы обычно включают фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. В таких комплексах можно использовать любой известный сапонин. Предпочтительно ISCOM включает один или более из следующих сапонинов: QuilA, QHA и QHC. Более подробно эти комплексы описаны в ссылках [69-71]. При необходимости, комплексы ISCOM могут не содержать дополнительного детергента [72].

Обзор разработки адъювантов на основе сапонина можно найти в ссылках [73] и [74].

D. Виросомы и вирусоподобные частицы

В качестве адъювантов по изобретению также можно использовать виросомы и вирусоподобные частицы (VLP, ВПЧ). Эти структуры обычно содержат один или более белков вируса, необязательно в комбинации или в составе с фосфолипидом. Они обычно не патогенны, не реплицируются и обычно не содержат нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть получены рекомбинантным методом или выделены из целых вирусов. Эти вирусные белки, подходящие для использования в виросомах или ВПЧ, включают белки, полученные из вируса гриппа (такие как НА или NA), вируса гепатита В вирус (такие как белки сердцевины или капсида), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Sindbis, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, Норуолкского вируса, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-содержащих фагов, QB-фага (такие как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, фага АР205 и Ту (такие как ретротранспозон белка р1 Ту). ВПЧ более подробно обсуждаются в ссылках [75-80]. Виросомы более подробно обсуждаются, например, в ссылке [81].

Е. Бактериальные или микробные производные

К адъювантам, подходящим для использования по изобретению, относятся бактериальные или микробные производные, такие как нетоксичные производные липополисахарида энтеробактерий (ЛПС), производные липида А, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и ADP-рибозилирующие токсины и детоксицированные производные этих соединений.

Нетоксичные производные ЛПС включают монофосфорил липид A (MPL) и 3-O-деацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3 де-O-ацилированных монофосфорил липидов А с 4, 5 или 6 ацилируемыми цепями. Предпочтительная форма 3 де-O-ацилированного монофосфорил липида А в виде "мелких частиц" описана в ссылке [82]. Такие "мелкие частицы" 3dMPL являются достаточно малыми, чтобы стерильно фильтроваться через 0,22 мкм мембрану [82]. Другие нетоксичные производные ЛПС включают миметики монофосфорил липида А, такие как производные аминоалкил глюкозаминид фосфата, например, RC-529 [83, 84].

К производным липида А относятся производные липида A Escherichia coli, такие как ОМ-174. Соединение ОМ-174 описано, например, в работах [85 и 86].

К иммуностимулирующим олигонуклеотидам, подходящим для использования в качестве адъювантов по изобретению, относятся нуклеотидные последовательности, содержащие CpG мотив (динуклеотидная последовательность, содержащая неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с гуанозином). Иммуностимулирующая активность показана также для двухцепочечных РНК и олигонуклеотидов, содержащих палиндромные или поли(dG) последовательности.

Фрагменты CpG могут включать модификации/аналоги нуклеотидов, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В работах [87, 88 и 89] описаны возможные аналоговые замены, например замена гуанозина на 2'-дезокси-7-деазагуанозин. Адъювантный эффект олигонуклеотидов CpG более подробно описан в ссылках [90-95].

Последовательность CpG может быть направлена на TLR9, такая как мотив GTCGTT или TTCGTT [96]. Последовательность CpG может быть специфической для индукции иммунной реакции Th1, такой как CpG-A ODN (олигодезоксинуклеотид), или может быть более специфичной для индукции В-клеточного ответа, такой как CpG-B ODN. Олигонуклеотиды CpG-A и CpG-B ODNs обсуждены в работах [97-99]. Предпочтительно CpG представляет собой CpG-A ODN.

Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид CpG был сконструирован таким образом, чтобы 5′-конец был доступен для распознавания рецептором. При необходимости, две олигонуклеотидные последовательности CpG могут быть соединены 3′-концами, образуя "иммуномеры". См., например, ссылки [96] и [100-102].

В качестве адъювантов по изобретению могут быть использованы бактериальные ADP-рибозилирующие токсины и их детоксицированные производные. Предпочтительно, чтобы белок был получен из E.coli (термолабильный энтеротоксин E.coli "LT"), холеры ("СТ") или коклюша ("РТ"). Использование детоксицированных ADP-рибозилирующих токсинов в качестве адъюванта для слизистой оболочки описано в ссылке [103], а в качестве парентерального адъюванта - в ссылке [104]. Токсин или токсоид предпочтительно находится в форме голотоксина, включающего как А, так и В субъедницы. Предпочтительно субъединица А содержит детоксицирующую мутацию; предпочтительно субъединица В не мутирована. Предпочтительно адъювант представляет собой детоксицированный мутант LT, такой как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Использование ADP-рибозилирующих токсинов и их детоксицированных производных, в частности LT-K63 и LT-R72, в качестве адъювантов описано в ссылках [105-112]. Многочисленные ссылки на аминокислотные замены предпочтительно основаны на выравнивании субъединиц А и В ADP-рибозилирующих токсинов, приведенном в ссылке [113], специфически включенной в настоящее описание в своей полноте посредством ссылки.

F. Иммуномодуляторы человека

Иммуномодуляторы человека, подходящие для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [114] и т.д.) [115], интерфероны (например, интерферон-γ), колониестимулирующий фактор макрофага и фактор некроза опухоли.

G. Биоадгезивные и мукоадгезивные соединения

Биоадгезивные и мукоадгезивные соединения также могут использоваться в качестве адъювантов по изобретению. К подходящим биоадгезивным агентам относятся микросферы этерифицированной гиалуроновой кислоты [116] или мукоадгезивные агенты, такие как поперечно сшитые производные поли(акриловой кислоты), поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлоза. Хитозан и его производные также могут использоваться в качестве адъювантов в изобретении [117].

Н. Микрочастицы

Микрочастицы могут также использоваться в качестве адъювантов в изобретении. Предпочтительными являются микрочастицы (то есть частицы диаметром от ~100 нм до ~150 мкм, более предпочтительно от ~200 нм до ~30 мкм и наиболее предпочтительно от ~500 нм до ~10 мкм), полученные из материалов, являющихся биоразлагаемыми и нетоксичными (например, поли(α-оксикислота), полигидроксимасляная кислота, полиортоэфир, полиангидрид, поликапролактон и т.д.), причем предпочтительным является поли(лактид-ко-гликолид), при необходимости обработанный для получения негативно-заряженной поверхности (например, додецилсульфатом натрия, SDS) или положительно-заряженной поверхности (например, катионным детергентом, таким как цетилтриметиламмония бромид, СТАВ).

I. Липосомы (Главы 13 и 14 ссылки 65)

Примеры липосомных составов, подходящих для использования в качестве адъювантов, описаны в ссылках [118-120].

J. Полиоксиэтиленовый эфир и составы с полиоксиэтиленовым сложным эфиром

Адъюванты, подходящие для использования в изобретении, включают полиоксиэтиленовые эфиры и полиоксиэтиленовые сложные эфиры [121]. Такие составы далее включают поверхностно-активные вещества, представляющие собой полиоксиэтиленовый эфир сорбита, в комбинации с октоксинолом [122], а также поверхностно-активные вещества, представляющие собой полиоксиэтиленовые алкильные простые эфиры или сложные эфиры, в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [123]. Предпочтительные полиоксиэтиленовые эфиры выбирают из группы, включающей: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет-9), полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-8-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.

К. Полифосфазен(РСРР)

Составы с РСРР описаны, например, в ссылках [124 и 125].

L. Мурамиловые пептиды

Примерами мурамиловых пептидов, подходящих для использования в качестве адъювантов в изобретении, являются N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (нор-MDP) и N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1′-2′-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин МТР-РЕ).

М. Имидазохинолоновые соединения.

Примеры имидазохинолоновых соединений, подходящих для использования в качестве адъювантов в изобретении, включают Имиквимод (Imiquamod) и его гомологи (например, "Resiquimod 3М"), описанные подробнее в ссылках [126 и 127].

Изобретение может также включать комбинации аспектов одного или более адъювантов, указанных выше. Например, в изобретении можно использовать следующие композиции адьюванта: (1) сапонин и эмульсия типа "масло в воде" [128]; (2) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное ЛПС (например, 3dMPL) [129]; (3) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное ЛПС (например, 3dMPL) + холестерин; (4) сапонин (например, QS21) + 3dMPL+IL-12 (при необходимости + стерин) [130]; (5) комбинации 3dMPL с, например, QS21 и/или эмульсиями типа "масло в воде" [131]; (6) SAF (Syntex adjuvant formulation), содержащий 10% сквалена, 0,4% Tween 80™, 5% блок-полимера плуроник LI 21, и thr-MDP, либо микрофлюидизированного до субмикронной эмульсии, или смешанного до эмульсии с большим размером частиц; (7) адъювантная система Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или более компонентов клеточной стенки бактерий из группы, включающей монофосфориллипид A (MPL), димиколат трегалозы (TDM), и клеточный цитоскелет (cell wall skeleton - CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox™); и (8) одна или более минеральных солей (таких как соль алюминия)+нетоксичное производное ЛПС (такое как 3dMPL).

Другие вещества, действующие в качестве иммуностимулирующих агентов, описаны в главе 7 ссылки 65.

Дополнительные антигены

Композиции по изобретению содержат антигены D, Т, Р и Hib. Они могут также включать дополнительные антигены, такие как:

- антиген сахарида N.meningitidis серологической группы А, С, W135 и/или Y, такой как олигосахарид, описанный в ссылке [132], из серологической группы С или олигосахариды, описанные в ссылке [133]. Вакцина предпочтительно содержит конъюгаты из 2, 3 или 4 из серологических групп А, С, W135 и Y,

- антиген сахарида Streptococcus pneumoniae [например, ссылки 134-136],

- антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, 137, 138],

- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностные антигены и/или антигены сердцевины [например, 138, 139],

- везикула наружной мембраны (OMV) или препарат пузырька N.meningitidis серологической группы В, такие как описаны в ссылках [140, 141, 142, 143 и т.д],

- белковый антиген N.meningitidis серологической группы В, такой как описанные в ссылках [144-150], причем предпочтительными являются белок ′287′ (см. ниже) и производные (например, ′ΔG287′),

- антиген(ы) полиомиелита [например, 151, 152], такие как IPV.

Композиция может включать один или более из этих дополнительных антигенов. Антигены обычно присутствуют в концентрации, по меньшей мере, 1 мкг/мл каждого. Как правило, концентрация любого данного антигена достаточна для индукции иммунной реакции против этого антигена. Предпочтительно, чтобы протективная эффективность индивидуальных сахаридных антигенов не исчезала при их комбинировании, хотя фактическая иммуногенность (например, титры ELISA) может быть снижена.

Если используется сахаридный антиген, предпочтительно, чтобы он был конъюгирован с белком-носителем для усиления иммуногенности.

В качестве альтернативы использованию белковых антигенов в композиции по изобретению может быть использована нук