Применение стромальных стволовых клеток жировой ткани для лечения свищей

Применение стромальных стволовых клеток жировой ткани для лечения свищей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США №11/065461, поданной 25 февраля 2005, и частичным продолжением заявки на патент США №11/056241, поданной 14 февраля 2005, содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Уровень техники

Как правило, свищ является патологическим соединением или каналом между органами или сосудами, которые обычно не соединены. Свищи могут образоваться в различных частях организма. Например, к типам свищей, названным по части тела, в которой они образуются, относят аноректальный свищ, или свищ заднего прохода, или каловый свищ (между прямой кишкой или другой аноректальной областью и поверхностью кожи), артериовенозная фистула или АВ фистула (между артерией и веной), желчный свищ (между желчными протоками и поверхностью кожи, часто вызываемый операциями на желчном пузыре), шеечный свищ (патологическое отверстие шейки матки), краниопазушная фистула (между внутричерепным пространством и околоносовыми пазухами), межкишечный свищ (между двумя частями кишечника), кишечно-кожный свищ (между кишечником и поверхностью кожи, а именно между двенадцатиперстной кишкой, тощей кишкой или подвздошной кишкой), тонкокишечно-влагалищный свищ (между кишечником и влагалищем), желудочный свищ (между желудком и поверхностью кожи), маточно-перитонеальный (между маткой и внутрибрюшинной полостью), перилимфатическая фистула (разрыв перегородок между средним и внутренним ухом), артериовенозная фистула легкого (между артерией и веной легкого, приводящая в результате к шунтированию крови), прямокишечно-влагалищный свищ (между примой кишкой и влагалищем), пупочный свищ (между пупком и кишечником), трахеопищеводный свищ (между дыхательной и пищеварительной трубками) и мочепузырно-влагалищный свищ (между мочевым пузырем и влагалищем). К причинам образования свищей относятся травма, осложнения после медицинского лечения и заболевание.

Лечение свищей различается в зависимости от причины и выраженности свища и обычно включает хирургическое вмешательство. Используются различные хирургические операции, наиболее часто - фистулотомия, наложение лигатуры (тяжа, который проводится через свищевой канал и оставляет к нему доступ для дренирования) или операция по наложению эндоректального лоскута (при которой здоровая ткань накладывается на внутреннее отверстие свища для предотвращения повторного инфицирования канала калом или другим материалом). Оперативное вмешательство при аноректальных свищах имеет побочные эффекты, включая рецидивирование, повторное инфицирование и недержание.

Воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона и язвенный колит, являются главными причинами аноректальных, межкишечных и кишечно-кожных свищей. Зарегистрированная частота свищей при болезни Крона варьирует от 17% до 50%. Лечение свищей у пациентов с болезнью Крона до настоящего времени вызывает трудности, поскольку для многих таких свищей доступное лечение не эффективно. Подобные свищи и их рецидивы являются крайне неприятными осложнениями, которые значительно снижают уровень жизни пациентов с данной патологией. Последние усовершенствования медицинского лечения (например, лечение посредством Infliximab®) и грамотное оперативное лечение снизили необходимость в сложных оперативных вмешательствах. Однако у многих пациентов излечение не происходит. Неспособность излечения свищей вероятно вызвана неоптимальным качеством ткани, которая поражена болезнью Крона. Действительно, свищи при болезни Крона являются модельной системой заживления раны в самых неблагоприятных из возможных условий.

Другой главной причиной свищей является травма, например, в результате изнасилования или в результате постоянных травм в детстве, тканей влагалища и мочевого пузыря и/или прямой кишки, приводящая к образованию прямокишечно-влагалищного свища и мочепузырно-влагалищного свища. Ежегодно порядка 100000 женщин в развивающихся странах страдают такими свищами (также известными как акушерскими свищами) в результате родов при наличии механического препятствия прохождению плода. В течение родов при наличии механического препятствия прохождению плода давление головки плода на таз матери останавливает кровоснабжение чувствительных тканей в данной области. Омертвевшая ткань отделяется, и у женщины развивается мочепузырно-влагалищный свищ, а иногда прямокишечно-влагалищный свищ. Также канал свища может образовываться в результате постоянного недержания мочи и/или кала. United Nations Population Fund (UNFPA) оценивает пораженность мирового население акушерскими свищами в более чем два миллиона. Этот расчет может быть существенно занижен. Доля успешных попыток первичного хирургического вмешательства варьирует от 88 до 93 процентов, но снижается с числом успешных попыток. Таким образом, значительный процент женщин с акушерскими свищами не могут быть излечены оперативным путем.

Необходимы новые подходы к лечению свищей.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится, кроме прочего, к новым композициям, которые содержат стромальные стволовые клетки жировой ткани. Описанные композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, имеют отчетливый фенотип и проявляют большую фенотипическую однородность, чем ранее описанные композиции стромальных стволовых клеток жировой ткани, таким образом, делая их более подходящими для применения в лечении свищей и ран, чем ранее описанные композиции. Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут содержать растворы или другие вещества, служащие в качестве лекарственных средств или медицинского оборудования, например в качестве шовного материала или адгезивных веществ. Кроме того, представлены новые способы лечения свищей и ран с применением стромальных стволовых клеток жировой ткани, а также наборы их содержащие.

Эти варианты осуществления настоящего изобретения, другие варианты осуществления и их признаки и особенности будут очевидны из описания, чертежей и формулы, которые следуют далее.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 отображены результаты характеристики клеток, выделенные способами примера 1 посредством иммунофлуоресцентного окрашивания. Частота иммуноположительных клеток обозначена как: -, менее 5%; +/-, 6-15%; +, 16-50%; ++, 51-85%; and +++, 86-100%. P - количество пересевов.

На фиг.2 отображено непрямое иммунофлуоресцентное описание характеристик стромальных стволовых клеток жировой ткани. Клетки пациента #001 пересевали 6 раз после… Синим цветом отмечены DAPI-окрашенные ядра. (A) CD90; (B) c-Kit и (C) виментин.

На фиг.3 суммированы клинические результаты, полученные при использовании определенных способов и композиций настоящего изобретения. F - женщины; М - мужчины; NI - без имплантата; NA - не проанализированные.

На фиг.4 отображены кривые роста клеток из аспирата жировой ткани при разных концентрациях FBS (0,5, 2,5 и 10%, как указано). Синовиальные фибробласты человека культивировали в присутствии либо 5%, либо 10% FBS. Количества клеток ± SD выражены в единицах поглощения при 595 нм. Данные представлены из репрезентативного эксперимента с трех лунок.

На фиг.5 отображено вздутие слизистой оболочки прямой кишки после инъекции клеток вблизи зашитого внутреннего отверстия.

На фиг.6 отображены фотографии свища до (А) и спустя восемь недель (В) после инъекции клеток.

На фиг.7А отображены гистограммы флуоресцентной иммуноцитометрии, соответствующей профилю поверхностных маркеров (CD3, CD9, CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31, CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e и CD49f), полученной на клетках, выделенных из липосакционного материала пациентов, участвовавших в исследовании, на шестом пересеве.

На фиг.7В отображены гистограммы флуоресцентной иммуноцитометрии, соответствующей профилю поверхностных маркеров (CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106, CD133, CD166, glicoforina, β2-microglobuline, HLA I, HLA II и NGFR), полученных на клетках, выделенных из липосакционных материалов пациентов, участвовавших в исследовании, на шестом пересеве.

Подробное описание изобретения

1. Определения

Как использовано в описании заявки, следующие термины и фразы имеют следующие определения. Если не указано иного, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют те же значения, которые известны среднему специалисту в данной области, к которой относится изобретение.

Под «жировой тканью» понимается любая жировая ткань. Жировая ткань может быть бурой или белой жировой тканью, подкожной, сальниковой/висцеральной, грудной, семенниковой или жировой тканью других областей. Предпочтительно, жировая ткань является подкожной белой жировой тканью. Клетки могут содержать первичные клеточные культуры или иммортализованные клеточные линии. Жировая ткань может быть жировой тканью любого организма, имеющего жировую ткань. Предпочтительно, жировая ткань является жировой тканью млекопитающего, наиболее предпочтительно, жировая ткань является жировой тканью человека. Общедоступным источником жировой ткани является операция липосакции, однако, источник жировой ткани или способ получения жировой ткани не важен для целей настоящего изобретения. Если желательна трансплантация аутологичных стромальных клеток индивиду, то жировую ткань выделяют у этого пациента.

«Стромальные стволовые клетки жировой ткани» относятся к мезенхимальным стволовым клеткам, которые происходят из жировой ткани.

Термин «адгезивный» относится к любому веществу, которое соединяет или связывает поверхности вместе, например клей.

Термин «клеточная композиция» относится к препарату клеток, где препарат может включать, кроме клеток, неклеточные компоненты, такие как среда для культивирования клеток, например белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, коферменты, антиоксиданты, металлы и тому подобное. Более того, клеточная композиция может содержать компоненты, которые не влияют на рост или жизнеспособность клеточного компонента, но которые применяются для представления клеток в определенном формате, например в виде полимерного матрикса для инкапсуляции или фармацевтического препарата.

Термин «культура» относится к любым растущим клеткам, организмам, многоклеточным образованиям или тканям в среде. Термин «культивирование» относится к любому из способов достижения такого роста и может включать несколько стадий. Термин «дополнительное культивирование» относится к культивированию клетки, организма, многоклеточного образования или ткани до определенной стадии роста, затем используя другой способ культивирования для перевода указанной клетки, организма, многоклеточного образования или ткани на другой уровень роста. «Клеточная культура» относится к росту клеток in vitro. В такой культуре клетки пролиферируют, но они не организуются в ткань per se. «Культивирование ткани» относится к поддержанию роста ткани, например, эксплантаты зародышевых органов или органов взрослых людей in vitro таким образом с сохранением его архитектуры и функции. «Монослойная культура» относится к культуре, в которой клетки размножаются в подходящей среде, при этом в основном прикреплены друг к другу и к подложке. Более того, «суспензионная культура» относится к культуре, в которой клетки размножаются, при этом остаются суспендированы в подходящей среде. Таким же образом, «поточная культура» относится к культивированию клеток или эксплантатов в потоке свежей среды для поддержания роста клеток, например жизнеспособности. Термин «кондиционная среда» относится к супернатанту, не содержащему культуры клеток/тканей, получаемому после отрезка времени в контакте с культивированными клетками таким образом, что среда изменяется и содержит определенные паракринные и/или аутокринные факторы, продуцируемые клетками и секретируемые в среду. «Конфлюэнтной культурой» является клеточная культура, в которой все клетки находятся в контакте и поэтому вся поверхность сосуда для культивирования покрыта, и подразумевается, что клетки достигли своей максимальной плотности, однако конфлюэнтность не обязательно означает, что деления приостановятся или популяция не увеличится в размере.

Термин «культуральная среда» или «среда» известен в данной области техники и относится в общем смысле к любому веществу или препарату, используемому для культивирования живых клеток. Термин «среда», который используется в отношении культуры клеток, включает компоненты окружения клеток. Среды могут быть твердыми, жидкими, газообразными или смесью фаз и материалов. Среды включают как жидкие ростовые среды, так и жидкие среды, которые не поддерживают рост клеток. Среды также включают студенистые среды, такие как агар, агарозу, желатиновый и коллагенный матриксы. К примерам газообразных сред относят газовую фазу, с которой контактируют клетки, растущие на чашке Петри или другом твердом или полутвердом носителе. Термин «среда» также относится к материалу, который предназначен для применения в культуре клеток, даже если он еще не контактировал с клетками. Другими словами, обогащенная питательными веществами жидкость, приготовленная для культивирования бактерий, является средой. Подобным образом, порошкообразная смесь, которая при смешивании с водой или другой жидкостью становится пригодной для культуры клеток, может быть названа «порошкообразной средой». «Среда определенного состава» относится к среде, которая приготовлена из определенных химических (обычно очищенных) компонентов. «Среда определенного состава» не содержит плохо охарактеризованные биологические экстракты, такие как дрожжевые экстракты и мясной бульон. «Обогащенная среда» включает среды, которые разработаны для поддержания роста большинства или всех жизнеспособных форм определенных видов. Обогащенные среды часто включают сложные биологические экстракты. «Средой, подходящей для выращивания культур высокой плотности» является любая среда, в которой культура клеток может достигнуть 3 или более при OD600, если условия (такие как температура и скорость переноса кислорода) позволят такой рост. Термин «минимальная среда» относится к среде, которая поддерживает рост многих типов микроорганизмов, которые не нуждаются ни в каких специальных питательных добавках. Большинство минимальных сред обычно состоят из четырех основных химических групп: аминокислот, углеводов, неорганических солей и витаминов. Минимальная среда обычно выступает в качестве основы для более сложных сред, в которые добавляют такие добавки как сыворотка, буфера, факторы роста, липиды и подобные им. Примеры минимальных сред включают, но не ограничены, Eagles Basal Medium, Minimum Essential Medium, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Medium 199, Nutrient Mixtures Ham's F-I0 and Ham's F-12, Mc Coy's 5A, Dulbecco's MEM/F-I 2, RPMI 1640, и Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM).

Термин «включает» и «включающий» используется как открытая структура, означая, что могут быть включены дополнительные элементы.

Термин «дифференцировка» относится к образованию клеток, экспрессирующих маркеры, про которые известно, что они связаны с клетками, которые более специализированы и близки к тому, чтобы стать терминально-дифференцированными клетками, неспособными к дальнейшему делению или дифференцировке. Например, в контексте поджелудочной железы дифференцировка может быть оценена по образованию кластеров клеток, подобных островковым, содержащим повышенную пропорцию бета-эпителиальных клеток, которые продуцируют повышенные количества инсулина. Термин «дальнейшая» или «большая» дифференцировка относится к клеткам, которые более специализированы и близки к тому, чтобы стать окончательно дифференцированными клетками, неспособными к дальнейшему делению или дифференцировке, чем клетки, из которых они культивированы. Термин «конечная дифференцировка» относится к клеткам, которые стали терминально-дифференцированными клетками, неспособными к дальнейшему делению или дифференцировке.

Термин «свищ» относится к любому патологическому проходу, или каналу, или связи обычно между двумя внутренними органами или проходу из внутреннего органа на поверхность тела. К примерам свищей относятся, но не ограничиваются ими, аноректальный свищ, или свищ заднего прохода, или каловый свищ, артериовенозная фистула или АВ фистула, желчный свищ, шеечный свищ, краниопазушная фистула, межкишечный свищ, кишечно-кожный свищ, тонкокишечно-влагалищный свищ, желудочный свищ, маточно-перитонеальный свищ, перилимфатический свищ, артериовенозная фистула легкого, прямокишечно-влагалищный свищ, пупочный свищ, трахеопищеводный свищ и мочепузырно-влагалищный свищ.

Термин «включая» применяется здесь для обозначения «включая, но не ограничиваясь». Термины «включая» и «включая, но не ограничиваясь» взаимозаменяемые.

«Маркер» относится к биологической молекуле, присутствие которой, концентрация, активность или состояние фосфорилирования могут быть определены и использованы для фенотипирования клетки.

«Пластырем» является перевязочный материал или материал для закрытия, используемый для закрытия или защиты раны или другого поражения.

«Пациент», «индивид» или «хозяин», лечение которого проводят способом по изобретению, может означать либо человека, либо животного, не являющегося человеком.

Фраза «фармацевтически приемлемый» используется в данном случае для ссылки на такие соединения, материалы, композиции и/или лекарственные формы, которые при медицинском показании могут использоваться для контакта с тканями человека и животных, не вызывая чрезмерную токсикацию, аллергическую реакцию, раздражение или другие эффекты или осложнения, соответствующие оправданному соотношению риск/польза.

Фраза «фармацевтически приемлемый носитель», как используется в описании, означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное средство или упаковочный материал растворителя, принимающий участие в доставке или транспортировке данного соединения из одного органа или части тела в другой орган или часть тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не опасным для пациента. Термин «фенотип» относится к наблюдаемым характеристикам всех клеток, таким как размер, морфология, экспрессия белка и т.д.

Термин «клетка-предшественник» относится к клетке, которая имеет способность произвести потомство, более дифференцированное, чем она сама. Например, термин может относиться к недифференцированной клетке или клетке, дифференцировавшейся не до последнего уровня дифференцировки и способной к пролиферации и порождению других клеток-предшественников, способных производить материнские клетки в большом количестве, которые, в свою очередь, могут служить источником дифференцированных или способных к дифференцировке дочерних клеток. В предпочтительном варианте осуществления, термин клетка-предшественник относится к обобщенной материнской клетке, чьи потомки (потомство) подвергаются биологической специализации, зачастую в разных направлениях, путем дифференцировки, например путем приобретения совершенно самостоятельных свойств, как происходит при прогрессирующем разнообразии эмбриональных клеток и тканей. Клеточная дифференцировка является сложным процессом, обычно происходящим путем многих клеточных делений. Дифференцированная клетка может происходить из мультипотентной клетки, которая, в свою очередь, произошла из мультипотентной клетки, и т.д. Несмотря на то, что каждую из этих мультипотентных клеток можно рассматривать как стволовую клетку, перечень типов клеток, источником которых она может служить, может значительно варьировать. Некоторые дифференцированные клетки также способны давать клетки с большим потенциалом развития. Такая способность может быть природной или может быть индуцирована искусственно посредством обработки различными факторами. Согласно данному определению, стволовые клетки также могут быть как клетками-предшественниками, так и многими непосредственными предшественниками терминально-дифференцированных клеток.

«Пролиферация» относится к увеличению числа клеток. «Пролиферирующий» и «пролиферация» относится к клеткам, находящимся в митозе.

Как используется в данном случае, термин «раствор» включает фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, в котором клетки данного изобретения остаются живыми.

Термин «по существу очищенная» в отношении популяции стволовых клеток жировой ткани относится к популяции стволовых клеток жировой ткани, которая не менее чем примерно на 75%, предпочтительно не менее чем примерно на 85%, более предпочтительно не менее чем примерно на 90% и наиболее предпочтительно не менее чем примерно на 95% очищена относительно доли стромальных клеток жировой ткани от общего числа клеток. По-другому, термин «по существу очищенная» относится к популяции стромальных стволовых клеток жировой ткани по настоящему изобретению, которая содержит менее чем примерно 20%, более предпочтительно менее чем примерно 10%, наиболее предпочтительно менее чем примерно 5% коммитированных по определенной линии клеток в исходной неамплифицированной и выделенной популяции до последующего культивирования и амплификации.

«Подложка», как используется в данном случае, относится к любому устройству или материалу, который может служить фундаментом или матриксом для роста стромальных стволовых клеток жировой ткани.

Термин «шовный материал» относится к нити, или волокну, или другому связывающему материалу, который может быть использован для сшивания ран.

Термин «лечение», как используется в данном случае, относится как к закрытию свища или раны, так и к предотвращению прогрессирования или рецидивирования свища или раны.

«Терапевтическое» или «лечебное средство» относится к средству, способному проявлять требуемый биологический эффект у хозяина. Химиотерапевтические и генотоксические средства, которые общепризнанно имеют химическое происхождение, противопоставлены биологическим или вызывающим лечебный эффект посредством определенных механизмов действия, соответственно. Примеры терапевтических средств биологического происхождения включают факторы роста, гормоны и цитокины. Разнообразные лечебные средства общеизвестны в данной области техники и могут быть идентифицированы посредством своих эффектов. Конкретные лечебные средства обладают способностью к регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. Примеры включают химиотерапевтические нуклеотиды, препараты, гормоны, неспецифические (не из класса антител) белки, олигонуклеотиды (например, антисмысловые олигонуклеотиды, которые связываются с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, с последовательностью мРНК)), пептиды и пептидомиметики.

«Рана» является ранением или повреждением ткани, вызванным физическими факторами, приводящими к разрушению нормальной целостности ткани.

2. Новые композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани

В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим стромальные стволовые клетки жировой ткани, с определенными характеристиками, такими как определенный фенотип. Например, стромальные стволовые клетки жировой ткани в клеточной композиции изобретения могут быть охарактеризованы по экспрессии поверхностных клеточных маркеров, размеру, потреблению глюкозы, продукции лактата и клеточному выходу/жизнеспособности. Еще один аспект настоящего изобретения касается композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, которые включают в качестве клеточного компонента по существу очищенные препараты стромальных стволовых клеток жировой ткани определенного фенотипа или их потомство. Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, по настоящему изобретению включают не только по существу очищенные популяции клеток-предшественников, но также могут включать компоненты клеточной культуры, например культуральную среду, содержащую аминокислоты, металлы, факторы коферментов, а также небольшие популяции других стромальных клеток, например, некоторые из которых могут быть последовательными этапами дифференцировки клеток по настоящему изобретению. Более того, другие внеклеточные компоненты могут включать компоненты, которые переводят клеточный компонент в удобный для поддержания в определенных условиях, например имплантации, непрерывного культивирования, или подходящий для использования в качестве биологически совместимого материала или фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, получают способами культивирования, описанными в разделе 4 и в примерах.

В одном из вариантов осуществления предоставлена композиция, содержащая стромальные стволовые клетки жировой ткани, в которой не менее примерно 50%, не менее примерно 60%, не менее примерно 70%, не менее примерно 80%, не менее примерно 85%, не менее примерно 90%, не менее примерно 95% или, предпочтительно, не менее примерно 96%, 97%, 98% или 99% стволовых клеток экспрессируют маркеры CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 и/или CD105. В некоторых вариантах осуществления композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, менее чем примерно 15%, примерно 10%, примерно 5% и, предпочтительно, примерно 4%, 3%, 2% или 1% стволовых клеток экспрессируют маркеры CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 и/или CD133.

В другом варианте осуществления предоставлена композиция, содержащая стромальные стволовые клетки жировой ткани, в которой не менее примерно 50%, не менее примерно 60%, не менее примерно 70%, не менее примерно 80%, не менее примерно 85%, не менее примерно 90%, не менее примерно 95% или, предпочтительно, не менее примерно 96%, 97%, 98% или 99% стволовых клеток экспрессируют маркеры c-Kit, виментин и/или CD90. В некоторых вариантах осуществления в композициях, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани менее чем примерно 15%, примерно 10%, примерно 5% и, предпочтительно, примерно 4%, 3%, 2% или 1% стволовых клеток экспрессируют маркеры CD34, фактор VIII, альфа-актин, десмин, S-100 и/или кератин. Также предоставленное является популяцией стромальных стволовых клеток, которые экспрессируют маркеры c-Kit, виментин и CD90 и не экспрессируют маркеры CD34, фактор VIII, альфа-актин, десмин, S-100 и кератин.

Определение фенотипа клеточной популяции по поверхностным маркерам может быть осуществлено либо посредством индивидуального окрашивания клеток (поточная цитометрия), или посредством приготовления гистологических срезов популяции in situ, выполняемого в соответствии с обычными методиками. Определение профиля экспрессии поверхностных маркеров посредством антител, иммунофенотипическое описание, может быть прямым, при использовании меченых антител, или непрямым, при использовании вторичных меченых антител на первичные специфические антитела к клеточным маркерам, достигая таким образом усиления сигнала. С другой стороны, наличие или отсутствие связывания антитела может быть определено разными методиками, которые включают, но ими не ограничиваются, иммунофлюоресцентную микроскопию и радиографию. Подобным образом можно провести мониторинг уровней связывания антитела при поточной цитометрии, технологии, которая позволяет находить корреляцию между уровнем флюорохрома и количеством антигена, присутствующего на поверхности клетки и специфически связанного с мечеными антителами. Дифференциальная экспрессия группы поверхностных маркеров на популяции клеток предоставляет способ для идентификации и выделения указанной популяции.

В определенных вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, являются суспензиями стромальных стволовых клеток жировой ткани в различных растворах или материалах, например, для использования в качестве фармацевтических препаратов или биоматериалов, как описано более подробно ниже. В одном из вариантов осуществления клеточная композиция включает суспензию этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в растворе Рингера и HSA. В другом варианте осуществления клеточная композиция включает суспензию этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в материале, таком как полимер, клей, гель и так далее. Подобные суспензии могут быть получены, например, посредством осаждения этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в культуральной среде и ресуспендирования их в необходимом растворе или материале. Клетки можно осадить и/или сменить им культуральную среду, например, посредством центрифугирования, фильтрации, ультрафильтрации и т.д.

Концентрация этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в этих клеточных композициях, содержащих эти стромальные стволовые клетки жировой ткани, может быть не менее примерно 5×10⁶, не менее примерно 10×10⁶ клеток/мл, не менее примерно 2×10⁶ клеток/мл, не менее примерно 30×10⁶ клеток/мл, не менее примерно 40×10⁶ клеток/мл.

Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к потомству стромальных стволовых клеток жировой ткани, например к клеткам, которые произошли от стромальных стволовых клеток жировой ткани. Такое потомство может включать как последующие поколения стромальных стволовых клеток жировой ткани, так и коммитированные по определенной линии клетки, полученные посредством стимуляции дифференцировки стромальных стволовых клеток жировой ткани после их выделения из эксплантата, например, стимулированные in vitro. В определенных вариантах осуществления клетки-потомки получаются после примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9 или примерно 10 пересевов родительской популяции. Однако клетки-потомки могут быть получены после любого числа пересевов родительской популяции.

В определенных вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, по изобретению предоставлены как в виде части фармацевтического препарата, например, стерильного, не содержащего нежелательные вирусы, бактерии и другие патогены, так и не содержащего пирогены препарата. То есть для введения человеку композиции по изобретению должны соответствовать как стандартам стерильности, пирогенности, так и обычным стандартам безопасности и чистоты, которые требует отдел по биологическим стандартам FDA.

В определенных вариантах осуществления такие композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут быть использованы для трансплантации животным, предпочтительно млекопитающим, и, еще более предпочтительно, людям. Предпочтительно клетки могут быть аутологичными, но также и аллогенными или ксеногенными относительно хозяина, которому производится трансплантация. Из-за трудностей получения достаточного количества аутологичных стволовых клеток стромальные стволовые клетки жировой ткани ценным альтернативным источником стволовых клеток для терапевтического применения могут служить стромальные стволовые клетки жировой ткани от аллогенного донора. В данной области известно, что стромальные стволовые клетки костного мозга и стромальные клетки жировой ткани не вызывают реакцию аллогенных лимфоцитов in vitro и, следовательно, аллогенные стромальные стволовые клетки жировой ткани, полученные от донора, теоретически могут быть использованы для любого пациента вне зависимости от несовместимости по МНС.

Способы введения композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, индивидам, в частности человеку, которые подробно описаны в данном документе, включают инъекции или имплантации клеток в зоны-мишени индивида, клетки можно поместить в устройство для доставки, которое поможет введению клеток индивиду посредством инъекции или имплантации. Подобные устройства для доставки включают трубки, например катетеры, для инъекции клеток и жидкостей в организм индивида-реципиента. В предпочтительном варианте осуществления, у трубок дополнительно есть игла, например шприц, через которую композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут быть введены индивиду в необходимую область. Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут быть введены в такие устройства для доставки, например в шприц, в разных формах. Например, композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, включают композиции стромальных стволовых клеток жировой ткани, которые, находясь в таком устройстве для доставки, суспендированы в растворе или погружены в поддерживающий матрикс.

Фармацевтически приемлемые носители и разбавители включают солевые, водные буферные растворы, растворители и/или диспергирующие среды. Использование таких носителей широко известно в данной области техники. Раствор предпочтительно стерильный и жидкий в такой степени, чтобы не возникало трудностей с наполнением шприца. Предпочтительно, раствор стабилен при условиях производства и хранения и сохранен от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибки, посредством применения, к примеру, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и подобных им. Растворы, которые используются для приготовления композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, посредством внедрения стромальных стволовых клеток жировой ткани, как описано здесь, в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, при необходимости, другие ингредиенты, перечисленные выше, должны быть в последствии стерилизованы фильтрацией.

Некоторые примеры материалов и растворов, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сукроза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетатцеллюлоза; (4) порошковый трагант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) вспомогательные вещества, такие как масло какао и воск для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоли; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбитол, маннитол и полиэтиленгликоль; (12) эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную водуа; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) рН буферные вещества; (21) полиэфиры; поликарбонаты и/или полиангидриды и (22) другие нетоксичные вещества, используемые в фармацевтических составах.

В некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, также включают адгезивные вещества. В определенных вариантах осуществления адгезивным веществом является адгезивное вещество на основе фибрина, такое как фибриновый гель, или фибриновый клей, или полимер на основе фибрина, или адгезивное вещество, или другой тканевой клей или хирургический клей, такой как, например, цианоакрилат, коллаген, тромбин или полиэтиленгликоль. Другие материалы, которые могут быть использованы, включают, но ими не ограничиваются, альгинат кальция, агарозу, I, II, IV типы или другие изоформы коллагена, полимолочную/полигликолиевую кислоту, производные гиалуроната или другие материалы (Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 305-311; Sechriest V.F. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 534-541; Chu CR et al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29: 1147-1154; Hendrickson D.A. et al. (1994) Orthop. Res. 12: 485-497). В других вариантах осуществления, адгезивным веществом является жидкая повязка, где композиции данного способа, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, смешаны с жидким перевязочным материалом. «Жидкая повязка» является раствором, содержащим соединение, например полимерный материал, которым обрабатывают рану посредством спрея или щеточки с последующим удалением растворителя посредством испаре