Векторы на основе рекомбинантных вирусов отряда mononegavirales

Векторы на основе рекомбинантных вирусов отряда mononegavirales

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales, несущего дополнительную транскрипционную единицу, содержащую чужеродный ген, функционально связанный со стартовой последовательностью гена (GS) вируса отряда Mononegavirales и с концевой последовательностью гена (GE) вируса отряда Mononegavirales, а также к вакцине, содержащей этот вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales.

Живые вирусы, способные реплицироваться в инфицированном хозяине, вызывают сильный и длительный иммунный ответ против экспрессирующихся антигенов этих вирусов. Они эффективно вызывают как гуморальный, так и клеточный иммунный ответы, а также стимулируют биохимические пути, опосредуемые цитокинами и хемокинами. Поэтому, живые аттенуированные вирусы обладают определенными преимуществами по сравнению с композициями вакцин, основанными либо на инактивированных иммуногенах, либо на отдельных субъединицах иммуногенов, которые, как правило, стимулируют лишь гуморальную часть иммунной системы.

В течение последнего десятилетия технология рекомбинантных ДНК произвела революцию в области генной инженерии геномов как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов. В частности, в настоящее время возможно вводить чужеродные гены в геном вируса так, что при репликации нового вирусного вектора в животном-хозяине экспрессируется чужеродный белок, который может проявлять биологическую активность в животном-хозяине. Как таковые, рекомбинантные вирусные векторы используются не только для контроля и предотвращения микробных инфекций, но также для разработки методов направленной терапии заболеваний, не вызываемых микроорганизмами, таких как злокачественные заболевания, и для генной терапии.

Первая публикация в 1994 году (Schnell et al., EMBO J., 13, 4195-4203, 1994) о создании несегментированных (-)РНК вирусов (вирусов отряда Mononegavirales) полностью из клонированной кДНК при помощи методов, называемых «обратная генетика», позволило использовать также вирусы отряда Mononegavirales (MV-вирусы) в качестве векторов. С тех пор были опубликованы исследования, касающиеся использования многих вирусов отряда Mononegavirales в качестве вирусных векторов для экспрессии полученных из патогенов чужеродных антигенов для разработки вакцин против патогенов.

В отряд Mononegavirales входят четыре основных семейства: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и Bornaviridae. Принадлежащие этим семействам вирусы имеют геномы, представленные единственной отрицательно-смысловой (-) молекулой РНК, т.е. полярность генома противоположна полярности информационной РНК (иРНК или мРНК), которая обозначается как положительно-смысловая (+). Классификация основных вирусов человека и животных из отряда Mononegavirales представлена в таблице, приведенной ниже:

Таблица 1: Классификация вирусов отряда Mononegavirales
Семейство	Род	Вид
Rhabdoviridae	Lyssavirus	Вирус бешенства (RV)
	Vesiculovirus	Вирус везикулярного стоматита (VSV)
	Novirhabdovirus	Вирус инфекционного гематопоэтического некроза (IHNV)
Paramyxoviridae	Respirovirus	Вирус Сендай (SeV)
		Вирус парагриппа человека 1 и 3 типа (hPIV 1/3)
		Вирус бычьего парагриппа 3 типа (bPIV 3)
	Morbillivirus	Вирус кори
		Вирус чумы крупного рогатого скота
		Вирус собачьей чумки (CDV)
	Rubulavirus	Вирус обезьян 5 (SV-5)
		Вирус парагриппа человека 2 типа (hPIV 2)
		Вирус эпидемического паротита
	Avulavirus	Вирус болезни Ньюкасла (NDV)
	Pneumovirus	Респираторный синцитиальный вирус человека (hRSV)
		Бычий респираторный синцитиальный вирус (bRSV)
Filoviridae	Эбола-подобные вирусы	Вирус Эбола
		Вирус Марбург

Геномная организация и подробности жизненного цикла вирусов отряда Mononegavirales (на сегодняшний день) хорошо известны, а их описание представлено в обзорах многих авторов (Neumann et al., J. Gen. Virology 83, 2635-2662, 2002; Whelan et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004; Conzelmann, K.; Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004). Несмотря на то, что вирусы отряда Mononegavirales имеют различных хозяев и различные морфологические и биологические свойства, они обладают многими общими свойствами, такими как геномная организация и элементы, необходимые для обычного способа репликации и экспрессии генов, что указывает на то, что они произошли от общего предка. Эти покрытые оболочкой вирусы реплицируются в цитоплазме клеток и синтезируют мРНК, которой не требуется сплайсинг.

Вирусы этого отряда состоят из двух главных функциональных единиц, рибонуклеотид-белкового комплекса (RNP) и оболочки. Уже определены полные геномные последовательности для характерных представителей родов каждого семейства, приведенных выше. Размер их геномов варьирует от примерно 9000 нуклеотидов до примерно 19000 нуклеотидов, и геном вирусов содержит от 5 до 10 генов. Структура и организация геномов вирусов отряда Mononegavirales являются очень сходными и обусловлены определенным типом экспрессии генов. Геномы всех MV-вирусов содержат три основных гена, кодирующих: нуклеопротеин (N или NP), фосфопротеин (Р) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (L). Оболочка вируса состоит из матричного (М) белка и одного или нескольких трансмембранных гликопротеинов (например, белков G, HN и F), которые принимают участие в сборке/отпочковании вирусных частиц, а также в процессе присоединения к клетке и/или проникновения вируса в клетку. В зависимости от рода, к которому принадлежит вирус, количество белков может быть увеличено за счет вспомогательных белков, имеющих определенные специфические регуляторные функции при транскрипции и вирусной репликации, или белков, которые вовлечены в реакции вирус-хозяин (например, белки С, V и NS). Порядок расположения генов в геноме MV-вирусов очень консервативен, причем основные белки находятся на 3'-конце или рядом с ним, а большой (L) ген расположен в 5'-конце. Гены белков М, поверхностных гликопротеинов, а также других вспомогательных генов расположены между генами N, P и L.

В комплексе RNP геномная или антигеномная РНК заключены в капсид из белка N и связаны с РНК-зависимой РНК-полимеразой, которая состоит из белков L и Р. После заражения клетки, именно комплекс RNP, а не голый РНК-геном служит матрицей для двух различных функций синтеза РНК, т.е. транскрипции субгеномных мРНК и репликации полноразмерной геномной РНК.

Каждый тандемно расположенный ген разделен так называемыми структурами «соединения генов». Соединение генов содержит консервативную «концевую последовательность гена» (GE), нетранскрибируемую «область между генами» (IGR) и консервативную «стартовую последовательность гена» (GS). Эти обе последовательности являются необходимыми и достаточными для транскрипции генов. В ходе транскрипции каждый ген последовательно транскрибируется в мРНК с помощью вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая начинает процесс транскрипции с 3'-конца геномной РНК на первой GS-последовательности. На каждом участке соединения генов транскрипция прерывается в результате отсоединения РНК-полимеразы на GE-последовательности. Повторная инициация транскрипции происходит на следующей GS-последовательности, хотя и с меньшей эффективностью. В результате этого прерываемого процесса, также называемого процесс «стоп-старта», на каждом участке соединения генов происходит ослабление транскрипции, в результате чего гены, расположенные в 3'-области генома MV-вируса, транскрибируются в большем количестве, чем последующие гены, расположенные в 5'-области. Модульная форма транскрипции генов MV-вирусов, при которой каждый ген является частью отдельного цистрона или транскрипционной единицы, делает эти вирусы необычайно подходящими для встраивания и экспрессии чужеродных генов. Каждая единица транскрипции в геноме MV-вирусов содержит следующие элементы: 3'-GS-открытая рамка считывания (ORF)-GE-5'.

На 3'- и 5'-концах генома MV-вирусов присутствуют короткие нетранскрибируемые области, называемые «лидерными» (примерно 40-50 нуклеотидов) и «трейлерными» (примерно 20-600 нуклеотидов), соответственно. Лидерная и трейлерная последовательности являются необходимыми последовательностями, которые контролируют репликацию геномной РНК, заключение вируса в капсид и упаковку вируса.

Методы обратной генетики и возможность восстановления инфекционного MV-вируса сделали возможным манипуляции с его РНК-геномом через кДНК-копию. Минимальным комплексом инициации репликации, необходимым для синтеза вирусной РНК, является комплекс RNP. Инфицирующий MV-вирус можно восстановить путем совместной экспрессии антигеномной РНК и соответствующих вспомогательных белков с плазмид под контролем РНК-полимеразы фага Т7. На основе оригинального протокола, опубликованного в 1994 году (Schnell et al., 1994 (supra)), (или с незначительными вариациями) было получено восстановление многих видов MV-вирусов.

Болезнь Ньюкасла и птичий грипп являются важными заболеваниями домашней птицы, которые могут вызывать серьезные экономические потери в мировой птицеводческой промышленности. Вирус болезни Ньюкасла (NDV) является несегметированным (-)РНК вирусом, относящимся к отряду Mononegavirales. Геном, длина которого составляет 15 т.п.о., содержит шесть генов, которые кодируют нуклеопротеин (NP), фосфопротеин и V-белок (Р/V), матричный белок (М), слитый белок (F), белок гемагглютинин-нейраминидазу (HN) и РНК-зависимую РНК-полимеразу или большой (L) белок. Гены этого вируса расположены последовательно в следующем порядке 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' и разделены областями между генами различной длины. Перед всеми генами находится стартовая последовательность гена (GS), за которой следуют некодирующая область, кодирующая белки NDV, открытая рамка считывания, вторая некодирующая область и концевая последовательность гена (GE). Длина генома NDV кратна шести, что следует учитывать при встраивании чужеродных генов.

Птичий грипп (AI) представляет собой заболевание домашней птицы, отличающееся тем, что может представлять собой заболевание с симптомами от слабовыраженных респиратурных проявлений до тяжелой болезни с высокой смертностью. Агентом, вызывающим это заболевание, является вирус птичьего гриппа А (AIV), принадлежащий семейству Orthomyxoviridae. AIV содержит восемь геномных РНК-сегментов отрицательной полярности, которые кодируют 10 белков. На основе антигенных свойств гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (N) вирусы птичьего гриппа были разделены на подтипы. На сегодняшний день известно 16 гемагглютининовых (Н1-Н16) и девять нейраминидазных (N1-N9) подтипов. Антитела к гемагглютинину и нейраминидазе важны для гуморального иммунного ответа и ингибируют инфекцию или предотвращают заболевание.

Вирусы птичьего гриппа и болезни Ньюкасла можно сгруппировать в два различных патотипа в соответствии с их вирулентностью. Симптомы, вызываемые низкопатогенным AIV (LPAI) или лентогенным NDV, считаются менее значимыми. В отличие от этого высокопатогенный птичий грипп (HPAI) и болезнь Ньюкасла, вызываемая высоковирулентными вирусами (NDV: мезогенными и велогенными штаммами), представляют собой крайне важными заболеваниями.

В то время как вакцинация против NDV лентогенными штаммами NDV проводится для защиты кур от высоковирулентных штаммов NDV, в большинстве стран вакцинация против HPAI не проводится, поскольку распространение HPAI контролируют, уничтожая зараженную популяцию. Однако в качестве стратегии для минимизации потерь и снижения частоты возникновения болезни можно использовать вакцинацию. Вызываемый вакцинами иммунитет специфичен к подтипу вируса, что означает, что вакцина к подтипу Н5 может защищать от H5 AIV, но не может защищать от других Н-подтипов. Обычно репликация вируса гриппа ограничена легкими, поскольку гемагглютинин вирусов LPAI может расщеплять только триптаза клеток Клара, представляющая собой сериновую протеазу, экспрессирующуюся в легких. На сегодняшний день все вирусы HPAI относятся к подтипам Н5 и Н7. Эти вирусы HPAI в участке расщепления Н содержат много основных аминокислот, таким образом их могут расщеплять широко экспрессирующиеся фурин- и субтилизин-подобные ферменты на субъединицы НА1 и НА2. Поэтому, эти вирусы могут размножаться в других органах.

Вакцины против подтипов Н5 и Н7 могут обеспечивать защиту кур и индюшек против клинических проявлений и предотвращать смерть, следующую после заражения HPAI. Кроме традиционного инактивированного целого AIV на масляной основе, экспериментально была показана эффективность иммунизации против AI с помощью вирусных векторов, вакцин в виде белковых субъединиц или ДНК-вакцин. С момента создания обратной генетики получение рекомбинантных вирусов для использования в качестве вакцинных векторов является важным использованием для различных вирусов. Были сконструированы различные рекомбинантные (-)РНК-вирусы, экспрессирующие чужеродные белки. Также гемагглютинин из AIV встраивали в различные вирусные векторы, такие как вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV) (Luschow et al., Vaccine 19, 4249-59, 2001), вирус чумы крупного рогатого скота (Walsh et al., J. Virol. 74, 10165-75, 2000) и вирус везикулярного стоматита (VSV) (Roberts et al., J. Virol. 247, 4704-11, 1998).

Вирус чумы крупного рогатого скота также использовали в качестве вируса для экспрессии капсидного белка VP1 вируса ящура (Baron et al., 1999, J. of Gen. Virol., vol. 80, p.2031-2039).

В статье Tao et al. (1998, J. of Virol., vol.72, p.2955-2961) описывается создание химерного вируса парагриппа человека (hPIV) 3 типа, в котором гены HN и F из hPIV 1 типа используются для замены (а не в качестве дополнения) эндогенных генов HN и F вируса hPIV 3 типа.

Также NDV используют для экспрессии гемагглютинина AIV. Ген гемагглютинина вируса гриппа A/WSN/33 встраивали между генами Р и М штамма Hitchner B1 вируса болезни Ньюкасла. Этот рекомбинантный вирус защищал мышей от смертельной инфекции, хотя при этом наблюдалась заметная потеря веса у мышей, которые полностью выздоравливали в течение 10 дней (Nakaya et al. J. Virol. 75, 11868-73, 2001). Кроме того, рекомбинантный NDV с тем же участком встраивания для чужеродного гена использовали для экспрессии Н7 из LPAI, но в этом случае лишь 40% вакцинированных кур были защищены от велогенного NDV и HPAI (Swayne et al., Avian Dis. 47, 1047-50, 2003).

Однако в этих публикациях не описано никакого благоприятного эффекта так называемых некодирующих областей эндогенных генов MV-вирусов на экспрессию дополнительных чужеродных генов, встроенных в геном MV-вектора.

Целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного MV-вирусного вектора, который обеспечивает более высокий уровень экспрессии белка, кодируемого чужеродным геном, встроенным в геном вирусного вектора, и/или который обеспечивает более высокую иммуногенность, чем существующие MV-вирусные векторы.

Авторы изобретения обнаружили, что данную задачу решает вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales, несущему дополнительную транскрипционную единицу, содержащую чужеродный ген, функционально связанный с расположенной выше стартовой последовательностью гена (GS) MV-вируса и расположенной ниже концевой последовательностью (GE) гена MV-вируса, отличающемуся тем, что между GS-последовательностью и старт-кодоном чужеродного гена и между стоп-кодоном чужеродного гена и GE-последовательностью расположены 3'-некодирующая область и 5'-некодирующая область (геномные смысловые) гена MV-вируса, соответственно.

Следует отметить, что указанная полярность нуклеотидных цепей в данном документе дана в контексте геномной (-) смысловой цепи, за исключением последовательностей мРНК и кДНК.

Было обнаружено, что наличие 3'- и 5'-некодирующих областей гена MV-вируса в транскрипционной единице, содержащей чужеродный ген, встроенный в геном MV-вируса, положительно влияет на транскрипцию и/или экспрессию чужеродного гена. На фигуре 3 показано, что введение некодирующих областей гена MV-вируса между GS-последовательностью и геном гемагглютинина (НА) вируса птичьего гриппа увеличивает количество мРНК НА, синтезируемой MV-вирусным вектором, несущим ген НА из AIV. Положительный эффект также наблюдался на белковом уровне: сравнение MV-вирусных векторов показало, что интенсивное иммунологическое окрашивание сывороткой, специфичной к HA AIV, наблюдалось только в случает MV-вирусного вектора, несущего чужеродный ген HA AIV, фланкированный некодирующими областями (фигура 4). Таким образом, было обнаружено, что наличие некодирующих областей MV-вируса, фланкирующих чужеродный ген, положительно влияет на характеристики полученного MV-вирусного вектора, хотя авторы изобретения не хотели бы связывать это с какой-либо теорией или моделью, объясняющими эти наблюдения.

Чужеродный ген представляет собой полинуклеотидную молекулу, которая кодирует полипептид или белок, отсутствующие в природном в геноме MV-вируса-реципиента.

Как подчеркнуто выше, общим свойством геномной организации MV-вирусов является их модульная форма транскрипции, при которой последовательно транскрибируются тандемно расположенные транскрипционные единицы. В MV-вирусах дикого типа транскрибируемые гены фланкированы (i) на своих 3'-концах GS-последовательностью и нуклеотидной последовательностью, обозначаемой в данной области как «некодирующая область», и (ii) на своих 5'-концах нуклеотидной последовательностью, также обозначаемой как «некодирующая область», и GE-последовательностью. Поэтому, используемый в настоящем описании термин (3' или 5')-«некодирующая область» определяет нуклеотидную последовательность, которая расположена выше (в 3'-направлении) или ниже (в 5'-направлении) природного гена MV-вируса и охватывает область между GS-последовательностью и старт-кодоном (ATG) гена MV-вируса и область между стоп-кодоном (TAA, TAG или TGA) гена MV-вируса и GE-последовательностью, соответственно. Используемые в настоящем изобретении некодирующие области получены из гена вируса, на основе которого создается вектор (т.е., некодирующие области гомологичны MV-вирусному вектору).

В данной области известна подробная информация об организации генома MV-вирусов, в том числе нуклеотидные последовательности различных генов MV-вирусов и последовательности, контролирующие их транскрипцию (GS и GE), и некодирующие последовательности, фланкирующие гены. Такую информацию можно, например, получить из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), например, на веб-странице в интернете; смотри таблицы 2 и 3).

Некодирующие последовательности, которые предпочтительно использовать в изобретении, получены из генов природных MV-вирусов, но также считается, что замена одного или нескольких нуклеотидов в природной некодирующей области находится в объеме изобретения. В частности, предусмотрены нуклеотидные замены, которые расположены непосредственно выше или ниже старт/стоп кодона чужеродного гена, соответственно, и результат введения искусственного сайта расщепления ферментом рестрикции, позволяющий проводить генетические манипуляции с этими областями.

В предпочтительном рекомбинантном MV-вирусном векторе по настоящему изобретению некодирующие области принадлежат гену, кодирующему белок оболочки MV-вируса, в частности белок M, G, F или HN, или белок, входящий в RNP, в частности белок N, P или L.

В особенно предпочтительном MV-вирусе по настоящему изобретению некодирующие области принадлежат гену, кодирующему белок F или HN.

Специфические нуклеотидные последовательности некодирующих областей для применения в рекомбинантном MV-вирусном векторе по настоящему изобретению представлены в таблице 3.

Таблица 2: Информация о геноме вирусов из отряда Mononegavirales и векторах на их основе
MV-вирус	Информация о геноме: номер доступа в базе данных NCBI	Литературный источник о рекомбинантном вирусном векторе
RV	NC_001542	Mebatsion et al., PNAS 93, 7310-14,1996
VSV	NC_0011560	Kretzschmar et al., J. Virol. 71, 5982-89, 1997
IHNV	NC_001652	-
SeV	NC_001552	Sakai et al., FEBS Lett. 456, 22106, 1999
hPIV1	NC_003461	-
H PIV3	NC_001796	Tao et al., J. Virol. 74, 6448-58, 2000
bPIV3	NC_002161	Tang et al., Vaccine 23, 1657-67, 2005
Вирус кори	NC_001498	Singh et al., Virol. 73 4823-28, 1999
Вирус чумы крупного рогатого скота	NC_006296	Walsh et al., J. Gen. Virol. 81, 709-18, 2000
CDV	NC_001921	Plattet el al., Virus Res. 101, 147-53, 2004
SV 50	NC_006430	He et al., Virology 237, 249-60, 1997
NDV	NC_002617	Zhao et al., J. Gen. Virol. 84, 781-88, 2003
Вирус эпидемического паротита	NC_002200	-
hPIV2	NC_003443	-
hRSV	NC_001781	Bukreyev et al., PNAS 96, 2367-72, 1999
bRSV	NC_001989	Stope et al., J. Virol., 75, 9367-77, 2002
Вирус болезни Эбола	NC_006432	-
Вирус болезни Марбург	NC_001608	-

Предпочтительными GS- и GE-последовательностями, используемыми в данном изобретении в качестве последовательностей транскрипционного контроля, являются последовательности, полученные из природных генов MV-вирусов. Полагают, что эти последовательности модулируют активность РНК-полимеразы в ходе процесса транскрипции, в частности, в ходе инициации транскрипции и модификации 5'-конца мРНК, и при контроле 3'-полиаденилирования и терминации транскрипции. Для каждого MV-вируса начало каждого гена отмечено последовательностью примерно из 10 нуклеотидов. В то время как у некоторых видов MV-вирусов GS-последовательности являются одинаковыми для каждого гена, GS-последовательности в геноме других видов MV-вирусов могут иметь незначительные отличия.

В связи с их общей функцией в образовании 3'-полиА хвоста у мРНК и терминации транскрипции GE-последовательности в MV-вирусах имеют общие конструктивные особенности последовательности. Характерная GE-последовательность содержит U-образный участок длиной 4-8 нуклеотидов. Кроме того, остаток цитозина, расположенный непосредственно выше U-образного участка, является консервативным, а перед ним находится цепочка нуклеотидов, богатая остатками А/U. В различных GE-последовательностях 4 нуклеотида, расположенных непосредственно выше U-образного участка, представляют собой 3'-AUUC-5'.

Контролирующие транскрипцию последовательности, которые определяют границы и места соединения генов MV-вирусов, были идентифицированы для многих генов MV-вирусов при сравнении нуклеотидных последовательностей геномной матрицы и нуклеотидных последовательностей, присутствующих на конце мРНК. Кроме того, в результате большого числа исследований были идентифицированы консенсусные GS- и GE-последовательности, необходимые для эффективной экспрессии генов. Общие характеристики и конкретные примеры GS- и GE-последовательностей можно получить из базы данных последовательностей NCBI (смотри таблицу 2 для номеров доступа в базе данных NCBI), их обзор также приведен в статьях Neumann et al. (J. Virol. 83, 2635-2662, 2002) и Whelan et al. (Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004).

Конкретные предпочтительные GS- и GE-последовательности, используемые в рекомбинантном MV-вирусном векторе по изобретению, приведены в таблице 3, хотя известно, что не всегда возможно определить точную границу между последовательностями GS, некодирующей области и GE. Информация об этих последовательностях раскрыта в базе данных NCBI (смотри номера доступа в таблице 2). Для вируса NDV1 приведена ссылка на номер доступа в базе данных EMBL (Y18898), для RV на номер доступа в базе данных GenBank (M31046).

Таблица 3: Информация о последовательности в местах соединения генов различных MV-вирусов (+ смысловая цепь)
Вирус	GS	Некодирую- щая область (нуклеотиды) между GS и старт-кодоном	Открытая рамка считы-вания	Некодирующая область (нуклеотиды) между стоп-кодоном и GE	GE	Область между генами (между GE и GS) (IGR)
RV	aacacccct	3	N	50	tgaaaaaaa	ct
	aacacccct	20	P	59	tgaaaaaaa	caggc
	aacaccact	6	M	171	tgaaaaaaa	ctatt
	aacatccct	18	G	459	agaaaaaaa	cattagatcagaagaacaactggc
	aacacttct	21	L	52	tgaaaaaaa
IHNV	ggcacttcagttg	100	NP	70	tagaaaaaaa	t
	ggcactatagtgc	25	P	32	agaaaaaaa	t
	ggcacgcaagtgt	41	M2	90	agacagaaaaaaa	t
	ggcacttttgtgc	39	G	28	agacagaaaaaaa	c
	ggcacatttgtgc	14	NV	-6	agatagaaaaaaa	t
	ggcacttttgtgc	64	L	41	agatacaaaaaaa
ВирусСендай	agggtcaaag	54	NP	34	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	93	P	74	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	22	M	85	taagaaaaa	ctt
	agggataaag	43	F	61	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	46	HN	95	taagaaaaa	ccc
	agggtgaatg	18	L	76	taagaaaaa
HPIV1	agggtaaag	54	N	31	aagtaagaaaaa	ctt
	agggtgaatg	93	P	71	aattaagaaaaa	ctt
	agggtcaaag	22	M	82	aaataagaaaaa	cgt
	agggacaaag	265	F	76	aagtaagaaaaa	ctt
	agggttaaag	46	HN	98	gaataagaaaaa	ctt
	agggttaatg	18	L	88	tagtaagaaaaa
bPIV3	aggattaaag	45	N	34	taagaaaaa	ctt
	aggattaatg	69	P	116	taagaaaaa	ctt
	aggatgaaag	22	M	51	aaacaaaaa	ctt
	aggatcaaag	101	F	26	tacaaaaaa	ctt
	aggaacaaag	63	HN	86	taataaaaaa	ctt
	aggagaaaag	12	L	62	taagaaaaa
hPIV3	aggattaaag	45	NP	34	taagaaaa	ctt
	aggattaag	69	P	53	taagaaaaa	ctt
	aggattaaag	22	M	51	taatcaaaaa	ctt
	aggacaaaag	183	F	28	ttataaaaaa	ctt
	aggagtaaag	63	HN	81	tataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	12	L	62	taataaaaa
Вирускори	aggattcaaag	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
	aggaaccagg	50	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	22	M	417	taaacaaaa	ctt
	agggccaagg	574	F	128	taattaaaa	ctt
	agggtgcaag	10	H	74	ttaagaaaaa	cgt
	agggtccaag	12	L	59	ttaaagaaaa
Вирусчумыкруп-ногорога-тогоскота	aggattcaag	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
	aggacccagg	49	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	22	M	408	taccaaacaaaa	ctt
	agggtcaaag	579	F	125	tataaacaaaaa	ctt
	aggatgcaag	10	H	98	ttataaaaaa	cgt
	agggtccaag	12	L	60	taaagaaaa
CDV	agggtcaatg	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
	aggacccagg	49	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggacacaag	22	M	394	taattaatcaaaa	ctt
	agggtccagg	16	F	122	ttaaagaaaa	ctt
	agggctcagg	10	H	100	ttataaaaaaa	cta
	aggatccaag	12	L	53	tacgaaaaaaaa
SV5	aggtccggaacct	83	NP	92	tttaaagaaaaaaa	t
	aggcccggcgggt	47	P	54	ttttagaaaaaa	cgattaacgataaata
	agcccgaacact	20	M	193	Ttcaaagaaaa	caatcatattaagactatccta
	agcacgaacccat	15	F	25	ttttaagaaaaaaa	cgat
	aggaccgaacct	67	SH	64	ttttaaagaaaaaa	ta
	aggcccgaacact	54	HN	99	ttttaagaaaaa	ccaagagaacaat
	aggccaga atg	-3	L	22	tttaagaaaaaa
VSV	aacagtaatc	3	NP	42	tgaaaaaaa	ct
	aacagatatc	0	NS	-3	tga aaaaaa	gt
	aacagatatc	31	M	98	tgaaaaaaa	ct
	aacagagatc	19	G	98	tgaaaaaaa	ct
	aacagcaatc	0	L	31	tgaaaaaaa
NDV	acgggtagaa	56	NP	200	ttagaaaaaa	gt
	acgggtagaa	73	P	169	ttaagaaaaaa	t
	acgggtagaa	24	M	102	Ttagaaaaaa	c
	acgggtagaa	36	F	73	ttaagaaaaa	ctaccggttgtagatgaccaaaggacgatat
	acgggtagaa	81	HN	166	ttaagaaaaaa	tgtaagtggcaatgagatacaaggcaaaacagctcatggtaaataat
	acgggtagga	1	L	67	ttagaaaaaa

В предпочтительном рекомбинантном MV-вирусном векторе по изобретению GS-, GE-последовательности и некодирующие области получены из гена того же MV-вируса.

Способы получения рекомбинантного MV-вирусного вектора, несущего дополнительную единицу транскрипции, содержащую чужеродный ген, хорошо известны в данной области. Например в таблице 2 приведены ссылки на документы, описывающие получение таких рекомбинантных векторных вирусов для различных видов MV-вирусов. В принципе, используемый в настоящем изобретении способ является таким же как и прототип, за исключением того, что встраиваемый в геном MV-вируса чужеродный ген фланкирован соответствующими 3'- и 5'-некодирующими областями, описанными выше.

В общем случае способа по изобретению рекомбинантный MV-вирусный вектор получают путем встраивания выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей (i) чужеродный ген, фланкированный 3'- и 5'-некодирующими областями, описанными выше, и (ii) соответствующих последовательностей транскрипционного контроля, в геном MV-вируса таким образом, чтобы в полученном MV-вирусном векторе перед и после чужеродного гена находились участки соединения генов MV-вируса, в частности, фрагмент геномной нуклеотидной последовательности, содержащий элементы GE-IGR-GS. Присутствие этих выше- и нижележащих элементов гарантирует соответствующую транскрипцию не только встроенных чужеродных генов, но также гомологичных генов MV-вируса, расположенных выше и ниже от встроенного чужеродного гена.

Более того, в способе по настоящему изобретению выделенная молекула нуклеиновой кислоты и геном MV-вируса используются в форме кДНК (+ смысловой). Это обеспечивает легкость манипулирования с желаемыми нуклеотидными молекулами и встраивания их в вирусный геном.

Как правила, для встраивания чужеродного гена можно использовать различные части генома между двумя генами, т.е. чужеродный ген можно встраивать в области между генами (IGR), 3' или 5'-некодирующие области гена, а также в 3'-промоторный-проксимальный (между N/NP генами) или 5'-дистальный конец (после L-генов) генома.

Лучше всего встраивать чужеродный ген перед геном N/NP, между генами NP-P, P-M, M-G/F, G/F-HN, HN-L и после гена L.

Наиболее простым путем встраивания чужеродного гена является использование уже существующей в одном из этих участков последовательности распознавания ферментом рестрикции (RE) путем разрезания ее ферментом и встраивания подходящей экспрессионной кассеты. Так как в нужном месте не всегда расположены природные последовательности распознавания ферментами рестрикции, то распознаваиваемые рестриктазами последовательности можно встроить в геном обычно используемыми способами, такими как сайт-направленный или ПЦР-мутагенез. Примеры подходящих участков IGR для встраивания чужеродного гена представлены в таблице 3.

Состав транскрипционной кассеты для встраивания зависит от участка встраивания. Например, в случае, когда транскрипционная кассета встраивается в IGR, она может содержать следующие элементы: 3'-сайт распознавания рестриктазой-GS-некодирующую область-открытую рамку считывания (чужеродного гена)-некодирующую область-GE-5'-сайт распознавания рестриктазы.

В альтернативном случае, когда транскрипционную кассету встраивают в 5'-некодирующую область природного гена MV-вируса, она может состоять из: 3'-сайта распознавания рестриктазой-GE-IGR-GS-некодирующей области-открытой рамки считывания (чужеродного гена)-некодирующей области-5'-сайта распознавания рестриктазы.

Аналогичным образом, когда транскрипционную кассету встраивают в 3'-некодирующую область природного гена MV-вируса, она может состоять из: 3'-сайта распознавания рестриктазой-некодирующей области-открытой рамки считывания (чужеродного гена)-некодирующей области-GE-IRG-GS-5'-сайта распознавания рестриктазы.

Получение таких транскрипционных кассет и встраивание их в геном MV-вируса предусматривает использование только рутинных биологических методик, примеры которых приведены в литературных ссылках, перечисленных в таблице 2 и в примерах настоящего описания. В частности, для этих целей можно использовать сайт-направленный и ПЦР-мутагенез (Peeters et al., 1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F.M. Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 edition, pages 8.5.1.-8.5.9; Kunkel et al., Methods in Enzymology Vol.154, 376-382, 1987).

Более того, рекомбинантный MV-вирусный вектор по настоящему изобретению можно получить с помощью общепризнанной методики «обратной генетики», которая далает возможным проводить генетические модификации несегментированных (-)РНК вирусов отряда Mononegavirales (например, обзор дан в статьях Conzelmann, K.K., Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004; и Walpita et al., FEMS Microbiol. Letters 244, 9-18, 2005).

В соответствии с этой методикой проводят трансфекцию соответствующих клеток вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую полноразмерный геном, или предпочтительно, антигеном (положительную смысловую цепь) MV-вируса, вместе с одним или несколькими векторами, включающими молекулы кДНК, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют необходимые вспомогательные белки, при условиях, способность к осуществлению транскрипции и совместной экспрессии (анти)генома MV-вируса и вспомогательных белков и продукцию рекомбинантного MV-вектора. В этой методике указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полноразмерный (анти)геном MV-вируса содержит дополнительную транскрипционную единицу, описанную выше.

Под вектором понимают репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому можно присоединить другой сегмент ДНК для осуществления репликации присоединенного ДНК-сегмента и его транскрипцию и/или экспрессию в клетке, трансфецированной этим вектором.

Предпочтительным вектором транскрипции полноразмерного генома является плазмида, содержащая последовательность кДНК, кодирующую (анти)геном MV-вируса, фланкированную промотором полимеразы фага Т7 на своем 5'-конце и рибозимной последовательностью (гепатита дельта) на своем 3'-конце, хотя можно использовать промоторы РНК-полимеразы фагов Т3 и SP6.

Для внутриклеточной экспрессии соответствующих вспомогательных белков предпочтительно использовать плазмиды, содержащие кодирующие эти белки кДНК-последовательности под контролем соответствующих последовательностей контроля экспрессии, например, под контролем промотора полимеразы фага Т7.

В особенно предпочтительном способе получения рекомбинантного MV-вирусного вектора по настоящему изобретению используют экспрессионные плазмиды, кодирующие белки N (или NP), P и L MV-вируса.

Количество и соотношение трансфецируемых вспомогательных плазмид, используемых этой методике обратной генетики, находятся в широком диапазоне. Соотношение для вспомогательных плазмид N:P:L может изменяться от 20:10:1 до 1:1:2, а дающие эффективную трансформацию протоколы известны для каждого вируса.

В трансфецированной клетке синтезируется точная копия геномной РНК посредством совместного действия промотора РНК-полимеразы фага Т7 и рибозимной последовательности, а затем эта РНК пакуется и реплицируется с помощью вспомогательных вирусных белков, экспрессируемых с параллельно трансфецированных экспрессионных плазмид.

Предпочтительно, чтобы экспрессия полимеразы фага Т7 обеспечивалась с помощью рекомбинантного вируса осповакцины, инфицирующего трансфецированные клетки, в частности, вируса осповакцины vTF7-3, хотя для экспрессии полимеразы фага Т7 можно использовать и другие векторы на основе рекомбинантных вирусов оспы, такие как вирус оспы птиц, например, fpEFLT7pol, или другие вирусные векторы.

Восстановленный виру