Способ введения молекулы пнк, конъюгированной с положительно заряженным пептидом, в цитозоль и/или ядро фотохимической интернализацией(pci)

Способ введения молекулы пнк, конъюгированной с положительно заряженным пептидом, в цитозоль и/или ядро фотохимической интернализацией(pci)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу введения молекул пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), конъюгированных с положительно заряженными пептидами, в клетки, предпочтительно в цитозоль и/или ядро клеток, с использованием фотосенсибилизирующего агента и облучения клеток светом длиной волны, эффективной для активации фотосенсибилизирующего агента, и к использованию данного способа для оценки или изменения активности гена, например, антисмысловые или антигенные технологии, и для таких последующих применений, как в высокопроизводительной системе скрининга влияния продуктов понижающей регуляции генов.

ПНК представляют собой синтетические аналоги ДНК, в которых нормальная фосфодиэфирная связь, находящаяся в основной цепи ДНК, заменена на связь 2-аминоэтил-глицин. Нуклеотидные основания связаны с незаряженными повторяющимися единицами основной цепи посредством метилкарбонильных линкеров.

В результате такого связывания ПНК незаряжены. Они также химически стабильны и устойчивы к гидролитическому расщеплению и связываются с комплементарными цепями нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) с более высокой аффинностью, чем природные нуклеиновые кислоты.

Хотя гибридизация ПНК к комплементарным ДНК и РНК сопровождается образованием водородной связи по Уотсону-Крику, можно получить как параллельные, так и антипараллельные двойные спирали. Кроме того, их гибридные комплексы проявляют превосходную термостабильность и показывают уникальные свойства ионной силы. Ввиду данных преимуществ и того факта, что ПНК устойчивы к действию нуклеаз и протеаз, ПНК использовали in vitro в антисмысловых (препятствующих трансляции мРНК) или антигенных (препятствующих репликации или транскрипции гена) применениях. Двойные спирали ПНК-РНК не являются субстратами для РНазы H и поэтому могут вызывать антисмысловые эффекты, основанные на стерическом блокировании либо трансляции РНК, либо процессинга. Тройные спирали являются результатом связывания ПНК и ДНК, которые могут препятствовать репликации или транскрипции, вызывая антигенные эффекты. Не наблюдали никаких признаков какой-либо общей токсичности ПНК.

Таким образом, связываясь молекулами-мишенями нуклеиновых кислот, ПНК обладают существенным влиянием на процессы репликации, транскрипции и трансляции. ПНК, используемая в антигенных или антисмысловых методиках, как показали, препятствует активностям ДНК- и РНК-полимераз, обратной транскриптазы, теломеразы и рибосомы.

Для таких воздействий, которые будут успешно опосредованы, необходимо, чтобы молекулы ПНК проникли в клетки и, для большинства методик, в ядро, которое содержит некоторые РНК и все ДНК, кроме митохондриальной ДНК. Клеточный и ядерный захват, кроме того, очень медленен и самопроизвольно не происходит. Улучшение клеточного и ядерного захвата ПНК поэтому представляет собой основную проблему, которую необходимо решить прежде, чем может появиться любая реальная перспектива развития ее в качестве терапевтического лекарственного средства или лечения или для ее широкого применения.

Один подход для доставки ПНК в клетку заключается в использовании микроинъекции (рассмотренный у Ray and Norden, (2000), FASEB J.14, 1041-1060). Микроинъекция, кроме того, является трудоемкой и требующей больших затрат времени. Кроме того, инъекция должна быть индивидуально проведена в каждую клетку, и это, следовательно, больше всего подходит для небольшого числа клеток и не подходит для множества методик in vivo. Повреждение клеток также является проблемой.

Доставку также осуществляли электропорацией (Shammas et al., (1999), Oncogene 18, 6191-6200), которая также обладает недостатками, например, она не подходит для использования in vivo.

Также проверяли такие способы, разрушающие мембраны, как временная проницаемость с использованием стрептолизина О (Faruqi et al. (1997), P.N.A.S. USA 95, 1398-1403), проницаемость мембраны клетки при помощи лизолектина (Boffa et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 13228-13233) или такие детергенты, как Tween (Norton et al. (1996), Nat. Biotech 14, 625-620). Данные способы также не подходят для использования in vivo и могут вызвать повреждение клеток.

Даже если можно с усилием внедрить молекулы ПНК в клетку, ядерный захват, возможно, не произойдет. ПНК с усилием внедряли для поглощения клетками при высоких концентрациях in vitro, однако для осуществления этого была необходима очень высокая концентрация (от 10 до 20 мкМ) (Folini et al. (2003), Cancer Research 63, 3490-3494). Может поэтому было замечено, что необходимы улучшенные способы введения ПНК в клетки.

Клеточная доставка ПНК in vitro, как также показали, происходит при введении с катионным липидом в виде комплекса. В данной определенной методике молекулы ПНК, связанные с функциональным пептидом, были гибридизированы с перекрывающимися олигонуклеотидами, и комплекс смешивали с катионным липидом. Тогда катионный комплекс липид-ДНК-ПНК интернализировался, неся ПНК в качестве пассивного груза (Hamilton et al. (1999), Chem. Biol. 6, 343-351).

В ПНК отсутствуют полианионные заряды, необходимые для конденсации и комплексообразования с катионными липосомами посредством электростатических взаимодействий. Гибриды ПНК-ДНК, кроме того, обладают распределенным отрицательным зарядом, который обеспечивается ДНК. Конденсированные частицы могут образоваться при взаимодействии гибридов ПНК-ДНК с катионными липидами, и такие липоплексы быстро встраиваются в клетки млекопитающих в культуре (Borgatti et al. (2003), Oncol. Res. 13(5), 279-287; Borgatti et al. (2002), Biochem. Pharmacol. 64(4), 609-616; Nastruzzi et al. (2000), J. Control Release 68(2), 237-249). ПНК можно также переносить в клетки посредством ковалентного связывания с липидами (Muratovska et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(9), 1852-1863; Ljungstrom et al. (1999), Bioconjug. Chem. 10(6), 965-972; Filipovska et al. (2004), FEBS Lett. 556 (1-3), 180-186).

Предпринимались также попытки получить конструкции пептид-ПНК, которые могут поглощаться клетками более эффективно. Branden и Smith (2002, Methods in Enzymology 346, 106-124) использовали так называемую систему Bioplex, при помощи которой ПНК использовали для связывания функционального пептида с ДНК для того, чтобы увеличить доставку ДНК. Можно также добавлять полиэтиленимин (PEI), чтобы улучшить конденсацию нуклеиновой кислоты.

Такая система предназначена для доставки нуклеиновой кислоты в клетку, и она использует преимущество ПНК в качестве средства для связывания ДНК, которую необходимо доставить к пептидам, которые разработаны для улучшения доставки ДНК.

Определенные пептиды, как известно, опосредуют доставку молекул через клеточную мембрану. Также пытались осуществить связывание ПНК с такими клеточными пептидами-транспортерами или проникающими внутрь клетки пептидами, чтобы попытаться улучшить способность ПНК проникать в клетку. Было разработано множество различных пептидов-транспортеров с целью транспортировки ПНК в клетку.

ПНК, разработанную в качестве средства анти-теломеразной активности, конъюгировали с пептидом для интернализации ВИЧ-tat (SEQ ID NO: 1 RKKRRQRRR) и с проникающим внутрь клетки пептидом Antennapedia (SEQ ID NO: 2 RQIKIWFQNRRMKWKK), и она, как было показано, обладала небольшим эффектом в качестве антисмысловой молекулы, уменьшающей теломеразную активность. Данные эксперименты, кроме того, показали только небольшое уменьшение теломеразной активности; конъюгированная с tat ПНК уменьшала теломеразную активность только до 73% от контрольного уровня через 48 часов, и конъюгированная с Antennapedia ПНК осуществляла 50% ингибирование только при очень высоких концентрациях >30 мкМ (Folini et al., 2003, см. выше).

Также были описаны пептиды, которые способны опосредовать транспорт ПНК в ядро. Для только что синтезируемых ядерных белков, как показали, необходимо наличие определенной аминокислотной последовательности для того, чтобы достичь ядра и пройти через ядерную мембрану. Такие сигналы ядерной локализации, в тех случаях, когда присутствуют в белках, не присутствующих эндогенно в ядре, могут также направлять такие белки в ядро.

ПНК также конъюгировали с сигналом ядерной локализации (NLS) (SEQ ID NO: 3 PKKKRKV) в попытке направить ПНК в ядро клетки. Такой NLS, как было показано, опосредует перенос большого T-антигена SV40 через ядерную мембрану. Когда вводили 10 мкМ ПНК-NLS в клетки, его присутствие в ядре было показано через 24 часа. Такой эффект, как было показано, не зависит от последовательности ПНК, но сильно зависит от последовательности NLS; рандомизированная последовательность NLS (SEQ ID NO: 4 KKVKPKR), конъюгированная с ПНК, демонстрировала только минимальные количества ПНК в ядре (Cutrona et al., (2000), Nature Biotechnology 18, 300-303). Данные результаты сравнивали в функциональном исследовании, где было показано, что ПНК-NLS (дикий тип) (где ПНК представляла собой антиген к myc) ингибировала рост клеток, тогда как ПНК, конъюгированная с рандомизированной последовательностью NLS, оказывала воздействия, заметно более подобные воздействиям контрольной ПНК.

Branden et al. (1999, Nature Biotechnology 17, 784-787) сходным образом показали, что хотя конъюгация ПНК с пептидами могла увеличивать ядерный транспорт ПНК зависимым от последовательности NLS образом, никакой ядерной локализации не наблюдали при инверсии последовательности NLS.

Дополнительные исследования также наводили на мысль, что для получения ПНК, которая будет успешно транспортироваться в ядро, необходимо конъюгировать молекулу ПНК как с клеточным мембранным пептидом-транспортером, так и с NLS (Braun et al. (2002), J. MoI. Biol. 318, 237-243). Клеточный мембранный пептид-транспортер, как полагают, импортирует ПНК, и NLS, как полагают, затем далее передает ПНК в ядро. В таких экспериментах NLS, как показали, существенен для ядерного транспорта, поскольку конструкции, содержащие проникающий внутрь клетки пептид с одной только пептидной последовательностью лизин-лизин, оставались в цитозоле.

Интерпретация упомянутых выше результатов осложняется тем фактом, что Richard et al. (J. Biol. Chem., (2003), 278(1), 585-590) продемонстрировали, что фиксация клеток, даже при мягких условиях фиксации, может вызывать артефакты в таких экспериментах, причем ядерное окрашивание замечали при отсутствии ПНК в ядре даже при мягких контролируемых условиях.

Таким образом, хотя показано, что при определенных условиях ПНК или ПНК, конъюгированная с проникающими внутрь клетки пептидами, может войти в клетку, или, как недавно показано, в эндосомы (Richard et al., 2003, выше), в большинстве случаев для биологического эффекта, опосредуемого ПНК, необходимо переместить ПНК в ядро.

Можно заметить, что остается необходимость в таком надежном и воспроизводимом способе введения молекул ПНК, что осуществляется захват в клетку, например цитозоль, предпочтительно в ядро, без необходимости использования высоких концентраций ПНК.

Авторы изобретения с удивлением обнаружили, что молекулы ПНК, которые конъюгированы с положительно заряженными пептидами, подвергаются эндоцитозу, и при высвобождении из эндосом с использованием методики фотохимической интернализации (PCI) данные молекулы транспортируются в ядро.

Таким образом, по первому аспекту изобретение обеспечивает способ введения молекулы ПНК в цитозоль, предпочтительно в ядро клетки, предусматривающий контактирование указанной клетки с молекулой ПНК и фотосенсибилизирующим агентом и облучение клеток светом длины волны, эффективной для активации фотосенсибилизирующего агента, в котором указанная молекула ПНК конъюгирована с положительно заряженным пептидом.

PCI представляет собой методику, которая использует фотосенсибилизирующий агент в комбинации со стадией облучения для активации такого агента и осуществляет интернализацию молекул, совместно вводимых в клетку. Такая методика позволяет молекулам, которые захватываются клеткой в такие органеллы, как эндосомы, высвобождаться из таких органелл в цитоплазму после облучения. Основной способ фотохимической интернализации (PCI) описан в WO 96/07432 и WO 00/54802, которые включены сюда в качестве ссылки. Как изложено выше, интернализуемая молекула (которая для использования по настоящему изобретению представляет собой конъюгат ПНК-пептид) и фотосенсибилизирующий агент приводятся в контакт с клеткой. Фотосенсибилизирующий агент и интернализуемая молекула захватываются клеточным мембраносвязанным субкомпартментом внутри клетки. При воздействии на клетку светом соответствующей длины волны активизируется фотосенсибилизирующий агент, который непосредственно или опосредованно вызывает образование токсичных продуктов, которые разрушают внутриклеточные мембраны компартментов. Это позволяет интернализуемой молекуле высвободиться в цитозоль.

Такие способы используют фотохимический эффект в качестве механизма для введения молекул, иным образом не проникающих через мембрану, в цитозоль клетки способом, который не приводит к общему разрушению клетки или гибели клетки, если методология соответственно приспособлена для того, чтобы избежать чрезмерного образования токсичных продуктов, например, уменьшением времени облучения или дозы фотосенсибилизатора.

Особенно удивительно то, что когда для высвобождения ПНК в клетку используется способ PCI, ни определенной проникающей внутрь клетки последовательности, ни последовательности NLS не требуется для входа ПНК в клетку и для ее последующего перемещения в ядро. Все, что необходимо, чтобы ПНК была связана с пептидом, который имеет, по меньшей мере, единичный суммарный положительный заряд.

Таким образом, не желая быть связанными с теорией, оказывается, что, при использовании PCI, наличие положительно заряженного пептида может способствовать захвату молекулы ПНК в клетку, в такие клеточные компартменты, как эндосомальные компартменты, и дополнительно, после высвобождения или интернализации молекулы ПНК в цитозоль, заряженный пептид затем дополнительно опосредует направленное перемещение молекулы ПНК в ядро. Как следствие этого, необходима только минимальная модификация молекулы ПНК для направленного перемещения ее к необходимому месту локализации, и не требуется конъюгации длинных аминокислотных последовательностей или множественных аминокислотных последовательностей с молекулой ПНК.

Также удивительно, что только один пептид необходим для выполнения обеих из этих функций, то есть осуществление направленного захвата молекулы ПНК в клетку, и также облегчение переноса в ядро, как только молекула ПНК-пептид высвобождается или интернализуется в цитозоль.

Сигналы ядерной локализации были изучены довольно подробно, и было показано, что определенные аминокислотные консенсусные последовательности необходимы для того, чтобы осуществлялся эффективный направленный ядерный перенос. В частности, метаболический путь импортина идентифицировали в качестве способа, при помощи которого молекулы могут проходить в ядро. Такие "классические" NLS с высоким содержанием аргинина/лизина, как последовательность большого антигена SV40T, взаимодействует с белками-импортинами α+β. Комплекс перемещается через центральный канал комплекса ядерной поры и диссоциирует в ядре. Стадии ассоциации и диссоциации являются энергозависимыми механизмами (рассмотренными у Cartier et al. (2002), Gene Therapy 9, 157-167). Существуют, как полагают, другие метаболические пути для ядерного импорта, хотя они не так хорошо охарактеризованы.

Поэтому удивительно, что при использовании способа PCI по изобретению не требуется не только классической последовательности NLS, но и более того, любая последовательность с суммарным положительным зарядом один или более способна опосредовать ядерную локализацию. Это демонстрируется тем фактом, что последовательность SEQ ID NO: 5 GHHHHHG, функционирующая также как SEQ ID NO: 3 PKKKRKV, и дополнительно, что трипептид только с единичным положительным зарядом (SEQ ID NO: 6 AKL) обладали способностью направлять ПНК сначала в эндосому и впоследствии в ядро (смотрите примеры).

Далее, удивительное наблюдение состоит в том, что последовательности, которые были первоначально идентифицированы по их способности направлять белки в такие клеточные органеллы, как пероксисомы и митохондрии, при конъюгации с молекулами ПНК, также способны направлять молекулы ПНК сначала в эндосому и впоследствии в ядро (смотрите примеры).

Точная роль PCI в способе по изобретению не известна, но она, определенно, является основной в осуществлении способа, поскольку без PCI молекулы ПНК, несущие положительно заряженный пептид, не проникают в цитозоль или ядро в какой-либо существенной степени.

Эффект также, по-видимому, не зависит от общей длины конъюгируемого пептида, причем положительно заряженные пептиды длиной 3 аминокислоты одинаково функционируют так же, как и пептиды длиной 29 аминокислот. Эффект также не зависит от соотношения заряда к длине положительно заряженного пептида и конкретных заряженных аминокислот, которые включены в состав последовательности.

Используемый здесь термин «ПНК» относится к молекуле пептидной нуклеиновой кислоты, которая действует в качестве аналога ДНК и основана на псевдопептидном скелете, к которому присоединены нуклеотидные основания. ПНК может находиться в свободной линейной форме или может быть в виде двойной спирали или самозамыкающемся виде, например, bis-ПНК.

Также рассматриваются производные стандартной формы ПНК, например, в которых один или несколько псевдопептидных мономеров, составляющих полимер, можно модифицировать или получить их производное, например, чтобы получить измененные свойства, например, используя лизин или другие аминокислотные аналоги. Точно так же, одно или несколько из используемых оснований можно модифицировать, если необходимо, например, используя варианты, не встречающиеся в природе. Таким образом ПНК включает производные стандартной формы, при условии, что такие производные сохраняют соответствующие функциональные свойства, то есть способны к образованию зависимого от последовательности комплекса с ДНК и/или РНК. Другими словами, производное ПНК соответствует в отношении заряда и структуры, учитывая комплементарность, последовательности ДНК или РНК.

Молекула ПНК может представлять собой любую последовательность или составлять любую длину. Предпочтительно молекула ПНК содержит в длину менее 25, например менее 20, оснований. Предпочтительно молекула ПНК содержит в длину более 6 оснований. Например, можно использовать молекулы от 6 до 20 оснований. Длина олигомера ПНК из 12-17 единиц оптимальна. Длина последовательности, прежде всего, определяется необходимой спецификой используемого способа. Методики ДНК, для которых необходимо наличие более 25 оснований, можно обычно выполнять с гораздо более короткими образцами ПНК. Длинные олигомеры ПНК, в зависимости от последовательности, склонны к агрегации и их трудно очистить и охарактеризовать. Кроме того, чем короче последовательность, тем более она специфична. Следовательно, влияние ошибки больше, чем для короткой последовательности. Кроме того, олигомеры ПНК в 20 единиц использовали без какой-либо проблемы, связанной с агрегацией.

Такие молекулы, их химические свойства и способы синтеза известны в данной области (Ray and Norden, 2000, выше), и их можно получить любыми подходящими способами.

Молекула ПНК может представлять собой антисмысловую молекулу ПНК или молекулу ПНК, комплементарную гену (антигенная молекула), которая может образовывать характерную тройную структуру. Молекула ПНК также может представлять собой зонд, то есть ее можно связывать с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты, и она соответственно может нести метку.

Способ по изобретению осуществляет перенос конъюгата ПНК-пептид в цитозоль, предпочтительно в ядро. Кроме того, в полной мере будет понятно, что захват всех до одной молекул, контактирующих с клеткой, не достижим. Существенный и улучшенный захват относительно предшествующих уровней, при которых не используется никакой PCI, кроме того, достижим. Предпочтительно, способы по изобретению позволяют осуществлять захват молекул ПНК на таком достаточном уровне, что их влияние на репликацию, транскрипцию или трансляцию очевидно по экспрессированным продуктам таких клеток. Соответствующую концентрацию конъюгатов ПНК-пептид, которые будут контактировать с клеткой, можно подбирать, чтобы достичь этой цели, например, достичь снижения экспрессии гена-мишени более чем на 10%, например, более чем на 20, 30, 40 или 50% снижения после инкубации с клетками в течение, например, 24, 48, 72 или 96 часов, например, от 24 до 48 часов (смотрите, например, фиг.9). Уровень снижения количества белка зависит от времени полужизни белка, то есть ранее существовавший белок будет удаляться в соответствии с его временем полужизни. Таким образом, снижение экспрессии более чем на 10, 20, 30, 40 или 50% осуществляется относительно экспрессии за тот же самый момент времени без ПНК так, что время полужизни принимается во внимание.

Термин «клетка» используется здесь для того, чтобы охватить все эукариотические клетки (включая клетки насекомых и грибковые клетки). Типичные примеры «клеток» таким образом включают все типы клеток животных млекопитающих и немлекопитающих, клетки растений, клетки насекомых, грибковые клетки и простейшие. Кроме того, предпочтительно клетки являются клетками млекопитающих, например кошек, собак, лошадей, ослов, овец, свиней, коз, коров, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, но наиболее предпочтительно людей.

Используемый здесь термин «контактирование» относится к приведению клеток и фотосенсибилизирующего агента и/или конъюгата ПНК-пептид в физический контакт друг с другом при условиях, подходящих для интернализации в клетки, например, предпочтительно при 37°C в подходящей питательной среде.

Фотосенсибилизирующий агент представляет собой агент, который активируется светом соответствующей длины волны и интенсивности, чтобы образовались активированные продукты. Обычно такой агент может представлять собой агент, который локализуется во внутриклеточных компартментах, особенно эндосомах или лизосомах. Ряд таких фотосенсибилизирующих агентов известен в данной области и описан в литературе, включающей WO 96/07432, который включен сюда в качестве ссылки. В этом отношении можно упоминуть ди- и тетрасульфонированный фталоцианин алюминия (например, AlPcS_2a), сульфонированные тетрафенилпорфины (TPPS_n), нильский голубой, хлориновые производные e₆, уропорфирин I, филоэритрин, гематопорфирин и метиленовый синий, которые, как было показано, локализуются в эндосомах и лизосомах клеток в культуре. Это происходит в большинстве случаев вследствие захвата фотосенсибилизатора путем эндоцитоза. Таким образом, фотосенсибилизирующий агент предпочтительно представляет собой агент, который захватывается во внутренние компартменты лизосом или эндосом. Дополнительно соответствующие фотосенсибилизаторы для использования по изобретению описаны в WO 03/020309, который также включен сюда в качестве ссылки, а именно, сульфонированные мезо-тетрафенилхлорины, предпочтительно TPCS_2a.

Кроме того, другие фотосенсибилизирующие агенты, которые локализуются в других внутриклеточных компартментах, например эндоплазматическом ретикулуме или аппарате Гольджи, также можно использовать. Также предположительно, что могут существовать механизмы, при действии которых воздействия фотохимической обработки приходятся на другие компоненты клетки (то есть компоненты, отличные от ограниченных мембраной компартментов). Таким образом, например, одна возможность может состоять в том, что фотохимическая обработка разрушает молекулы, важные для внутриклеточного транспорта или слияния везикул. Такие молекулы необязательно могут располагаться в ограниченных мембраной компартментах, но фотохимическое повреждение таких молекул может, кроме того, привести к фотохимической интернализации молекул-переносчиков, например, посредством механизма, при котором фотохимические воздействия на такие молекулы приводят к сниженному транспорту интернализуемой молекулы (то есть молекулы ПНК) в такие разрушающие пузырьки, как лизосомы, так, чтобы интернализуемая молекула могла высвобождаться в цитозоль до деградации. Примеры молекул, необязательно расположенных в ограниченных мембраной компартментах, представляют собой несколько такие молекул транспортной системы из микротрубочек, как динеин и компоненты динактина; и, например, rab5, rab7, фактор, чувствительный к N-этилмалеимиду (NSF), растворимый белок присоединения NSF (SNAP) и так далее.

Классы подходящих фотосенсибилизирующих агентов, которые можно упомянуть, таким образом, включают порфирины, фталоцианины, пурпурины, хлорины, нафталоцианины бензопорфиринов, катионные красители, тетрациклины и лизомотропные слабые основания или их производные (Berg et al., J. Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403-409). Другие подходящие фотосенсибилизирующие агенты включают тексафирины, феофорбиды, порфицены, бактериохлорины, кетохлорины, производные гематопорфирина и их производные, эндогенные фотосенсибилизаторы, индуцируемые 5-аминолевулиновой кислотой и их производные, димеры или другие конъюгаты фотосенсибилизаторов.

Предпочтительные фотосенсибилизирующие агенты включают TPPS₄, TPPS_2a, AlPcS_2a, TPCS_2a и другие амфифильные фотосенсибилизаторы. Другие подходящие фотосенсибилизирующие агенты включают соединение 5-аминолевулиновой кислоты или сложные эфиры 5-аминолевулиновой кислоты или ее фармацевтически приемлемые соли.

Термин «облучение» клетки для активации фотосенсибилизирующего агента относится к применению света непосредственно или опосредованно, как описано далее. Таким образом, клетки можно освещать при помощи источника света, например, непосредственно (например, единичные клетки in vitro) или косвенно, например, in vivo, когда клетки находятся под поверхностью кожи или находятся в виде слоя клеток, не все из которых освещаются непосредственно, то есть без экранирования других клеток.

Термин «пептид», как определено здесь, включает любую молекулу, содержащую любое количество аминокислот, то есть одну или несколько аминокислот. Предпочтительно, кроме того, пептид представляет собой полимер последовательных аминокислот.

Предпочтительно положительно заряженный пептид состоит из от 3 (или 4, 5 или 6) до 30 аминокислот в длину, более предпочтительно от 3 (или 4, 5 или 6) до 25, от 3 (или 4, 5 или 6) до 20 или от 3 (или 4, 5 или 6) до 15 аминокислот в длину. В наиболее предпочтительном осуществлении пептид состоит из менее 10 аминокислот в длину, например 3, 4, 5 или 6.

Пептиды можно получить любыми удобными способами, например непосредственным химическим синтезом или посредством рекомбинантных способов, посредством экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты соответствующей последовательности в клетке.

Положительно заряженная молекула способна к перемещению молекулы ПНК, с которой она конъюгирована, в клетку и затем в цитозоль и также, предпочтительно, в ядро.

Упоминаемая здесь фраза «положительно заряженный» обозначает, что общий, или суммарный, заряд пептида составляет +1 или более при физиологическом значении pH, то есть при pH 7,2. Аминокислоту считают +1, если преобладающий тип аминокислот при физиологическом значении pH положительно заряжен, в тех случаях, когда находится в составе пептида. Каждая такая аминокислота в пептиде вносит дополнительный положительный заряд при вычислении окончательного заряда пептида. Пептид может содержать один или несколько отрицательно заряженных аминокислотных остатов, а также нейтральные остатки, при условии, что суммарный заряд пептида (вычисленный сложением вместе заряда, вносимого каждой аминокислотой) является положительным. Молекула ПНК незаряжена и, таким образом, не вносит вклад в общий заряд молекулы. Кроме того, необходимо понимать, что такой заряд представляет собой заряд части пептида, которая является важной и которую оценивают при определении наличия положительно заряженного пептида.

Заряд пептида, следовательно, зависит от его аминокислотного состава. Некоторые аминокислоты заряжены при нормальном физиологическом значении pH. Положительно заряженные аминокислоты представляют собой лизин (K), аргинин (R) и гистидин (H) и, как полагают, составляют +1 по описанной выше шкале. Аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (E) несут отрицательный заряд при большинстве физиологических значениях pH и рассматриваются как -1 по упомянутой выше шкале. Другие встречающиеся в природе аминокислоты, как полагают, не несут никакого заряда. Может присутствовать любое количество положительно заряженных или отрицательно заряженных аминокислот, при условии, что общий заряд пептида представляет собой +1 или более.

Используемые в пептидах аминокислоты для применения по изобретению необязательно должны представлять собой встречающиеся в природе аминокислоты. Одну из большего количества аминокислот в пептиде можно заменить на не встречающуюся в природе, например, дериватизированную аминокислоту. Такие аминокислоты подобным образом оценивают на основании их вклада в заряд пептида. Таким образом, подобно встречающимся в природе аминокислотам, если преобладающий тип аминокислот положительно заряжен при физиологическом значении pH, то несущественно, происходит ли или нет такой заряд из дериватизированной группы (например, введенной аминогруппы) или группы, также присутствующей во встречающейся в природе аминокислоте, при условии, что общий заряд составляет +1 или более.

Пептид может присутствовать в качестве участка гибридной молекулы, например, связанной с такой небелковой молекулой, как органический полимер, который можно, например, использовать в качестве сшивающей группы. Пептид может также присоединяться к отдельному компоненту, который может быть белковым по природе, но который эффективно не зависит от пептида, например, незаряжен или находится в отдельной структурной конфигурации. В таких случаях пептид представлял бы собой экспонированный, предпочтительно периферийный участок, и определяли бы заряд такого участка в качестве соответственного пептида.

Положительно заряженный пептид можно конъюгировать либо с N-концом, либо с C-концом молекулы ПНК, и может присоединяться с или без такой сшивающей группы, как 8-амино-3,6-диоксаноктановая кислота, 2-аминоэтокси-2-этоксиуксусная кислота (AEEA) или дисульфидные линкеры. Предпочтительно, кроме того, пептид конъюгируют непосредственно ковалентным связыванием. Особенно предпочтительно, в конъюгате не присутствует никаких других компонентов, кроме ПНК и пептида.

Предыдущие исследования показали, что только классические сигналы ядерной локализации транспортируют конъюгированные молекулы в ядро. Однако, как упоминалось выше, как это ни удивительно, показано, что способность к ядерной локализации пептида зависит только от заряда, а не от последовательности, когда осуществляют способ интернализации, используя PCI. Пептиды с суммарным зарядом +5 показали самую высокую степень поглощения, и это, как обнаружили, не зависело от последовательности, обеспечивающей такой заряд. Заряд пептида составляет >1, предпочтительно от +1 до +10, например, от +2 до +8, такой как от +3 до +6, например, +4 или +5.

Предпочтительно, пептиды для присоединения к ПНК богаты остатками K, R и/или H. Особенно предпочтительно используют ряды последовательных заряженных остатков. Предпочтительно, другие остатки, используемые в пептиде, нейтральны. Таким образом, например, пептид может обладать или содержать последовательность: X_n-(Y)_m-X_o, в которой X представляет собой нейтральные остатки и Y представляет собой положительно заряженный остаток, который может быть одним и тем же или другим в каждом положении, в котором они появляются, и n, m и o представляют собой целые числа ≥1, например, в диапазоне от 1 до 10, и n и o предпочтительно представляют собой 1 или 2, и m предпочтительно представляет собой от 2 до 5. Особенно предпочтительно Y представляет собой один и тот же остаток в каждом положении и представляет собой K, R или H.

Особенно предпочтительные пептиды представляют собой SEQ ID NO: 7 MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL, SEQ ID NO: 6 AKL и SEQ ID NO: 5 GHHHHHG. SEQ ID NO: 7 MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL и SEQ ID NO: 6 AKL представляют собой последовательности для направленного переноса в митохондрии и пероксисомы соответственно, и все же они оказались способны к направленному переносу в ядро с использованием описанного здесь способа PCI. Такая неожиданная находка иллюстрирует зависимость от заряда, но не от последовательности пептидов, которые применимы по изобретению.

Положительно заряженный пептид предпочтительно не представляет собой такой NLS, как SEQ ID NO: 3 PKKKRKV или рандомизированный NLS SEQ ID NO: 4 KKVKPKR или обратный NLS SEQ ID NO: 8 VKRKKKP, или такой классический проникающий внутрь клетки пептид, как Tat ВИЧ SEQ ID NO:1 RKKRRQRRR или проникающий внутрь клетки пептид Antennapedia SEQ ID NO: 2 RQIKIWFQNRRMKWKK. Это можно оценить, например, определяя степень ядерного переноса или проникновения в клетку без PCI. Пептиды, способные к значительному ядерному переносу или проникновению в клетки, в таких обстоятельствах считали бы NLS или проникающими внутрь клетки пептидами. Пептид также предпочтительно не представляет собой полилизин. Дополнительно, ПНК или пептид могут содержать такие дополнительные модификации, как флуоресцентные метки на концах.

Конъюгаты ПНК-пептид, как описано здесь, составляют дополнительные аспекты изобретения.

Упоминаемый здесь термин «конъюгация» относится к связыванию вместе пептида и молекулы ПНК для образования единой структурной единицы при физиологических условиях. ПНК и пептид предпочтительно связаны ковалентной связью.

Молекулу ПНК и пептид можно синтезировать или очистить отдельно и затем объединить, например, используя такую молекулу-спейсер, как Fmoc-NC603H11-OH (Branden et al., 1999, см. выше), или их можно химически синтезировать в качестве единой молекулы, например, используя стратегию (Btoc). В данном способе мономеры ПНК синтезируются в олигомеры длиной 20 оснований, используя протоколы стандартного пептидного синтеза. Для мономеров ПНК используют защиту флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) N-концевой аминогруппы мономера и бензгидрилоксикарбонил (Bhoc) для защиты A, C и G экзоциклических аминогрупп. Группа Bhoc, связанная с XAL-меткой для синтеза, позволяет осуществить быстрое удаление защиты и отщепление олигомера ПНК от смолы. Типичные выходы связанного продукта составляют >95%. Синтез заканчивается отщеплением олигомера TFMSA от смолы. Олигомер очищают при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой (Viirre et al. (2003), J. Org. Chem. 68(4), 1630-1632; Neuner et al. (2002), Bioconjug. Chem. 13 (3), 676-678).

Таким образом, положительно заряженный пептид, по-видимому, ответственен и за поглощение ПНК в клетку, и, как только она высвобождается из внутриклеточного компартмента, за ее ядерный захват.

Более одного типа молекулы ПНК, то есть молекулы ПНК различных последовательностей, можно вводить или вносить одновременно. Точно так же можно одновременно вводить или вносить молекулы ПНК, несущие более одного типа положительно заряженного пептида.

Необязательно, один или другой, или оба из фотосенсибилизирующего агента и конъюгированной молекулы ПНК, которые необходимо ввести в клетки, можно присоединить или связать, или конъюгировать с одной или несколькими молекулами носителя или с молекулами для направленного переноса, которые могут оказывать воздействие на обеспечение или увеличение захвата фотосенсибилизирующего агента или конъюгированной молекулы ПНК, или могут оказывать воздействие на направленный перенос или доставку данных объектов к определенному типу клеток, ткани или внутриклеточному компратменту. В случае конъюгированной молекулы ПНК направленный перенос в ядро можно достичь уже компонентом пептида, конъюгированного по изобретению.

Примеры систем носителей включают полилизин или другие поликатионы, сульфат декстрана, различные катионные липиды, липосомы, воссозданные LDL-частицы или стерически устойчивые липосомы. Такие системы носителя могут, в общем случае, улучшить фармакокинетику и увеличить клеточный захват конъюгированной молекулы ПНК и/или фотосенсибилизирующего агента и могут также направлять молекулу ПНК и/или фотосенсибилизирующий агент во внутриклеточные компартменты, которые особенно благоприятны для осуществления фотохимической интернализации, но они, в общем случае, не обладают способностью направлять молекулу ПНК и/или фотосенсибилизирующий агент к оп