Флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза b. pseudomallei и b. mallei

Флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза b. pseudomallei и b. mallei

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителей сапа и мелиоидоза В. pseudomallei и В. mallei в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) и возбудитель мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробные грамотрицательные неферментирующие бактерии, принадлежащие к роду Burkholderia. Мелиоидоз - эндемичное для Австралии и ряда стран Юго-Восточной Азии инфекционное заболевание людей и животных. Can - особо опасная зоонозная инфекция.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных патогенных буркхольдерий. И обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК-комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.

Использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует множество флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной работе использовались зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).

Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры на спейсерную область 16S-23S pPHK B.pseudomallei, В.mallei, фланкирующие 3'-концевую область 16S и 5'-концевую область 23S pPHK генов, предложенные S.D.Tyler с соавторами в 1995 г. [Oligonucleotide primers designed to differentiate pathogenic pseudomonads on the basis of the sequencing of genes coding for 16S-23S rRNA internal transcribed spacers. SD Tyler, CA Strathdee, KR Rozee, and WM Johnson. Clin. Diagn. Lab. Immunol., Jul 1995; 2: 448-453.]. Однако при последующем секвенировании спейсерной области 16S-23S pPHK и проведении ДНК-ДНК гибридизации была выявлена гетерогенность различных штаммов В. pseudomallei.

Целью настоящего изобретения является получение высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации В. pseudomallei и В. mallei методом полимеразной цепной реакции.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5'-GCT GCG GAT GCG AGC TAG TCT-3'-b23s7

5'-CCC CCA TCG CAT СТА ACG AC-3'-b23a8

Флуоресцентная детекция реализуется при помощи сконструированного олигонуклеотидного зонда с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка»:

5'-(FAM)- GCCTCGGTGAGTCGGCCCCTAAGGCGAGGC-(RTQ1)-3',

где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. RTQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.

Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и участка амплифицируемой ДНК

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные b23s7/b23a8, комплементарные фрагменту гена 23 S рРНК для идентификации В. pseudomallei и В. mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 266 п.н.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме В. pseudomallei 100, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×10⁹ м.к./мл до 1×10 м.к./мл. Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентной детекцией «по конечной точке» с праймерами b23s7/b23a8 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведении чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза, и составила 1×10³ м.к./мл. При использовании ПЦР в режиме реального времени чувствительность реакции удалось повысить до 1×10² м.к./мл.

Для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией оценена возможность использования сконструированных праймеров и зондов для анализа биологического материала (кровь, печень, селезенка, легкие и лимфатические узлы) и при экспериментальной инфекции. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех золотистых хомячков, зараженных культурой данных микроорганизмов, на всех сроках наблюдения.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и гибридизационного зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей сапа и мелиоидоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ) для конструирования праймеров, была выбрана последовательность гена 23S рРНК, размер которой составляет 2882 п.н. (GenBank NCBI, GeneID: 3088291). Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 266 п.н.

При подборе зондов руководствовались общими требованиями к олигонуклеотидным затравкам, используемым в ПЦР. При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров и зондов (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.

Праймеры и зонд были также проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза проводилась в двух форматах: с детекцией результатов ПЦР «по конечной точке» и в режиме реального времени.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту олигонуклеотидные зонды, меченые флуорофором FAM и гасителем флуоресценции (RTQ1), а также праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Таg-полимераза. Зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. В ПЦР с детекцией «по конечной точке» использовали 5 мкл образца с детекцией в режиме реального времени 10 мкл. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.

Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) и на приборах «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) и «SmartCycler» (Cepheid, США) в режиме реального времени в микроцентрифужных пробирках (0,2 мл) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».

Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью детектора флуоресценции «Gene» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) «по конечной точке» и в режиме реального времени - «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) и «SmartCycler» («Cepheid», США). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. В режиме реального времени результаты анализировали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.

Параллельно проводили анализ продуктов ПЦР методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской фрагментов ДНК этидиум бромидом и визуализацией в УФ-свете. Результаты оценивали по наличию или отсутствию в геле после электрофореза фрагментов ДНК необходимого размера.

Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В. mallei 10230 или В. pseudomallei 100 в концентрации 1×10⁵ м.к./мл).

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами и зондом оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaCl в концентрации, соответствующей 1×10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П), и раститрованых до необходимых разведении (от 1×10⁹ до 1×10 м.к./мл). Из разведения 1×10³ м.к./мл делали контрольный высев по 0,1 мл каждой пробы на чашки Петри с агаром BHI для определения количества KOE. Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.

Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 30 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляют с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г). Постановку реакции ПНР осуществляют как описано в примере 2. При тестировании коллекции культур В. mallei и В. pseudomallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза с чувствительностью 1×10²-1×10³ м.к./мл. С другими видами близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.

Таким образом, разработанные праймеры и зонд могут быть использованы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителей сапа и мелиоидоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Олигонуклеотидный зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающий флуоресцентную детекцию при идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза B.pseudomallei и В.mallei методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами bfl-ls/bfl-2a, комплементарными фрагменту гена fliC (флагеллярный ген) В. pseudomallei и В.mallei:5'-(FAM)-CGCTGTCGACTTCGGCAACCAGCG-(RTQ1)-3',где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм, RTQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.