Гемостимулирующее средство

Гемостимулирующее средство

Реферат

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости анемических состояний и их влияние на продолжительность и качество жизни пациентов [1-3], является основанием широкого применения специфических гемостимулирующих средств в медицинской практике.

Известно большое количество гемостимулирующих средств [1-3].

Наиболее близкими по природе происхождения и техническому результату к предлагаемому средству являются препараты рекомбинантного эритропоэтина [2, 3].

Недостатками данных средств являются побочные эффекты и осложнения [4-8], связанные с иммуногенностью эритропоэтина, представляющего собой вещество белковой природы, и единственно возможным путем их назначения - парентеральным введением. В частности, могут развиваться аллергические реакции различной интенсивности, в том числе сопровождаемые аплазией костного мозга. В связи с этим существует необходимость создания безопасных гемостимулирующих средств.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание гемостимулирующего средства, не обладающего иммуногенностью и эффективного как при парентеральном, так и при пероральном введении.

Поставленная задача достигается иммобилизацией рекомбинантного эритропоэтина на носителях низкой молекулярной массы с помощью ионизирующего излучения. В качестве носителя используются биологически индифферентные вещества - водорастворимые полимеры с молекулярной массой 400-4000 Да.

Наиболее предпочтительным способом иммобилизации является воздействие на полимерный носитель и биологически активное соединение направленным потоком ускоренных электронов с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.

В качестве водорастворимого полимера используют полиэтиленгликоль, гидроксиэтилкрахмал, поливинилпирролидон и др. с молекулярной массой от 400 до 4000 Да.

Новым в предлагаемом изобретении является создание гемостимулирующего средства, представляющего собой рекомбинантный эритропоэтин, иммобилизированный с помощью ионизирующего излучения, не обладающего иммуногенностью и эффективного как при парентеральном, так и при пероральном введении.

Используемое нами оригинальное средство иммобилизированного с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе рекомбинантного эритропоэтина (имЭП) было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск).

В практической медицине для лечения анемических состояний, представляющих собой как самостоятельные заболевания, так и патологический синдром, встречающийся при различных нозологиях, достаточно часто используют препараты на основе эритропоэтина (ЭП) [2, 3]. При этом белковая природа указанного вещества предопределяет существование единственно возможного - парентерального пути его введения в организм и значительного риска развития побочных эффектов и осложнений [4-8], обусловленных иммуногенностью данного линейно-рестриктированного фактора роста эритроидных гемопоэтических клеток.

В то же время значительное снижение иммуногенности веществ наблюдается при энтеральном приеме лекарственных препаратов. Однако средства белкового происхождения в желудочно-кишечном тракте подвергаются расщеплению под влиянием протеолитических ферментов, что делает данный путь их введения в организм неэффективным.

Вместе с тем известна технология снижения токсичности белков в результате их конъюгации с низкомолекулярными носителями. Известен препарат «Мирцера» (Хофман ля Роше, Швейцария), обладающий высокой специфической активностью на фоне отсутствия иммуногенности, представляющий собой конъюгат рекомбинантного эритропоэтина и полиэтиленгликоля (эпоэтин бета-метоксиполиэтиленгликоль), получаемый путем дорогостоящей технологии химического синтеза [9]. При этом данное средство является эффективным исключительно при парентеральном введении.

Сведений о возможности уменьшения иммуногенных свойств эритропоэтина, а также способа создания препарата с высокой гемостимулирующей активностью, эффективного, в том числе при приеме внутрь, за счет иммобилизации молекул фермента на носителях низкой молекулярной массы с использованием ионизирующего излучения, на сегодняшний день не существует. Более того, не существует данных о фармакологических преимуществах препаратов, полученных в результате иммобилизации биологически активных веществ с помощью ионизирующего излучения, перед соединениями, образующимися при конъюгировании тех же исходных субстанций, но химическим путем. То есть не известно существование качественных различий конечного продукта, связанных со способом его получения: технологии химического синтеза (с помощью которой получают препарат «Мирцера») и электронно-лучевой технологией иммобилизации (с помощью которой осуществляется получение предлагаемого средства). В то же время известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне [10, 11], в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться существенными изменениями стереохимической структуры исходных веществ и в конечном итоге приводить к модификации их свойств, характер которой зачастую является непредсказуемым.

Факт иммобилизации рекомбинантного эритропоэтина на носителе с помощью ионизирующего излучения с достижением нового технического результата: создание гемостимулирующего средства, не обладающего иммуногенностью и эффективного при парентеральном и пероральном приеме, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на мышах-самцах линии CBA/CaLac в количестве 158 штук, массой 18-20 г, 29 морских свинках обоего пола массой 200-250 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН.

Пример 1

10% водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 Да облучали потоком ускоренных электронов в дозе 5 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-6 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. В облученный раствор вносили рекомбинантный эритропоэтин («Рекормон», Хофман ля Роше, Швейцария) до конечной концентрации 5000 ME эритропоэтина в 1 мл 10% полиэтиленгликоля. Смесь перемешивали 10 минут и получали конечный иммобилизиованный препарат в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 97,1%.

Пример 2

5% водный раствор гидроксиэтил-крахмала с молекулярной массой 4000 Да облучали потоком ускоренных электронов в дозе 1 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-10 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. В облученный раствор вносили рекомбинантный эритропоэтин («Рекормон», Хофман ля Роше, Швейцария) до конечной концентрации 500 ME эритропоэтина в 1 мл 5% гидроксиэтил-крахмале. Смесь перемешивали 10 минут и получали конечный иммобилизиованный препарат в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 96,4%.

Пример 3.

Изучали специфическую активность имЭП.

Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [12].

Цитостатическую миелосупрессию вызывали введением карбоплатина (Teva, Израиль), который вводили однократно внутрибрюшинно в максимально переносимой дозе, составляющей на основании графического пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону 100 мг/кг.

На 5, 7, 9 и 12 сутки эксперимента с помощью автоматического гематологического анализатора Abacus (Diatron, Австрия) и стандартных методов определяли показатели периферической крови и костномозгового кроветворения [13]. Культуральными методами in vitro оценивали содержание эритроидных предшественников (КОЕ-Э) в костном мозге, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки [13]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Иммобилизированный эритропоэтин, разработанный ООО «Саентифик фьючер менеджмент» (г.Новосибирск) совместно с НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск), вводили двукратно (на 1 и 3 день после введения карбоплатина) подкожно либо перорально в дозе 5 МЕ/мышь. Иммобилизация молекул ЭП на низкомолекулярном полиэтиленгликоле осуществлялась с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза, с применением направленного потока ускоренных электронов. В качестве препаратов сравнения использовали «Мирцера» (Хофман ля Роше, Швейцария), который также применяли двукратно (на 1 и 3 день после введения карбоплатина) подкожно либо перорально в дозе 0,7 мкг/мышь, и «Рекормон» (Хофман ля Роше, Швейцария), который вводили подкожно в течение 5 дней в дозе 5 МЕ/мышь. Контрольные животные в эквивалентном объеме и по соответствующей схеме получали физиологический раствор.

Указанные схемы введения препаратов выбраны на основании результатов предварительных экспериментов, в которых данные дозы и режимы были определены как максимально эффективные на мышах.

Введение карбоплатина закономерно приводило к развитию анемии. В то же время снижение количества эритроцитов наблюдалось на фоне возрастания содержания ретикулоцитов в периферической крови. Описанные изменения явились закономерным отражением реакций кроветворной ткани. Имело место падение содержания морфологически идентифицируемых эритроидных клеток и КОЕ-Э в косном мозге на фоне повышения пролиферативной активности и скорости дифференцировки последних (табл.1).

Применение препаратов ЭП во всех случаях, за исключением перорального использования препарата «Мирцера», оказывало значительное влияние на формирование реакций системы крови. Наблюдалось увеличение количества циркулирующих ретикулоцитов, достигающее максимальных значений в группе мышей, получавших подкожно имЭП. Кроме того, на протяжении всего периода эксперимента отмечалось существенное возрастание содержания морфологически распознаваемых эритроидных клеток в костном мозге (табл.1). При этом парентеральное использование имЭП сопровождалось более значимыми изменениями, чем при подкожном введении «Мирцера» и «Рекормона». В случае перорального применения имЭП также регистрировалось значительное увеличение содержания эритроидных клеток в гемопоэтической ткани.

При проведении культуральных исследований было обнаружено, что описанные реакции явились закономерным отражением функционального состояния клеток-предшественников костного мозга. Отмечалось резкое возрастание содержания КОЕ-Э в гемопоэтической ткани на фоне повышения их пролиферативной активности. Кроме того, имело место значительное ускорение процессов созревания эритроидных прекурсоров. При этом наиболее выраженные изменения как и в предыдущих случаях регистрировались в группе животных, получавших подкожно имЭП.

В целом, результаты исследований свидетельствуют о наличии выраженных эритропоэстимулирующих свойств у имЭП при его применении не только парентерально, но и, в отличие от препарата «Мирцера», перорально. При этом процесс пегилирования эритропоэтина с помощью электронно-лучевого синтеза позволяет получать соединения с более выраженной специфической активностью, чем у конъюгата ЭП, полученного химическим путем.

Пример 4.

Средство получали путем иммобилизации рекомбинантного эритропоэтина на молекулах гидроксиэтил-крахмала с помощью: гамма излучения (имЭП-1) и ультрафиолетового излучения (имЭП-2). Препараты иммобилизированного ЭП (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) в дозе 5 МЕ/мышь/сут вводили двукратно (на 1 и 3 день после введения карбоплатина) перорально в дозе 5 МЕ/мышь. Карбоплатин (Teva, Израиль) вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг.

На 5, 9 и 12 сутки эксперимента с помощью автоматического гематологического анализатора Abacus (Diatron, Австрия) и стандартных методов определяли показатели периферической крови и костномозгового кроветворения [13].

Введение имЭП во всех случаях приводило к значительному ускорению кроветворной регенерации. Отмечалось значительно более раннее увеличение ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови, а также количества морфологически распознаваемых эритроидных клеток в костном мозге. При этом эффективность стимуляции процессов кроветворения в обоих случаях была приблизительно одинакова (табл.2).

Пример 5

В соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому (экспериментальному) изучению фармакологических веществ» [14] проводили исследование аллергизирующих (иммуногенных) свойств препарата ЭП, иммобилизированного на полиэтиленгликоле с помощью ионизирующей радиации (имЭП).

Препарат исследовался в дозах (определяемых по международным единицам активности эритропоэтина), которые были определены как оптимальные в отношении стимуляции гемопоэза и в 10 раз ее превышающие (содержание эритропоэтина 250 МЕ/кг и 2500 МЕ/кг соответственно).

Оценка аллергизирующих свойств препарата проводилась с использованием следующих тестов: реакции общей анафилаксии, реакции специфической агломерации лейкоцитов, при внутрикожном и конъюнктивальном тестировании на морских свинках, реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах [14].

Для сенсибилизации морских свинок препараты вводили: сначала 1 раз подкожно, затем в той же дозе 2 раза внутримышечно, через день, в область бедра. Анафилактогенные свойства препаратов эритропоэтина выявляли путем его внутрисердечного введения на 21-е сутки после последней сенсибилизирующей инъекции. Разрешающее тестирующее внутрисердечное введение препарата проводилось в дозе, равной суммарной сенсибилизирующей, т.е. 750 МЕ/кг. Контролем служили несенсибилизированные морские свинки, которым препарат вводили внутрисердечно.

Учет интенсивности анафилактической реакции проводили с использованием формулы:

,

где АИ - анафилактический индекс;

n - число животных, анафилактическая реакция которых заканчивалась смертельным исходом;

n₁ - число животных со значительными проявлениями анафилактической реакции;

n₂ - число животных со средними проявлениями реакции;

n₃ - число животных со слабыми проявлениями реакции;

N - общее число животных в группе.

Для оценки кожно-сенсибилизирующих свойств препарата через 20 дней после окончания сенсибилизирующих инъекций на боковой поверхности тела морских свинок выстригали шерсть и каждому животному внутрикожно вводили препарат имЭП, в дозе 250 МЕ/кг в 0,02 мл физиологического раствора (доза, не вызывающая визуальных изменений кожи у интактных морских свинок).

Реакцию кожи на введение препарата оценивали в баллах с учетом выраженности гиперемии и размеров гиперемированной области (средняя величина диаметра в миллиметрах). Были определены четыре степени гиперемии, которым соответствовали числовые индексы: сильная (+++) - 1,0; средняя (++) - 0,66; слабая (+) - 0,33; сомнительная (+/-) - 0,17. Умножение величины диаметра гиперемированной области на индекс соответствующей степени гиперемии позволило в едином показателе (баллы) выразить обе характеристики реакции.

На 20-й день после завершения цикла сенсибилизирующих инъекций проводилось конъюнктивальное тестирование. Тест заключался в закапывании в левый глаз каждого животного 0,02 мл физиологического раствора, содержащего 1 ME препарата, в правый глаз - физиологического раствора в том же объеме. Оценка состояния конъюнктивы глаза проводилась через 4 и 24 часа после воздействия.

С целью подтверждения результатов, полученных вышеперечисленными тестами, использовалась реакция аллергодиагностики in vitro РСАЛ (реакция специфической агломерации лейкоцитов). Рабочая доза препарата эритропоэтина для этой реакции составляла 0,5 МЕ/кг на 0,05 мл крови животного.

На мышах сенсибилизацию проводили с использованием полного адьюванта Фрейнда (ПАФ). Препараты ЭП вводили однократно подкожно в основание хвоста в 0,06 мл ПАФ, который был взят в соотношении 1:1 к объему раствора препарата. Доза препарата составляла 2500 МЕ/кг. Контрольным животным вводили ПАФ в том же объеме.

Через 5 суток после инъекции опытным и контрольным мышам в подушечку одной из задних лап вводили препарат ЭП в дозе 250 МЕ/кг в 0,04 мл физиологического раствора, в другую лапу - физиологический раствор. Через 24 часа после второй инъекции с помощью инженерного микрометра типа МК измеряли толщину обеих лап. Величину реакции определяли как разницу в толщине опытной и контрольной лап, в миллиметрах.

В ходе эксперимента было установлено, что реакция морских свинок на внутрикожное введение препарата имЭП по таким визуальным показателям, как покраснение или отек, не отличалась от соответствующих показателей у животных, которым вводили дистиллированную воду. Конъюнктивальный тест и реакция аллергодиагностики in vitro не выявили признаков аллергизирующего действия у имЭП. При тестирующем внутрисердечном введении имЭП изменений анафилактического индекса не наблюдалось (табл.3).

Изучение аллергизирующих (иммуногенных) свойств показало, что внутрикожные тестирующие инъекции имЭП не приводили к изменению величины реакции ГЗТ (табл.4).

Таким образом, препарат иммобилизированного с помощью ионизирующего излучения эритропоэтина не обладает иммуногенными свойствами.

Полученные результаты свидетельствуют, что средство, представляющее собой иммобилизированный на низкомолекулярном носителе с помощью ионизирующего излучения эритропоэтин, обладает выраженными гемостимулирующими эффектами и не имеет иммуногенных свойств. При этом особенности технологии получения данного средства приводят к возможности его эффективного использования, в отличие от аналогов, не только парентерально, но и перорально.

Источники информации

1. Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1. // The Lancet. - 1989. - Vol.15. - P.825-827.

2. Волкова M.A.. Ширин А.Д. Эритропоэтин в лечении анемии при онкологических заболеваниях // Гематол. и трансфузиол. - 1997. - Т.42. - №6. - С.33-36.

3. Коломоец Н.М., Бакшеев В.И. Эритропоэтин в клинической практике // Клиническая медицина. - 2007. - N 9. - С.30-37.

4. Bennett С., Luminari S., Nissenson А. е.a. Pure Red-Cell Aplasia and Epoetin Therapy. // N. Engl. J.Med. - 2004. - №351. P. - 1403-1407.

5. Clarke JB. Mechanisms of adverse drug reactions to biologies // Handb Exp Pharmacol. 2010; (196):453-74.

6. DiPaolo В., Pennetti A., Nugent L., Venkat K. Monitoring impurities in bio-pharmaceuticals produced by recombinant technology // Pharm. Sci. Technol. - 1999. - №2. - P.70-82.

7. Locatelli F., Del Vecchio L., Pozzoni P. Pure red-cell aplasia "epidemic"-mystery completely revealed? // Perit Dial Int. 2007 Jun; 27 Suppl 2:S303-7.

8. Prabhakar S.S., Muhlfelder T. Antibodies to recombinant human erythropoietin causing pure red cell aplasia. // Clin. Nephrol. - 1997. - №47. - P.331-335.

9. Macdougall IC. Novel erythropoiesis-stimulating agents: a new era in anemia management // Clin J. Am. Soc. Nephrol. 2008 Jan; 3(1):200-7.

10. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - №1. - С.61-69.

11. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биохетнологий // Российские нанотехнологии. - 2006. - №1-2. - С.256-264.

12. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

13. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.

14. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред Р.У.Хабриева. - 2 изд. - М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. - С.54-69.

Таблица 1
Показатели периферической крови и костного мозга мышей линии CBA/CaLac при введении дистиллированной воды (1), препарата «Мирцера» подкожно (2) и перорально (3), «Рекормона» подкожно (4) и иммобилизированного эритропоэтина подкожно (5) и per os (6) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (X±m)
Сроки исследования, сутки	Периферическая кровь	Костный мозг
	Ретикулоциты, ‰	Эритроциты, Т/л	Морфологически идентифицируемые эритроидные клетки, × 106/бедро	КОЕ-Э, на 105 неприлипающих миелокариоцитов	КОЕ-Э в S-фазе (пролиферативная активность), %	КлОЕ-Э/КОЕ-Э (интенсивность дифференцировки), усл.ед.
фон	3,88±0,30	10,20±0,27	1,27±0,03	10,21±1,7	34,33±3,6	0,88±0,09
5	1	7,33±0,42*	8,24±0,25*	0,21±0,04*	14,83±0,95*	45,33±1,48*	1,11±0,08
2	10,83±1,38*#	8,87±0,22*	0,49±0,03*#	27,67±1,71*#	64,70±3,54*#	1,55±0,08*#
3	4,00±0,52	8,36±0,24*	0,19±0,01*	16,00±1,53*	38,71±4,17	0,90±0,16
4	12,3±0,78*#	8,39±0,18*	0,56±0,02*#	25,3±1,7*#	63,7±2,7*#	2,4±0,24*#
5	15,50±0,96*#$	8,61±0,40*	0,59±0,03*#$	29,83±1,89*#	61,44±5,77*#	3,42±0,17*#$
6	10,7±0,7*#	8,69±0,44*	0,44±0,02*#	33,67±1,71*#$	65,73±4,39*#	2,12±0,30*#
7	1	7,83±0,31*	9,28±0,47	1,7±0,2*	20,00±1,00*	72,13±1,50*	1,31±0,09*
2	13,00±1,75*#	9,51±0,49	3,2±0,4*#	20,50±0,62*	76,72±1,37*	2,07±0,11#
3	7,83±0,65*	9,28±0,61	1,72±0,22*	21,83±1,83	63,24±3,92	1,48±0,18*
4	14,8±0,45*#	9,29±0,54	3,21±0,37*#	18,7±0,62*	57,8±7,6*	2,3±0,2*#
5	19,83±0,65*#$	9,22±0,44	3,4±0,3*#	27,13±1,73*$	83,78±4,06*	1,74±0,11*#
6	15,4±0,6*#	10,11±0,36	3,63±0,37*#	22,67±1,71*#	76,17±2,25	1,87±0,06*#
9	1	7,67±0,49*	7,30±0,26*	2,1±0,23*	17,17±2,43*	54,17±3,04*	1,24±0,09*
2	35,33±3,21*#	8,30±0,11*#	3,67±0,15*#	21,67±1,20*#	72,64±1,63*#	2,85±0,14*#
3	8,4±1,72*	7,51±0,39*	2,3±0,17*	15,17±2,09*	49,12±2,66*	1,23±0,07*
4	29,0±1,56*#	8,97±0,27*#	3,57±0,16*#	24,3±2,6*#	88,7±1,54*#	2,0±0,17*#
5	37,00±2,35*#	8,95±0,24*#$	4,2±0,1*#$	37,17±1,30*#$	86,18±1,66#$	1,91±0,03*#
6	32,1±2,5*#	8,03±0,21*#	3,78±0,09*#	22,33±0,61*#	74,67±3,94*#	2,26±0,23#

Продолжение таблицы 1
	1	7,33±0,42*	7,31±0,46*	1,67±0,18	10,50±1,12	98,37±4,21*	0,45±0,13*
12	2	30,50±1,69*#	9,51±0,61	4,77±0,16*#	15,33±1,48*#	88,58±1,11*	1,89±0,25#
	3	7,83±0,49*	7,87±0,64*	1,72±0,2	11,00±1,06	82,57±2,70*	0,39±0,11*
	4	24,81±2,6*#	10,1±1,19*#	4,2±0,31*#	14,7±1,5*#	89,71±3,4*	2,34±0,17*#
	5	31,50±0,96*#	10,25±0,39#$	4,56±0,18*#	15,00±0,82*#	85,97±5,46*	2,31±0,06#
	6	26,4±2,7*#	9,92±1,93#	4,5±0,2*#	14,33±0,71*#	89,44±8,37*	3,18±0,03#$
* - отмечена достоверность различий показателей с фоновыми значениями при р<0,05;
# - отмечена достоверность различий показателей с цитостатическим контролем при р<0,05;
$ - отмечена достоверность различий показателей между группами мышей, получавших препарат имЭП и «Мирцера» при р<0,05.

Таблица 2
Показатели периферической крови и костного мозга мышей линии CBA/CaLac при введении дистиллированной воды (1), иммобилизироваиного эритропоэтина-1 (2) и имЭП-2 (3) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии (X±m)
Сроки исследования (сутки)	Ретикулоциты в периферической крови, ‰	Эритроциты в периферической крови, Т/л	Эритроидные клетки в костном мозге, ×106/бедро
фон	3,88±0,30	10,20±0,27	1,27±0,12
5	контроль	8,04±0,43*	9,11±0,15*	0,27±0,03*
имЭП-1	14,8±0,57*#	9,23±0,17*	0,53±0,07*#
имЭП-2	15,3±0,44*#	9,27±0,2*	0,46±0,09*#
9	контроль	10,31±0,78*	7,65±0,28*	1,87±0,12*
имЭП-1	17,7±1,2*#	8,74±0,14*#	2,95±0,18*#
имЭП-2	15,6±0,98*#	8,63±0,2*#	2,86±0,07*#
12	контроль	10,8±0,56*	7,58±0,19*	1,97±0,2*
имЭП-1	26,4±1,37*#	9,61±0,23#	4,03±0,3*#
имЭП-2	27,8±2,01*#	9,58±0,13#	3,97±0,4*#
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05;
# - отмечена достоверность различий показателя с контрольной группой при р<0,05.

Таблица 3
Оценка анафилактогенных свойств имЭП в эксперименте на морских свинках (X±m)
Группа животных	Показатели
Реакция кожи, баллы	Конъюнктив. тест, баллы	Коэффициент РСАЛ	АИ
Контроль	0,76±0,02	0	1,65±0,1	0,39
имЭП	0,75±0,03	0	1,67±0,1	0,40
Таблица 4
Оценка сенсибилизирующих свойств препарата имЭП в эксперименте на мышах (Х±m)
Группа животных	Реакция ГЗТ, мм
4 часа	24 часа
Контроль	0,069±0,01	0,074±0,01
имЭП	0,070±0,02	0,075±0,01

Гемостимулирующее средство, представляющее собой иммобилизированный на полимере рекомбинантный эритропоэтин, отличающееся тем, что рекомбинантный эритропоэтин иммобилизирован с помощью электронно-лучевого воздействия путем его внесения в раствор низкомолекулярного водорастворимого полимера, предварительно подвергшегося воздействию ионизирующего излучения в дозе 1-5 Мрад, до конечной концентрации 500-5000 ME в 1 мл раствора, и эффективно не только при парентеральном, но и пероральном введении.