Способ прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита

Способ прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для диагностики вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

Проблема прогнозирования в медицине и в частности при инфекционных заболеваниях в первые дни после инфицирования ВКЭ является актуальной.

Особенности формирования и течения патологического процесса при клещевом энцефалите обусловлены как вирулентными свойствами возбудителя, так и состоянием иммунной системы организма. От адекватности ее функционирования зависят характер течения и исход заболевания. Важнейшую роль в дезрегуляции функционирования иммунной системы при развитии инфекционного процесса играют нарушения межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток, которые являются основными продуцентами цитокинов, регулирующих запуск, направление и реализацию противовирусного иммунного ответа (Ратникова Л.И., Тер-Багдасарян Л.В., Миронов И.Л. Современные представления о патогенезе клещевого энцефалита. // Эпидемиология и инфекц. болезни. - 2002. - №5. - С.41-46, Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа. // Иммунология. - 1999. - №1. - С.17-24). По современным представлениям, характер иммунного ответа, в том числе при вирусных инфекциях, во многом зависит от доминирующего участия Th1 и Th2-субпопуляций лимфоцитов, которые различаются по спектру продуцируемых ими цитокинов (Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета // Иммунология. - 2002. - №2. - С.77-79). Так, Th1-лимфоциты, продуцируя IL-2, IFN-γ и ряд других цитокинов, усиливают клеточный иммунный ответ, который играет существенную роль в регуляции противовирусного иммунитета (Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В. Ранние цитокиновые реакции при вирусных инфекциях // Цитокины и воспаление. - 2004. - №1. - С.3-6).

Формирование иммунного ответа по гуморальному типу, с которым связаны определенные механизмы хронизации инфекционного процесса (Жукова О.Б., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Вирусная персистенция: иммунологические и молекулярно-генетические аспекты патогенеза // Бюлл. Сибирской медицины. - 2003. - №4. - С.113-120), происходит при доминирующем влиянии Th2-цитокинов - IL-4, IL-6, IL-10. Дисбаланс цитокинового профиля, ориентированный на Th1 или Th2-тип иммунного ответа, оказывает важное влияние как на элиминацию вируса и выздоровление больного, так и на возможность развития персистентной вирусной инфекции. Проведенное нами изучение про- и противовоспалительных цитокинов при КЭ показало, что для прогнозирования исхода заболевания наиболее важным будет являться исследование в ранние сроки развития инфекции уровня продукции IFN-γ и соотношения IFN-γ/IL-4. До настоящего времени роль цитокинов у лиц после укуса клеща в первую волну вирусемии (2-4 день) не изучена и взаимоотношения между этими цитокинами не определены.

Известно использование лейкоцитарной массы для выделения вирусов при инаппаратных, острых и хронических формах флавирусных инфекций (патент РФ, МКИ5 C12N 7/00, 1836422 A3, от 23.04.91). При этом в пробу крови добавляют раствор гепарина, отстаивают ее в течение 45 мин при комнатной температуре, отбирают лейкоцитарную взвесь, осаждают ее с помощью центрифугирования и исследуют ее на наличие арбовирусных инфекций на модели клеточной культуры СПЭВ.

Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость диагностики арбовирусных инфекций, а также ее низкая достоверность.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу является способ определения количества цитокинов при антигенемии вируса клещевого энцефалита, у лиц после укуса клеща, включающий исследование уровня цитокинов IFN-γ и IL-4 в периферической крови (Крылова и др. Динамика цитокинов при антигенемии вируса клещевого энцефалита у лиц после укуса клеща. // Цитокины и восполение, 2008, т.7, №1, с 35-39) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с применением тест - системы ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск).

Недостатком данного технического решения является то, что данным способом возможно лишь изучать динамику продукции цитокинов, вырабатываемых на фоне антигенемии вируса КЭ у лиц после укуса клеща, но не определять прогноз тяжести и длительности антигенемии.

Задачей данного изобретения является определение тяжести и длительности антигенемии, путем оценки комплекса иммунологических показателей у инфицированного лица вначале инфицирования вирусом.

Задача изобретения решается тем, что в предлагаемом способе прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита, включающем исследование в периферической крови уровня цитокинов IFN-γ и IL-4, согласно изобретению до введения противоклещевого иммуноглобулина у инфицированных лиц определяют уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов и при уровне спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пг/мл, а индуцированной - выше 122,2 пг/мл и уровне спонтанной продукции IL-4 ниже 23,5, а индуцированной ниже 25,3 пг/мл прогнозируют быструю элиминацию антигена.

Способ осуществляют следующим образом.

Для определения значения пороговых величин продукции цитокинов IFN-γ и IL-4 предварительно было проведено исследование периферической крови у 108 человек в возрасте от 19 до 57 лет с жалобами на укус клеща, у которых на 2-4 сутки в крови был выявлен антиген вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Повторное обследование этих лиц через 1 месяц выявило, что у 78 пациентов антиген не обнаруживался (1-я группа - кратковременная антигенемия), у 30 пациентов антиген выявлялся через 1, 6 и более месяцев (2-я группа - длительная антигенемия).

Забор крови для определения концентрации цитокинов у инфицированных лиц проводили до введения противоклещевого иммуноглобулина. Все антигенположительные пациенты получили противоклещевой иммуноглобулин согласно СП 3.1.3.23-52-08 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита».

Периферическую кровь пациента забирали шприцем из локтевой вены в объеме 5 мл в стерильную пробирку, содержащую гепарин (25 ЕД/мл), и тщательно перемешивали. Затем 1 мл цельной гепаринизированной крови смешивали с 4 мл стерильной среды RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 0,3 мг/мл L-глутамина (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина, т.е. кровь разводили в 5 раз. Подготовленные таким образом образцы крови (по 1 мл) культивировали в круглодонных, стерильных пробирках в присутствии конканавалина А (КонА, Sigma, в конечной концентрации 10 мкг/мл), а также в отсутствие митогенной стимуляции. Культивирование проводили при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение 48 часов, после чего осторожно отбирали супернатанты. Содержание цитокинов IFN-γ и IL-4 в супернатантах оценивали с помощью иммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программных пакетов STATISTICA и EXCEL. Проверка нормальности распределения количественных признаков в выборке с помощью W-критерия Шапиро-Уилка, определение значимости различий между группами - t-критерий Стьюдента. Определялись параметры нормальных распределений, соответствующих выборкам: M₁ и М₂ - средние значения для 1-й и 2-й групп соответственно, а так же σ₁ и σ₂ - стандартные отклонения соответственно.

На основании проведенных исследований были определены пороговые величины (Кр) отдельно для каждого типа продукции цитокинов. Кр - это значение концентрации цитокина (пг/мл), при котором одинакова вероятность принадлежности продукции цитокина к одной из сравниваемых групп (с кратковременной и длительной антигенемией). Кр определялась как точка пересечения графиков нормальных распределений продукции цитокинов этих групп. На чертеже представлено определение пороговых величин Кр₁, Кр₂, Кр₃, Кр₄, построенных с использованием пакета «Statistica-6» (Вуколов Э.А. «Основы статистического анализа. Практикум по статистическим методам и исследованию операций с использованием пакетов STATISTICA и EXCEL». - М.: ФОРУМ: ИНФРА-М, 2004, - 464 с.). Результаты статистического анализа представлены в табл.1.

Табл.1
Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов клетками периферической крови лиц, инфицированных вирусом КЭ
Цитоки-ны	Тип продукции	Группы	М±σ, пкг/мл	р	Кр, пг/мл
IFN-γ	спонтанная	1	79,9±18,6	<0,01	Кр1=59,7
2	42,3±12,2
3	52,6±17,5
индуцированная	1	210,8±69,6	<0,01	Кр2=122,2
2	80,6±20,7
3	103,0±35,4
IL-4	спонтанная	1	17,3±4,2	0,016	Кр3=23,5
2	30,8±6,4
3	15,7±4,3
индуцированная	1	19,0±4,7	0,020	Кр4=25,3
2	32,3±6,7
3	17,4±4,4
Примечания:
1-я группа - пациенты с кратковременной антигенемией ВКЭ, 2-я группа - пациенты с длительной антигенемией ВКЭ, 3-я группа - условно здоровые люди;
р - уровень значимости различий между 1-й и 2-й группами (при р<0,05 - различия между группами достоверны).

Иллюстрации определения пороговой величины Кр для спонтанной продукции IFN-γ у лиц 1-й и 2-й групп представлены на чертеже.

Анализ полученных данных позволил разделить всех инфицированных пациентов на две группы: с кратковременной и длительной антигенемией. В 1-й группе (78 человек) при повторном обследовании (через 1 месяц) антиген ВКЭ не выявляли. Во 2-ю группу вошли 30 человек, у которых при повторных исследованиях через 1, 6 и более месяцев в крови продолжали выявлять антиген ВКЭ.

Предложенный способ прогнозирования длительности антигенемии ВКЭ основан на оценке комплекса пороговых величин уровней продукции IFN-γ и IL-4, выявляемых на 2-4 сутки после инфицирования. При уровнях продукции IFN-γ, превышающих Кр (для спонтанной продукции выше 59,7 пг/мл, индуцированной выше 122,2 пг/мл), и уровнях продукции IL-4 меньше Кр (для спонтанной продукции ниже 23,5 пг/мл, индуцированной - ниже 25,3 пг/мл) прогнозируют быструю элиминацию антигена. При уровнях продукции IFN-γ ниже Кр, а при выработке IL-4, превышающей Кр, прогнозируют длительный период элиминации антигена.

Таким образом, впервые предлагается способ прогнозирования периода антигенемии, который основан на оценке комплекса иммунологических показателей, выявленных в самом начале инфицирования вирусом КЭ, отражающих индивидуальный тип иммунного ответа пациента и показывающих уже после 2-4 дня инфекции дальнейший ход развития болезни. Впервые установлены уровни спонтанной и индуцированной продукции IFN-γ и IL-4, позволяющие оценить функциональный резерв иммунной системы конкретного лица, при которых можно прогнозировать длительность периода антигенемии ВКЭ уже на ранних стадиях инфицирования. Высокие уровни спонтанной и индуцированной КонА продукции IFN-γ при нормальном уровне продукции IL-4 в первую волну вирусемии свидетельствуют об адекватном Th1-ответе на инфекцию и прогнозируют быструю элиминацию антигена ВКЭ. Тогда как слабая продукция IFN-γ при, напротив, повышенном уровне IL-4 на 2-4 день инфицирования служит маркером иммунного ответа Th-2 типа и прогнозируют длительный период элиминации антигена ВКЭ. В зависимости от полученных результатов определяется тактика лечения пациента.

Способ прогнозирования длительности антигенемии ВКЭ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пациент Л., 38 лет, не вакцинирован против КЭ, обратился через 3 дня после укуса клеща. В крови пациента в ИФА обнаружен антиген вируса КЭ.

Исследование крови, взятой при первом обращении и через 1 месяц (2-я проба), выявило следующие результаты (табл.2).

Табл.2
Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов в крови пациента Л.
Исследования крови	IFN-γ	IL-4
Спонтан.	Индуцир.	Спонтан.	Индуцир.
пациент	1-я проба	72,2	165,9	20,9	23,8
2-я проба	47,0	114,5	17,5	21,6
Контроль	52,6±17,5	103,0±35,4	15,7±4,3	17,4±4,4

По данным продукции цитокинов, определенных на ранних сроках инфицирования у пациента Л. в сравнении с пороговыми величинами (см. табл.1), а именно по уровню спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пкг/мл, индуцированной продукции IFN-γ выше 122,2 пкг/мл, спонтанной и индуцированной продукции IL-4 ниже 24 пкг/мл, мы можем прогнозировать быструю элиминацию вируса. Это подтвердилось в дальнейшем, т.е. при повторном обращении (через месяц) в крови пациента Л. антиген вируса КЭ не обнаружен.

Пример 2. Пациентка О., 50 лет, не вакцинирована против КЭ, обратилась через 2 дня после укуса клеща. В крови пациента в ИФА обнаружен антиген ВКЭ. Исследование крови, взятой на 2-е сутки (1-я проба), через 1 месяц (2-я проба) и через 6 месяцев (3-я проба), показало следующие результаты (табл.3).

Табл.3
Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов в крови пациентки О.
Исследования крови	IFN-γ	IL-4
Спонтан.	Индуцир.	Спонтан.	Индуцир.
пациент	1-я проба	50,6	96,4	27,5	29
2-я проба	48,1	76,9	29,8	32,8
3-я проба	41,6	62,4	35	38,5
контроль	52,6±17,5	103,0±35,4	15,7±4,3	17,4±4,4

По данным продукции цитокинов, определенных на ранних сроках инфицирования, а именно по уровню спонтанной продукции IFN-γ ниже 59,7 пкг/мл, индуцированной продукции IFN-γ ниже 122,2 пкг/мл и спонтанной и индуцированной продукции IL-4 выше 24 пкг/мл, можно прогнозировать длительный период элиминации вируса КЭ. Это подтвердилось в дальнейшем, т.е. в крови пациентки О. при повторных посещениях через 1 и 6 месяцев обнаружен антиген вируса КЭ.

Способ прогнозирования длительности антигенемии вируса клещевого энцефалита, включающий исследование в периферической крови уровня цитокинов IFN-γ и IL-4, отличающийся тем, что до введения противоклещевого иммуноглобулина у инфицированных лиц определяют уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов и при уровне спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пг/мл, а индуцированной - выше 122,2 пг/мл и уровне спонтанной продукции IL-4 ниже 23,5 пг/мл, а индуцированной - ниже 25,3 пг/мл прогнозируют быструю элиминацию антигена.