Криопротекторный раствор для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (-40°c)

Криопротекторный раствор для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (-40°c)

Реферат

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию криопротекторного раствора для консервирования лейкоцитов, в частности, человека.

В качестве прототипа нами выбран хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре // Сведенцов Е.П. и соавт., 2002 г. (Патент РФ №2184449), включающий гексаметиленбистетраоксиэтил мочевину (ГМБТОЭМ), фумарат натрия, лимонную кислоту и воду для инъекций.

Существенным недостатком прототипа является то, что ГМБТОЭМ имеет весьма высокую стоимость и не может широко применяться для консервирования лейкоцитов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание криозащитного раствора для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре, обеспечивающего высокую морфологическую сохранность лейкоцитарных клеток.

Технический результат достигается тем, что криозащитный раствор содержит эндоцеллюлярный криопротектор глицерин, сукцинат оксиметилэтилпиридина (ОМЭПС), обладающий антиоксидантным, мембраностабилизирующим и умеренным антигипоксическим действием, гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) с экзоцеллюлярным хладоограждающим действием, а также в качестве антикоагулятна трехзамещенный цитрат натрия. Данный раствор создает оптимальную среду для клеток, pH которой составляет 7,0-7,4. Его ингредиенты тропны к лейкоцитам и все производятся в Российской Федерации.

Пример использования средства

Криопротекторый раствор, содержащий глицерин в концентрации 4,8%, сукцинат оксиметилэтилпиридина (ОМЭПС) 0,1%, трехзамещенный цитрат натрия 0,2%, следы гидроксида натрия, ГЭК 6% до 100 мл и имеющий pH 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт 300». Смесь, выдержав 20 мин при комнатной температуре (+21°С), охлаждают по нелинейной программе в электроморозильнике в 4-литровой спиртовой ванне, заполненной 96° этиловым спиртом, охлажденным до -28°С, в течение 20 минут. Замороженный лейкоцитный концентрат переносят в камеру электроморозильника, имеющего температуру -40°С. Отогревают образцы до +2÷+4°С в 20 литровой водяной ванне при +38°С при активном перемешивании содержимого колебательными движениями.

Определяют морфологическую сохранность лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N9. - с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до охлаждения.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА».

Изучены три варианта консервирующего раствора для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов раствора представлен в таблице 1.

Таблица 1.
Характеристика состава различных вариантов раствора для консервирования лейкоцитов при -40°С в расчете на 100 г сухого вещества (г).
Номер варианта консервирующего раствора	Состав консервирующего раствора
Глицерин в %	ОМЭПС в %	Трехзамещенный цитрат натрия в %	ГЭК 6% в мл
1	6,00	0,20	0,2	До 100
2	4,80	0,10	0,2	До 100
3	3,60	0,01	0,2	До 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав растворов N1, N2 и N3 после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом, оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), pH среды оставалась в пределах 7,0-7,4.

Таблица 2.
Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах консервирующего раствора после смешивания с лейкоцитным концентратом.
Номер варианта консервирующего раствора	Состав консервирующего раствора
Глицерин в %	ОМЭПС в %	Трехзамещенный цитрат натрия в %	ГЭК 3% в мл
1	3,00	0,10	0,1	До 200
2	2,40	0,05	0,1	До 200
3	1,80	0,005	0,1	До 200

Исследования лейкоцитов выполняли на морфологическую сохранность, жизнеспособность и функциональную активность (табл.3).

Таблица 3.
Результаты после охлаждения до -40°С, хранения при данной температуре в течение 1 суток и отогрева лейкоцитов с различными вариантами предложенного криопротекторного раствора
Вариант консервирующего раствора	Показатели, в % к исходному уровню (n=6).
Морфологическая сохранность гранулоцитов	Жизнеспособность лейкоцитов	Фагоцитарная активность нейтрофилов
Нижний предел дозировок ингредиентов раствора	85,0±11,5	60,4±2,0*	33,5±9,0*
Оптимальное соотношение ингредиентов раствора	96,2±8,5	82,0±4,1	72,0±7,6
Верхний предел дозировок ингредиентов раствора	88,2±7,1	51,0±7,4*	47,8±6,6*
* - различие достоверное (p<0,05)

Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения - хранения - отогрева биообъекта при использовании раствора с оптимальным соотношением ингредиентов и достоверно отличался от данных, полученных при использовании консервирующего раствора с верхним и нижним пределами дозировок ингредиентов.

Готовый оптимальный раствор прозрачен, без запаха, рН=7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток, повреждения их мембран и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при -40°. Раствор обладает хладоограждающим действием при охлаждении лейкоцитов до -40°С, не нуждается в отмывании от размороженных лейкоцитных клеток, т.к. конечная концентация глицерина 3,3% и ниже нетоксична для клеток крови.

Таким образом, предложенный консервирующий раствор позволяет сохранять высокий процент физиологически активных лейкоцитарных клеток при температуре -40°С в течение 1 суток. Данный раствор может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля для сохранности биообъектов в условиях электроморозильника (-40°С).

Криопротекторный раствор для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (-40°С), характеризующийся тем, что он содержит глицерин, сукцинат оксиметилэтилпиридина, гидроксиэтилкрахмал, трехзамещенный цитрат натрия при следующем соотношении ингредиентов, %:

Глицерин	6,0-3,6
Сукцинат оксиметилэтилпиридина	0,2-0,01
Трехзамещенный цитрат натрия	0,2
Гидроксиэтилкрахмал 6%	до 100 мл
pH раствора	7,0-7,4