Штамм бактерий bacillus licheniformis (его варианты), обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, и препарат на основе этого штамма
Патент 2440413
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
- A01N63 - Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, плесневые грибы, ферменты, сбраживающие материалы или вещества, полученные или экстрагированные из микроорганизмов или животных материалов (содержащие соединения определенного строения A01N 27/00-A01N 59/00)[3]
- A61K35/74 - бактерии
- C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них
Штамм бактерий bacillus licheniformis (его варианты), обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, и препарат на основе этого штамма
Изобретение относится штамму микроорганизма, обеспечивающему восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных, обладающего антибактериальной и фунгицидной активностью, и к препаративной форме на их основе и может быть использовано в биотехнологии, ветеринарной медицине и защите растений. Штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, Bacillus licheniformis IC-832-1-2, Bacillus licheniformis IC-833-1-2, Bacillus licheniformis IC-834-1-2 получены методом направленной селекции и депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационными номерами ВКПМ соответственно: В-10561, В-10562, В-10563 и В-10564. Препарат характеризуется содержанием наполнителя с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus licheniformis ВКПМ В-10561, или ВКПМ В-10562, или ВКПМ В-10563, или ВКПМ В-10564, или их смесь с титром каждого штамма бактерий не менее 1·103 КОЕ/г или 1·103 КОЕ/мл. В качестве наполнителя он содержит воду или порошкообразный сорбент. Изобретение позволяет повысить эффективность восстановления микробиоценоза почвы, ЖКТ животных и расширить спектр антибактериальной и фунгицидной активности. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 табл.
Реферат
Изобретение относится к штамму микроорганизма, обеспечивающему восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных, обладающему антибактериальной и фунгицидной активностью, и к препаративной форме на его основе и может быть использовано в биотехнологии, ветеринарной медицине и защите растений для получения препаратов против бактериальных и грибных инфекций животных и растений, а также для использования в качестве микробиологических удобрений и пробиотиков для восстановления микробиоценоза ЖКТ животных.
Зарегистрированные и внесенные в Список Госхимкомиссии Минсельхоза РФ бактериальные фунгициды не предназначены для применения на ягодных культурах - малине и черной смородине. Так, препарат Интеграл (жидкость на основе штамма 24Д Bacillus subtilis) зарегистрирован для применения против болезней зерновых культур (пшеница, ячмень яровой), овощных культур (картофеля, томатов и огурцов). Из ягодных культур препарат разрешен для борьбы с антракнозом черной смородины.
Препарат Фитоспорин-М (порошок на основе штамма 24Д Bacillus subtilis) зарегистрирован для применения против болезней зерновых культур (пшеница, ячмень), бобовых (горох), овощных культур (картофель, капуста, томаты, огурцы), (патент РФ №2129375, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 27.04.1999 г.).
Препарат Бактофит (смачивающийся порошок на основе штамма ИПМ 215 Bacillus subtilis) предназначен для защиты от болезней овощных и цветочных культур, выращиваемых в открытом и защищенном грунте, а также черной смородины от мучнистой росы.
Среди микробиологических удобрений аналогом заявляемого препарата является препарат Бактофосфин, основу которого составляют почвенные микроорганизмы Bacillus mucilaginosus, предназначенный для обогащения почвы усвояемыми растениями формами фосфора, а также восстановления ее плодородия, повышения всхожести и урожайности многих видов сельскохозяйственных культур в открытом и защищенном грунте. Авторами данного удобрения не приводятся конкретные данные по влиянию на показательные для плодородных почв группы микроорганизмов, а также влияния на урожайность культур.
Микробиологическое удобрение Байкал Эм-1 содержит консорциум представителей различных групп микроорганизмов, в том числе грибов, которые, развиваясь в почве при внесении как симбиотическое сообщество, призваны увеличить численность почвенной микрофлоры и, соответственно, плодородие и урожайность.
Однако выше приведенные препараты обладают узким спектром действия. Известен ряд штаммов бактерий рода Bacillus, являющихся антагонистами различных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Штамм Bacillus subtilis В-116 оказывает антагонистическое действие на грибы Pythium и Rhysoctonia. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ N128 используется для получения препарата против грибковых заболеваний хлопчатника (Авторское свидетельство СССР №1717156, кл. А01N 63/00, опубл. 1992 г.) [1].
Однако эти штаммы оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных грибковых возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ N131, используемый для получения препарата против возбудителей гнилей яблок и винограда при хранении (Авторское свидетельство СССР №1706504, кл. А01N 63/00, 1992 г.) [2].
Однако данный штамм также оказывает ограниченное действие, направленное на отдельных грибных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7036, предназначенный для получения препарата против грибных болезней растений (Патент РФ №2086128, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликован 10.08.1997 г.). Штамм подвергался селекции на подавление бактериального роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: Phytophthore infestans, Microsporium solani, Fusarium solani (возбудитель сухой гнили).
Наиболее близким аналогом (прототипом) препаративной формы является препарат Фитоп, полученный на основе выше указанного штамма Bacillus subtilis ВКПМ В 7036 при следующем соотношении компонентов, мас.% (Патент РФ №2086128, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликован 10.08.1997 г.): споры бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7036 с титром 7·1010 спор/г (0,1-1,0); крахмал (0,2-3,0); сахар - остальное. Остаточная влажность препарата составляет не более (2-5) %. Препарат Фитоп выпускается и используется в сельском хозяйстве более 10 лет.
Однако штамм-прототип и препарат на его основе обладают недостаточно широким спектром антагонистической активности, а также не исследовался на способность восстановления микробиоценоза ЖКТ животных.
Техническим результатом заявляемых технических решений является обеспечение восстановления микробиоценоза почвы, ЖКТ животных и расширение спектра антибактериальной и фунгицидной активности.
Указанный технический результат достигается путем получения методом направленной селекции четырех вариантов бактериальных штаммов Bacillus licheniformis: IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2, обеспечивающих восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающих бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированых от 18.03.2010 г. во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика соответственно под №ВКПМ: В-10561, В-10562, В-10563 и В-10564. (справки о депонировании прилагаются).
Указанный технический результат достигается также тем, что в препарате, характеризующемся тем, что он содержит наполнитель с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus licheniformis IC-831-1-2, или IC-832-1-2, или IC-833-1-2, или IC-834-1-2, или их смесь с титром каждого штамма бактерий не менее 1·103 КОЕ/г или 1·103 КОЕ/мл. В качестве наполнителя он содержит воду или порошкообразный сорбент. В качестве порошкообразного сорбента он содержит цеолит, или полисахарид, или моносахарид, или дисахарид, или смесь полисахарида с моносахаридом или полисахаридом в соотношении от 1:100 до 1:10. В качестве полисахарида он содержит крахмал, в качестве моносахарида - глюкозу, в качестве дисахарида - сахарозу.
Исходные клоны для получения заявляемых штаммов были выделены из здоровых животных в экологически чистом районе Новосибирской области (Завьяловский бор):
- штамм Bacillus licheniformis: IC-831-1-2 выделен из фекалий гуся,
- штамм Bacillus licheniformis IC-832-1-2 выделен из фекалий коровы,
- штамм Bacillus licheniformis IC-833-1-2 выделен из фекалий гуся,
- штамм Bacillus licheniformis IC-834-1-2 выделен из фекалий курицы.
Исходные клоны подвергались селекции на подавление бактериального и грибного роста. С лучшими клонами проводили эксперименты по подавлению роста: энтеробактерий, грамположительных кокков, неферментируюших бактерий, грибов рода Candida, возбудителей фузариоза растений, пурпуровой пятнистости малины, септориоза малины.
Иммобилизация спор бактерий на крахмале обеспечивает им дополнительную механическую защиту, предотвращает агрегирование спор и обеспечивает более равномерное их распределение в массе наполнителя.
При применении препарата крахмал способствует ускорению прорастания спор бактерий, что повышает эффективность его действия.
Пудра на основе сахарозы (сахара) или глюкозы является не только сорбентом - наполнителем, но и оказывает на препарат стабилизирующий и консервирующий эффект, создает более мягкие условия для хранения спор бактерий.
Кроме того, использование заявляемых компонентов препарата значительно упрощает технологию его получения как на этапах культивирования (в технологии отсутствует использование дорогих ферментов, не требуется очистка и концентрирование препарата), так и на этапах получения его готовой формы (удаление и перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата).
Культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2.
Штаммы относятся к грамположительным факультативно анаэробным палочковидным бактериям. При росте на мясо-пептонном агаре дают морщинистую форму колоний с обильным образованием слизи и выделением розовато-красного пигмента в верхний слой среды под колонией. Колонии кремово-розовые. Клетки палочковидные, эндоспоры овальные, расположены центрально или парацентрально, не раздувают клетку при спорообразовании. Длина клетки (1,09-1,96) мкм, ширина (0,36-0,97) мкм. Капсулу не образуют, выделяют большое количество слизи. По Граму окрашиваются положительно. Штаммы являются термофильными, размножаются при (35-65)°С, оптимальный рост при температуре (37-40)°С.
Через 48 часов роста при 40°С на мясо-пептонном агаре культуры имеют непрозрачные колонии неоднородной консистенции, со слизистыми включениями и волнистым краем, вросшие в поверхность агаровой пластинки. pH среды: минимальная 5,7; максимальная 8,0; оптимальная 6,5-7,0. Штаммы размножаются при 40°С на мясо-пептонном агаре и мясо-пептонном бульоне.
Биохимические свойства штаммов. Они не растут в анаэробных условиях, не образуют ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес-Проскауэра, ферментируют с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизуют крахмал, мочевину и эскулин. Не обладают лецитиназной активностью. Обладают каталазной активностью. Толерантны к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне (1-9) %.
Штаммы не являются зоопатогенными и фитопатогенными.
Штаммы продуцируют биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно-патогенной бактериальной и грибной микрофлоры.
При длительном хранении штаммов споровую массу лиофильно высушивают. Для массового размножения бактерий используют мясо-пептонный бульон, культивирование проводят при температуре 40°С.
Пример 1. Исследование непатогенности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2.
Исследование проведено в лаборатории биотехнологического контроля НПФ «Исследовательский центр».
Патогенность каждого микроорганизма оценивали по выживаемости инфицированных животных, их внешнему виду и поведению, высеваемости бактерий из крови и органов в различные сроки после заражения, а также макроскопической картине внутренних органов при вскрытии животных в конце срока наблюдения.
В работе использованы лабораторные животные двух видов: нелинейные белые мыши массой (18-20) г в количестве 40 особей обоего пола и крысы породы Вистар массой (180-200) г в количестве 40 особей обоего пола. Из животных формировали опытную и контрольную группу по 20 особей в каждой. Для выявления проникновения бактерий в органы экспериментальных животных животным из опытных групп на протяжении 60 суток перорально вводили суточную культуральную жидкость бактерий, полученную путем культивирования исследуемого штамма на мясо-пептонном бульоне.
Животных из опытных и контрольных групп забивали по следующей схеме:
1. день 5 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);
2. день 15 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);
3. день 30 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);
4. день 45 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);
5. день 60 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной).
После проведения вскрытия посевы из органов (сердце, легкое, печень, селезенка) и крови производили на мясо-пептонный и кровяной агары в чашки Петри методом отпечатков. Посевы инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение 24 часов. Результаты учитывали по наличию/отсутствию колоний на поверхности питательной среды в чашке Петри.
В результате проведенных исследований установлено нижеследующее. В течение опыта не зарегистрировано гибели животных. Не отмечено каких-либо изменений в их внешнем виде и поведении. При макроскопической оценке внутренних органов во все периоды проведения вскрытий патологических изменений не обнаружено.
Микробиологический анализ показал, что внутренние органы и кровь были стерильными в опытном и контрольном вариантах во все периоды проведения исследований.
На основании отсутствия гибели животных и каких-либо изменений в их внешнем виде и общем поведении, на протяжении 60-дневного наблюдения, отрицательных результатов микробиологического анализа сердца, легких, печени, селезенки и крови сделан вывод, что штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 являются непатогенными.
Пример 2. Исследование антагонистической активности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Полученные путем селекции штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяли методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-штаммов использовали Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Yersinia pseudotuberculosis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus spp.
Используемые тест-штаммы удовлетворяли следующим требованиям: находились в S-форме, имели типичные морфологические и ферментативные свойства.
Исследование антагонистической активности заявляемых штаммов Bacillus licheniformis производили на мясо-пептонном агаре.
Рецептура мясо-пептонного агара на 1 дм3:
1. пептон мясной ферментативный - 10,0 г;
2. дрожжевой экстракт - 5,0 г;
3. хлорид натрия - 5,0 г;
4. агар микробиологический - 15,0 г;
5. дистиллированная вода - до общего объема 1 дм3.
После смешивания компонентов среду разогревали до полного растворения агара и фильтровали через ватно-марлевый фильтр в колбы вместимостью 500 см3 по 300 см3. Колбы со средой закрывали ватно-марлевыми пробками, оборачивали горловину пергаментом и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,15 МПа в течение 40 мин. После остывания до температуры (45±1)°С среду разливали по стерильным чашкам Петри. Для контроля стерильности чашки с подсушенной средой помещали в термостат при температуре (37±1)°С на (24±2) часа. Нестерильные чашки отбраковывали.
Культуры патогенных микроорганизмов, указанные выше, выращивали на чашках Петри в течение (18±2) часов на мясо-пептонном агаре. В стерильные пробирки приливали по 1 мл физиологического раствора и готовили суспензии тест-штаммов с концентрацией микробных клеток (5,0±1,0)×108 КОЕ/см3.
Для проведения испытания от каждой серии препарата отбирали 3 пробы по 1 г. Далее 0,5 г препарата разводили в 0,5 см3. Полученную взвесь высевали методом штрихов с помощью микробиологической петли по диаметру чашки Петри с мясо-пептонным агаром. Посевы инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение (48±2) часов. Затем к выросшей в виде штриха культуре подсевали с помощью микробиологической петли суспензию патогенов методом перпендикулярных штрихов.
Учет результатов проводили через 8 часов инкубирования при (37±1)°С по величине зон угнетения роста тест-штаммов. Контролем роста культур патогенов служил их параллельный высев на чашки Петри с той же плотной средой (мясо-пептонным агаром), но без исследуемой ассоциации антагониста. В результате проведенных исследований установлено, что штамм Bacillus licheniformis IC-831-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 1).
| Таблица 1. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-831-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1126-4-1 | 13 |
| Staphylococcus aureus IC-1142-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1192-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1200-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus IC-1246-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus IC-1120-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1128-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1257-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1249-4-1 | 13 |
| Staphylococcus aureus IC-1233-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus IC-1149-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1241-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus IC-1251-4-1 | 23 |
| Staphylococcus aureus IC-1226-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus IC-1230-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1140-4-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus IC-1222-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1165-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus IC-1205-4-1 | 17 |
| Staphylococcus haemoliticus IC-1256-4-2 | 20 |
| Staphylococcus aureus IC-1232-4-1 | 14 |
| Staphylococcus aureus IC-1167-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1131-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus IC-1259-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus IC-1243-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus IC-1274-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus IC-1231-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1233-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1234-4-1 | 10 |
| Staphylococcus haemoliticus IC-1258-4-2 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1152-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 11 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 13 |
| Candida albicans штамм IC-1134-9-1 | 30 |
| Продолжение таблицы 1 | |
| Candida albicans IC-53-9-1 | 12 |
| Candida albicans IC-1147-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1150-9-1 | 11 |
| Candida albicans IC-1203-9-1 | 11 |
| Candida albicans IC-1195-9-1 | 10 |
| Candida krusei IC-1244-9-2 | 15 |
| Candida albicans IC-1144-9-1 | 15 |
| Candida albicans IC-1132-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1130-9-1 | 20 |
| Candida albicans IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans IC-26-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans IC-55-9-1 | 11 |
| Candida albicans IC-1119-9-1 | 9 |
| Candida albicans IC-1240-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1166-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1137-9-1 | 14 |
| Candida albicans IC-1186-9-1 | 10 |
| Klebsiella pneumonia штамм IC-27-10-1 | 6 |
| Shigella flexneri IC-815-14-2 | 7 |
| Shigella sonnei IC-47-14-1 | 5 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45- | |
| 13-1 | 8 |
| Serratia marcescens IC-1170-17 | 12 |
| Escherichia coli IC-1184-5-1 | 10 |
| Escherichia coli IC-1273-5-1 | 8 |
| Escherichia coli IC-1429-5-1 | 3 |
| Escherichia coli IC-1427-5-1 | 30 |
| Escherichia coli IC-1151-5-1 | 7 |
| Enterococcus spp. IC-1236-16 | 15 |
| Enterococcus faecium IC-1253-16-1 | 30 |
| Enterococcus spp. IC-1163-16 | 15 |
| Enterococcus spp. IC-1164-16 | 30 |
| Enterococcus spp. IC-1423-16 | 10 |
| Enterococcus spp. IC-1168-16 | 10 |
| Enterococcus spp. IC-1175-16 | 12 |
Штамм В. licheniformis IC-832-1-4 характеризуется следующими показателями зон (мм) задержки роста тест-штаммов патогенов (таблица 2).
| Таблица 2. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-832-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-53-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1147-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1203-9-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1136-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1195-9-1 | 20 |
| Candida krusei штамм IC-1244-9-2 | 18 |
| Candida albicans штамм IC-1144-9-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1132-9-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1130-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-26-9-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-55-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1119-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1186-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1134-9-1 | 30 |
| Pseudomonas aeruginosa штамм IC-1210-7-1 | 12 |
| Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 | 7 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 | 30 |
| Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 | 0 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 | 24 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 | 25 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 | 23 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 | 24 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1149-4-1 | 12 |
| Продолжение табл.2 | |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 | 11 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 | 12 |
| Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1256-4-2 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1230-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 | 11 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 | 30 |
Штамм B. licheniformis IC-833-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 3).
| Таблица 3. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-833-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-53-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1147-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1203-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1195-9-1 | 8 |
| Candida krusei штамм IC-1244-9-2 | 6 |
| Candida albicans штамм IC-1144-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1132-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1130-9-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1133-9-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-26-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-55-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1119-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1139-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1240-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1152-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 30 |
| Klebsiella pneumonia штамм IC-43-10-1 | 6 |
| Продолжение табл.3 | |
| Klebsiella pneumonia штамм IC-31-10-1 | 9 |
| Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 | 12 |
| Shigella sonnei штамм IC-1216-14-1 | 30 |
| Serratia marcescens штамм IC-817-17-1 | 30 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-25-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 26 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1274-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1231-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1234-4-1 | 8 |
| Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1258-4-2 | 5 |
| Staphylococcus aureus штамм IС-1230-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1222-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 | 24 |
| Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1256-4-2 | 9 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 | 17 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1249-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 | 16 |
| Escherichia coli штамм IC-1153-5-1 | 8 |
| Escherichia coli штамм IC-34-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1148-5-1 | 7 |
| Escherichia coli штамм IC-36-5-1 | 6 |
| Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 | 20 |
| Escherichia coli штамм IC-1151-5-1 | 6 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 | 16 |
| Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1423-16 | 8 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1168-16 | 8 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1175-16 | 10 |
Штамм B. licheniformis IC-834-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 4).
| Таблица 4. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-834-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 14 |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 18 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 9 |
| Candida albicans штамм IC-1152-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 14 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1134-9-1 | 30 |
| Escherichia coli штамм IC-1250-5-1 | 5 |
| Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 | 9 |
| Candida albicans штамм IC-53-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1147-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1203-9-1 | 15 |
| Salmonella enteritidis штамм IC-1159-6-1 | 5 |
| Candida albicans штамм IC-1136-9-1 | 7 |
| Candida albicans штамм IC-1195-9-1 | 10 |
| Candida krusei штамм IC-1244-9-2 | 14 |
| Candida albicans штамм IC-1144-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1132-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1130-9-1 | 13 |
| Candida albicans штамм IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-55-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1119-9-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 20 |
| Serratia marcescens штамм IC-817-17-1 | 16 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 | 17 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 | 17 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 | 15 |
| Escherichia штамм coli IC-1153-5-1 | 10 |
| Продолжение табл.4 | |
| Escherichia штамм coli IC-1184-5-1 | 5 |
| Escherichia штамм coli IC-1273-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1193-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1116-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1424-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1238-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-36-5-1 | 7 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1163-16 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1249-4-1 | 19 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1149-4-1 | 8 |
| Escherichia coli штамм IC-1430-5-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 | 10 |
| Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 | 30 |
| Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1222-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1256-4-2 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1133-9-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1230-4-1 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1131-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1259-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1243-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1179-4-1 | 9 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1125-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1274-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1231-4-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1154-9-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1229-4-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1202-9-1 | 6 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1234-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1258-4-2 | 8 |
| Enterococcus app. штамм IC-1423-16 | 10 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1168-16 | 10 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1175-16 | 12 |
Таким образом, исследуемые штаммы бактерий проявляют антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Пример 3. Методика культивирования бактерий Bacillus licheniformis для получения микробной биомассы
Для получения биомассы спор бактерий штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 культивировали на жидкой питательной среде следующего состава:
1. пептон мясной ферментативный - 10,0 г;
2. дрожжевой экстракт - 5,0 г;
3. хлорид натрия - 5,0 г;
4. дистиллированная вода - до общего объема 1 дм3.
pH (7,2±0,2).
На 1 дм3 ферментационной питательной среды требуется 10 см3 соответствующего штамма Bacillus licheniformis с титром 108 КОЕ/см3. Процесс выращивания биомассы осуществляли в ферментере в течение (48±2) часов. При указанном способе культивирования получали титр спор не выше (5-10)×1010 КОЕ/см3.
Пример 4. Получение готовой формы препарата на основе бактерий штаммов B. licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Вначале готовят смесь собранной и проверенной по показателям качества сырой биомассы с наполнителем. В качестве наполнителя может быть использована вода (для обработки растений методом распыления) с титром спор не менее 1·103 КОЕ/мл или порошкообразный сорбент, например цеолит. В качестве сорбента используют также сахарную пудру и крахмал в соотношении биомасса, пудра и крахмал 1:5:5, тщательно перемешивают. В процессе перемешивания происходит иммобилизация спор бактерий на частицы крахмала. Далее в полученную смесь вводят сахарную или глюкозную пудру из расчета 1 часть смеси на 10 частей пудры. В результате получают концентрат препарата с титром спор не менее 1×1010 КОЕ/г. Далее его смешивают с сахарной или глюкозной пудрой и крахмалом в такой пропорции, чтобы получить готовый препарат с титром спор не менее 1·103-106 КОЕ/г.
Остаточная влажность препарата составляет не более 5%.
Пример 5. Составы препаратов
5.1. Состав 1.
Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с титром спор не менее 1·103 КОЕ/мл. Данный раствор хранят в темном месте не более 1-2 суток.
5.2. Состав 2.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с цеолитом с титром спор не менее 1·106 КОЕ/г.
5.3. Состав 3.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с титром спор не менее 1·106 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:100.
5.4. Состав 4.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-832-1-2 с титром спор не менее 1·106 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:10.
5.5. Состав 5.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-833-1-2 с титром спор не менее 1·106 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:50.
5.6. Состав 6.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-834-1-2 с титром спор не менее 1·106 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:10.
5.7. Состав 7.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2, IC-834-1-2 в соотношении 1:1:1:1 с титром спор каждого вида бактерий не менее 1·103 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе глюкозы в соотношении 1:20.
Пример 6. Данные по хранению сухой формы препарата на основе штаммов B. licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Для установления срока годности и условий хранения препарата проведены соответствующие исследования.
В течение 48 месяцев хранения сухой формы препарата при температуре (30±0,5)°С титр и антагонистическая активность препарата не изменились, что подтверждает высокую термостабильность препаратов в споровой форме, обеспечивающую значительное упрощение технологии их применения в ветеринарной медицине и растениеводстве.
Пример 7. Данные по ингибирующей активности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 в отношении фитопатогенов.
Для испытания штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 в отношении способности ингибировать фитопатогенов использовали метод агаровых блоков. Суспензию препарата с титром 1×106 КОЕ/см3 вносили в мясо-пептонный агар, остуженный до температуры (36±1)°С. Для выращивания фитопатогенов использовали:
- среду Чапека для Didymella applanata;
картофельно-глюкозный агар для Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Alterneria alternaya, Fusarium moniliformes, Fusarium sporotrichiella, Rhizoctonia solani.
Инокулированную исследуемым штаммом среду разливали в чашки Петри и на застывшую поверхность, в центр помещали блок диаметром 10 мм, вырезанный из колонии фитопатогена.
Учет результатов проводили с периодичностью 1 раз в 3 дня. Активность штамма учитывали по изменению диаметра колонии гриба в сравнении с контролем (среда без внесения штамма). На основании полученных данных определяли ингибирующую активность, которую рассчитывали по формуле
,
где
Дк - диаметр колонии в контрольном варианте,
До - диаметр колонии в опытном варианте.
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-831-1-2 на 7-е сутки:
- в отношении Didymella applanata - 12,7%;
- в отношении Fusarium moniliformes - 62%;
- в отношении Fusarium oxysporum - 70%;
- в отношении Fusarium sporotrichiella - 19,2%;
- в отношении Alterneria alternata - 10,5%.
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штаммов Bacillus licheniformis IC-832-1-2 на 7-е сутки:
- в отношении Didymella applanata - 17,2%;
- в отношении Botrytis cinerea - 21%;
- в отношении Fusarium moniliformes - 43%;
- в отношении Fusarium sporotrichiella - 17,2%;
- в отношении Alterneria alternata - 38,7%.
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-833-1-2 на 7-е сутки:
- в отношении Botrytis cinerea - 38%;
- в отношении Fusarium oxysporum - 62%;
- в отношении Fusarium moniliformes - 12%;
- в отношении Alterneria alternata - 42%.
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-834-1-2 на 7-е сутки:
- в отношении Didymella applanata - 67%;
- в отношении Botrytis cinerea - 67%;
- в отношении Fusarium moniliformes - 44%;
- в отношении Fusarium oxysporum - 67%;
- в отношении Fusarium sporotrichiella - 36%;
- в отношении Alterneria alternata - 11%.
Таким образом, заявляемые штаммы Bacillus licheniformis проявляют антагонистическую активность по отношению к выше перечисленным грибным фитопатогенам.
Пример 8. Данные полевых испытаний по изучению влияния препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 на пораженность малины пурпуровой пятнистостью и смородины септориозом
Для испытания штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 с целью определения наличия фунгицидной активности в отношении болезней малины и смородины в открытом грунте использовали промышленные посадки малины сорта Зоренька Алтая и смородины сорта Софья. В качестве химического эталона использовали препарат Топаз в концентрации 0,1%. Обработку проводили суспензией препаратов с титром 106 спор/мл.
Обработку посадок проводили в июле и июне. Сроки обработки определялись при появлении первых симптомов болезней.
Схема полевого опыта:
- штамм Bacillus licheniformis IC-831-1-2;
- штамм Bacillus licheniformis IC-832-1-2;
- штамм Bacillus licheniformis IC-833-1-2;
- штамм Bacillus licheniformis IC-834-1-2;
- Топаз 0,1%;
- контроль.
Повторность опыта четырехкратная, площадь делянки 10 м2, расход рабочей жидкости - 4 дм3 на вариант. Размещение делянок рандомизированное. Схемы на малине и смородине аналогичны.
Поражение листьев смородины септориозом учитывали по следующей шкале:
0 - баллов - здоровые листья;
1 балл - слабое развитие заболевания (занято пятнами от 0 до 10% поверхности листовой пластинки);
2 балла - средние развитие заболевания (занято пятнами от 11 до 25% поверхности листовой пластинки);
3 балла - сильное развитие заболевания (занято пятнами от 26 до 50% поверхности листовой пластинки);
4 балла - очень сильное развитие заболевания (занято пятнами более 50% поверхности листовой пластинки).
Степень повреждения побегов малины оценивали по специальной 4-балльной шкале для пурпуровой пятнистости малины:
0 баллов - здоровый стебель;
1 балл - поверхность пораженного участка гладкая, возможны утолщения коры, участок расположен по одну сторону стебля;
2 балла - поверхность пораженного участка гладкая, возможны трещины коры, участок расположен по обе стороны стебля;
3 балла - поверхность пораженного участка деформирована, участок расположен по обе стороны стебля;
4 балла - поверхность пораженного участка деформирована, участок окольцовывает стебель.
Развитие болезни определяли по следующей формуле: