Противораковая композиция, включающая линию клеток, полученную из камбия и прокамбия стебля тисса (taxus)

Противораковая композиция, включающая линию клеток, полученную из камбия и прокамбия стебля тисса (taxus)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение касается композиции для профилактики или лечения рака, которая содержит в качестве активного ингредиента линию клеток, полученную (то есть ведущую свое происхождение) из камбия или прокамбия растения рода Taxus (тисс), лизат этой линии клеток; экстракт этой линии клеток или культуральную среду этой линии клеток.

Уровень техники

Апоптоз представляет собой активный процесс гибели клеток, который осуществляется путем регуляции в клетках экспрессии разных генов и активности ряда белков в соответствии с запрограммированными сигналами. Образуемые в ходе этого процесса апоптосомы удаляются под действием фагоцитов, таких как окружающие клетки или как макрофаги, так что они не приводят к развитию воспаления. Такой апоптоз часто наблюдается в ходе различных нормальных физиологических процессов в живых организмах, и, как известно, глубоко вовлечен в процесс развития различных заболеваний, а именно развитие ненормального апоптоза может привести к нейродегенеративным заболеваниям, иммунным заболеваниям и сердечно-сосудистым заболеваниям, а ненормальное ингибирование апоптоза может вызывать рак.

Более специфические примеры заболеваний, которые вызываются ненормальным протеканием апоптоза и ингибированием апоптоза, включают разные виды рака, индуцируемые ненормальной экспрессией некоторых генов, таких как р53, р16 и Bcl-2, инфицированием вирусами ВИЧ, герпеса и гриппа, и аутоиммунные заболевания, такие как диабет 1 типа, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и миастения гравис (тяжелая псевдопаралитическая миастения). Апоптоз клеток у индивидуума представляет собой общий механизм удаления ненормальных клеток, например непоправимо генетически поврежденных клеток у индивидуума для того, чтобы предотвратить развитие опухолей, вызываемое либо такими генетическими поврежденными клетками, либо индукцией ненормальной дифференцировки под действием вызывающих дифференцировку стимулов. Эта концепция подтверждается тем фактом, что обычные противораковые агенты вызывают гибель раковых клеток через процесс апоптоза, ассоциированный с ингибированием пролиферации раковых клеток (Barry M.A. et al., Biochem Pharmacol., 40:2353, 1990; Hickman J.A., Cancer Metastasis Rev., 11:121, 1992).

В соответствии с этим нарушение процесса апоптоза приводит к выживанию поврежденных клеток и клеток, в которых начался процесс повреждения, и к росту этих клеток, то есть, ингибирование апоптоза играет важную роль в процессе канцерогенеза. Кроме того, сообщалось, что вещества, обладающие защитным действием в отношении рака, индуцируют апоптоз таких ненормальных клеток, а индукция апоптоза этими веществами ассоциирована, по меньшей мере, с их защитной активностью в отношении рака (Fesus L., J. Cell Biochem., 22:151,1995; Reddy B.S., Cancer Res., 57:420,1997).

В изучение механизма развития рака и способов его лечения по-прежнему вкладываются огромные средства, однако рак все еще остается неизлечимым заболеванием, а различные способы лечения рака вызывают побочные эффекты (Goodman et al., Cancer Res., 9:2295, 1987). В связи с этим предпринимаются многочисленные попытки в области исследования и разработки новых лекарств и композиций для подавления рака, в частности, большой интерес вызывают исследования, направленные на разработку противораковых веществ из природных материалов, которые имеют незначительные побочные эффекты.

Некоторые из авторов настоящего изобретения разработали способ для получения клеточных линий из камбия и прокамбия, в которых не возникает проблем с разнородностью клеток, связанных с процессом дифференцировки, которые могут стабильно пролиферировать и обладают высокой генетической стабильностью, и обнаружили, что при культивировании таких клеточных линий, полученных из растений рода Taxus, в отличие от клеточных линий другого происхождения, наблюдается высокий выход паклитаксела (paclitaxel) (PCT/KR 2006/001544). Однако о противораковом действии самих по себе клеточных линий, полученных из камбия и прокамбия Taxus, до настоящего времени ничего не сообщалось.

В соответствии с этим авторы настоящего изобретения проделали большую работу по получению противораковой композиции из натурального природного материала, которая имеет минимизированные побочные эффекты по сравнению с обычными противораковыми агентами и обладает прекрасной противораковой активностью, и в результате проделанной работы обнаружили, что гомогенные клеточные линии, полученные из камбия и прокамбия Taxus, лизат этих линий, экстракт этих линий или культуральная среда этих линий обладают активностью, убивающей раковые клетки, что и является предметом настоящего изобретения.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление композиции, полученной из природного материала, которая имеет минимизированные побочные эффекты по сравнению с известными в данной области техники противораковыми агентами и обладает активностью в отношении профилактики (предотвращения развития) и лечения рака.

Для достижения указанной выше цели, в одном из своих аспектов настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для профилактики или лечения рака, которая содержит любой один или более компонентов, выбираемых из группы, состоящей из клеточной линии, полученной (то есть ведущей свое происхождение) из камбия или прокамбия Taxus и обладающей приведенными ниже характеристиками, лизата этой клеточной линии, экстракта этой клеточной линии и культуральной среды этой клеточной линии:

(а) клетки этой линии морфологически характеризуются наличием большого количества вакуолей;

(б) клетки этой линии находятся в характерном для них изначально недифференцированном состоянии; и

(в) линия представляет собой гомогенную клеточную линию.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет функциональный пищевой продукт для профилактики или улучшения состояния при раке, которое содержит один или более компонентов, выбираемых из группы, состоящей из названной клеточной линии, названного лизата, названного экстракта и названной культуральной среды.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение предоставляет применение любого из перечисленного: названной клеточной линии, названного лизата, названного экстракта и названной культуральной среды для профилактики или лечения рака.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение предоставляет способ для профилактики или лечения рака, способ, который включает применение одного или более компонентов, выбираемых из группы, состоящей из названной клеточной линии, названного лизата, названного экстракта и названной культуральной среды.

Другие особенности и аспекты настоящего изобретения станут очевидными из приведенного ниже раскрытия изобретения и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой фотографии, показывающие способ индукции клеточной линии согласно настоящему изобретению, изображение изолированного прокамбия и камбия и сравнение между дедифференцированными клетками и клетками, полученными из прокамбия Taxus.

Фигура 2 представляет собой сравнительные графики количества Активных Форм Кислорода (АФК) и фотографии флуоресценции DCFH, которые показывают антиоксидантную активность экстрактов клеточных линий согласно настоящему изобретению, когда старение диплоидных фибробластов кожи человека (human skin diploid fibroblasts, HDFs) индуцируется обработкой H₂O₂. Обозначения на Фигуре 2: p-WE - экстракт прокамбия в дистиллированной воде; и C-WE - экстракт камбия в дистиллированной воде.

Фигура 3 представляет собой фотографии, показывающие сравнение размера раковой ткани между контрольной группой и группой, которой вводилась клеточная линия, через 2 недели после введения клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 4 представляет собой графическую диаграмму, показывающую размеры (объем) опухоли в контрольной группе и в группе, которой вводилась клеточная линия, в течение 3 недель после введения клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 5 представляет собой фотографии раковых тканей, вырезанных из мышей из контрольной группы и из группы, которой вводилась клеточная линия, через 3 недели после введения клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 6 представляет собой фотографию внутреннего строения вырезанной раковой ткани через 3 недели после введения клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 7 представляет собой фотографии, показывающие степень гибели клеток после обработки нескольких линий раковых клеток экстрактом клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 8 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака толстой кишки разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 9 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака легкого разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 10 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака простаты разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 11 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток остеосаркомы разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 12 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток карциномы ротовой полости разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 13 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака кожи разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 14 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток лейкемии разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 15 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака матки разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 16 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака кожи (человека) разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 17 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака поджелудочной железы разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 18 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака молочной железы разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 19 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака желудка разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 20 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака почки разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 21 представляет собой фотографию, показывающую степень гибели клеток после обработки линии клеток рака печени разными концентрациями метанольного экстракта клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Фигура 22 графически представляет результаты анализа присутствия паклитаксела в клеточной линии согласно настоящему изобретению.

Раскрытие изобретения и предпочтительные воплощения

Если не определено иначе, все технические и научные термины, употребляемые в настоящем изобретении, имеют то же самое значение, которое обычно понимается специалистом среднего уровня квалификации в данной области техники. В целом определения различных терминов, употребляемых в настоящем изобретении, хорошо известны и обычно используются в данной области техники.

Определения основных терминов, употребляемых в раскрытии изобретения, являются следующими. В используемом здесь значении термин «камбий» относится к ткани, которая обеспечивает рост стебля и корня в толщину и позволяет растению увеличивать свой объем. Сообщалось, что когда камбий - меристема, в которой происходит наиболее активное деление клеток, используется в качестве экспланта для получения культуры растительной ткани, можно получить быструю и массовую продукцию клеток (Korean Patent 10-0533120).

В используемом здесь значении термин «прокамбий» относится к первичной меристеме, ведущей свое происхождение от группы первичных клеток, а камбий представляет собой первичную меристему, которая образуется из прокамбия без формирования постоянной ткани.

В используемом здесь значении термин «лизат» относится к клеточному лизату, полученному путем разрушения клеток посредством химического метода, например с помощью обработки детергентом, или с помощью физического метода. Термин «экстракт» клеточной линии относится к субстанции, полученной путем растворения клеток в растворителе и последующего удаления клеток, после этого экстракт может быть сконцентрирован посредством возгонки или выпаривания.

В используемом здесь значении термин «изначально недифференцированные» означает, что клетки не находятся в недифференцированном состоянии в результате процесса дедифференцировки, но исходно находятся в характерном для них преддифференцированном состоянии.

В одном своем аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции для профилактики или лечения рака, которая содержит любой один или более из компонентов, выбираемых из группы, состоящей из клеточной линии, полученной из камбия или прокамбия Taxus, лизата этой клеточной линии, экстракта этой клеточной линии и культуральной среды этой клеточной линии.

Клеточная линия, полученная из камбия или прокамбия Taxus согласно настоящему изобретению, обладает следующими характеристиками:

(а) клетки этой линии морфологически характеризуются наличием большого количества вакуолей;

(б) клетки этой линии находятся в характерном для них изначально недифференцированном состоянии; и

(в) линия представляет собой гомогенную клеточную линию.

Клеточная линия, полученная из камбия или прокамбия Taxus согласно настоящему изобретению, дополнительно характеризуется тем, что: (а) она присутствует в виде одиночных клеток при культивировании в суспензии; (б) она обладает более высокой скоростью роста по сравнению с теми клеточными линиями, которые получены из других тканей, а не из камбия или прокамбия Taxus, и она стабильно культивируется; и (в) она обладает низкой чувствительностью к стрессу, вызываемому угловым сдвигом в биореакторе, по сравнению с теми клеточными линиями, которые получены из других тканей, а не из камбия или прокамбия Taxus.

Клеточная линия согласно настоящему изобретению предпочтительно получается способом выделения клеток, включающим следующие стадии:

(а) выделение ткани Taxus, содержащей камбий или прокамбий;

(б) индукцию образования слоя камбия или прокамбия, который пролиферирует из клеток камбия или прокамбия, и аморфного слоя каллуса, который пролиферирует из тканей, не являющихся камбием или прокамбием, путем культивирования полученной ткани Taxus, содержащей камбий или прокамбий; и

(в) сбор клеточной линии из слоя камбия или прокамбия.

В предлагаемом способе выделения стадия (в) предпочтительно проводится путем пролиферации клеток в среде, которая содержит 3-5% (по весу) нерафинированного сахара или сахара и, по меньшей мере, одно из веществ, выбираемых из группы, состоящей из метилжасмоната, грибного экстракта, бактериального экстракта, дрожжевого экстракта, хитозана, глюкоманнана, глюкана, фенилаланина, бензойной кислоты, салициловой кислоты, арахоновой кислоты, STS, мевалоналонат-N-бензолилглицина, АВА, SNP, IPP, ВНТ, ССС, этефона, гиппуевой кислоты, нитрата аммония и церия, AgNO₃, ванадилсульфата, р-аминобензойной кислоты, брассиностероидов, альгината натрия и ацетата натрия, и последующего сбора пролиферированной клеточной линии. Предпочтительно, чтобы в среде содержался метилжасмонат в концентрации 10-100 мкМ.

Среда, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой обычную среду для культуры растительной ткани, и примеры таких сред включают, но ими не ограничиваются, среду N6, среду SH, среду MS, среду АА, среду LS, среду В5, среду WPM, среду LP, среду White, среду GD, среду DKW, среду DCR и т.д.

В настоящем изобретении экстракт предпочтительно получают с применением растворителя, выбираемого из группы, включающей дистиллированную воду, спирт, ацетон, ДМСО (диметилсульфоксид) и смесь этих растворителей.

В одном примере настоящего изобретения было обнаружено, что клеточная линия, полученная из камбия Taxus, и клеточная линия, полученная из прокамбия Taxus, согласно настоящему изобретению обладают способностью ингибировать активные формы кислорода, индуцируемые H₂O₂, что позволяет считать, что они обладают антиоксидантным эффектом. Поскольку продуцируемые in vivo активные формы кислорода (АФК) вызывают мутации при связывании с клеточными молекулами, такими как внутриклеточная ДНК, белки и липиды, и вовлечены в образование раковой ткани за счет ингибирования нормального функционирования клеток, можно видеть, что клеточные линии настоящего изобретения обладают способностью предотвращать рак.

В другом примере настоящего изобретения клеточная линия, полученная из камбия Taxus, и клеточная линия, полученная из прокамбия Taxus, согласно настоящему изобретению вводились мышам, после чего анализировалась раковая ткань, извлеченная из мышей. В результате было показано, что клеточная линия, полученная из камбия Taxus, и клеточная линия, полученная из прокамбия Taxus, согласно настоящему изобретению ингибируют рост раковой ткани, ингибируют ангиогенез (рост кровеносных сосудов), что является одним из противораковых механизмов, и усиливают инфильтрацию иммунных клеток в раковую ткань.

В еще одном примере настоящего изобретения клеточные линии рака толстой кишки, карциномы ротовой полости, рака легкого, рака простаты, остеосаркомы, лейкемии, рака матки, рака кожи, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака желудка, рака почки и рака печени обрабатывались каждая по отдельности водным экстрактом (в дистиллированной воде), метанольным экстрактом и ацетоновым экстрактом для того, чтобы определить влияние этих экстрактов на гибель раковых клеток. В результате было показано, что экстракты клеточных линий согласно настоящему изобретению являются эффективными для профилактики и лечения, но этими видами рака не ограничиваясь, рака толстой кишки, карциномы ротовой полости, рака легкого, рака простаты, остеосаркомы, лейкемии, рака матки, рака кожи, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака желудка, рака почки и рака печени.

Таким образом, было обнаружено, как это описано выше, что клеточные линии и их экстракты обладают активностью в плане профилактики и лечения рака. Следовательно, хотя это и не продемонстрировано в настоящем изобретении и отсутствует специфический пример, показывающий, что композиция, включающая лизат или культуральную среду клеточной линии, демонстрирует активность по предотвращению и лечению рака, это должно быть очевидным для любого специалиста в данной области техники, что композиция, включающая лизат или культуральную среду клеточной линии согласно настоящему изобретению, может также обладать активностью по предотвращению и лечению рака.

В еще одном примере настоящего изобретения было проанализировано наличие паклитаксела в клеточной линии настоящего изобретения. Когда клеточная линия согласно настоящему изобретению культивируется в среде, содержащей стимулятор, она может продуцировать паклитаксел в высокой концентрации. Клеточная линия настоящего изобретения, которая не культивировалась в условиях, обеспечивающих продукцию паклитаксела, или была обработана в специальных условиях таким образом, чтобы она не продуцировала паклитаксел, была протестирована с целью выяснения, содержит ли она паклитаксел, для чего анализировались данные жидкостной хроматографии (LC). В результате было показано, что клеточная линия не содержит паклитаксел. Таким образом, можно думать, что противораковая активность клеточной линии настоящего изобретения не является результатом действия паклитаксела, который как известно продуцируется растениями рода Taxus, но является противораковой активностью клеточной линии самой по себе. Кроме того, поскольку клеточная линия согласно настоящему изобретению демонстрирует противораковые эффекты даже когда она вводится перорально, можно полагать, что противораковая активность клеточной линии настоящего изобретения не связана с действием паклитаксела, который применяется в виде раствора для инъекций, поскольку паклитаксел не эффективен при пероральном введении.

Композиция для профилактики или лечения рака, содержащая любой один или более из компонентов, выбираемых из клеточной линии согласно настоящему изобретению, лизата этой клеточной линии, экстракта этой клеточной линии, и культуральной среды этой клеточной линии, может быть предоставлена в виде фармацевтической композиции, содержащей любой один или более компонент, выбираемый из группы, состоящей из клеточной линии, лизата этой клеточной линии, экстракта этой клеточной линии, и культуральной среды этой клеточной линии самих по себе или в комбинации, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или растворителем. Клеточная линия, лизат, экстракт или культуральная среда этой клеточной линии могут быть включены в фармацевтическую композицию в фармацевтически эффективном количестве в зависимости от заболевания и его тяжести, возраста, веса, состояния здоровья и пола пациента, способа введения и длительности периода лечения.

В используемом здесь значении термин «фармацевтически приемлемая композиция» означает композицию, которая является физиологически приемлемой и не вызывает при введении человеку расстройства желудка, аллергических реакций, таких как головокружение или подобных реакций.

Примеры названных носителей, наполнителей или растворителей могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, ксилитол, эритритол, мальтитол, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидрокси-бензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать наполнители, анти-агрегирующие агенты, смазывающие вещества (любриканты), увлажняющие агенты, ароматизаторы, эмульгаторы и консерванты. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть получена с применением методов, хорошо известных в данной области техники, таких, которые обеспечивали бы быстрое, замедленное или отложенное высвобождение активного ингредиента после введения млекопитающим. Композиция может быть приготовлена в виде порошков, гранул, таблеток, эмульсий, сиропов, аэрозолей, мягких или твердых желатиновых капсул, стерильных растворов для инъекций, стерильных порошков и т.д.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет функциональный пищевой продукт для профилактики или улучшения состояния при раке, которое содержит любой один или более из компонентов, выбираемых из группы, состоящей из названной клеточной линии, названного лизата, названного экстракта и названной культуральной среды, получаемых из камбия или прокамбия Taxus.

В используемом здесь значении термин «функциональный пищевой продукт» относится к продуктам питания, функциональность которых была улучшена путем добавления к ним клеточной линии согласно настоящему изобретению, лизата, экстракта или культуральной среды клеточной линии. Например, противораковый эффект клеточной линии настоящего изобретения или экстракта клеточной линии могут применяться для приготовления функционального пищевого продукта для профилактики и облегчения рака.

Функциональный пищевой продукт настоящего изобретения может содержать различные питательные вещества, витамины, минеральные компоненты (электролиты), ароматизирующие агенты, такие как синтетические ароматизирующие агенты и натуральные ароматизирующие агенты, красители, наполнители, пищеварительную кислоту (peptic acid) и ее соль, альгиновую кислоту и ее соль, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, агенты, регулирующие кислотность (рН), стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, карбонизирующие агенты, которые применяются при карбонизировании напитков.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более детально с помощью примеров. Для любого специалиста в данной области техники должно быть очевидным, что данные примеры приводятся исключительно с целью иллюстрации настоящего изобретения и никак не ограничивают рамок настоящего изобретения, поскольку эти примеры могут быть изменены в различные другие варианты.

В частности, хотя в приведенных ниже примерах подтверждаются эффекты по предотвращению рака и эффекты по ингибированию рака клеточной линией и экстрактом клеточной линии, полученной из камбия или прокамбия Taxus, специалисту в данной области техники должно быть очевидным, что применение лизата или культуральной среды указанной клеточной линии может обеспечить такие же результаты, как те, которые получены с применением клеточной линии или экстракта этой клеточной линии.

Пример 1. Получение клеточной линии, происходящей из камбия или прокамбия Taxus

1-1. Получение растительного материала

Собирали по отдельности ветви и стебли Taxus spp., после чего их сразу замачивали в растворе L-аскорбиновой кислоты (DUCHEFA, The Netherlands) в концентрации 100 мг/л, используемой в качестве антиоксиданта. После этого материал транспортировали и хранили.

После этого растения предварительно обрабатывали смешанным раствором 1% беномила (Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% даконила (Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% стрептомицинсульфата (DUCHEFA, The Netherlands) и 0,1% цефотаксима натрия (DUCHEFA, The Netherlands) в течение 24 часов, после чего промывали проточной водой в течение 30 минут для удаления фенольных соединений и оставшихся химикатов. Затем поверхность растений стерилизовали 70% этанолом (DC Chemical, Korea) в течение 1 минуты, 30% перекисью водорода (LG Chemical, Korea) в течение 15 минут, 1% раствором CLOROX в течение 15 минут и 3% раствором CLOROX в течение 5 минут, после чего 3-4 раза промывали водой.

1-2. Выделение тканей прокамбия и камбия из веток и стеблей

Наружные ткани веток и стеблей, которые прошли процесс стерилизации, сразу удаляли путем отрывания их в продольном направлении. Очищенные ткани состояли из ксилемы, прокамбия (ветки) или камбия (стебли), флоэмы, коры и эпидермиса, и эти ткани культивировали таким способом, чтобы самая глубокая ткань из числа имеющихся в материале, например ксилема, находилась в контакте со средой.

1-3. Индукция клеточных линий, происходящих из прокамбия и камбия Taxus

На 4-7 день первичной культуры визуально наблюдалось деление клеток прокамбия и камбия, а после 15 дней культивирования формировался аморфный каллус за счет начала дедифференцировки клеток в слое, состоящем из флоэмы, коры и эпидермиса. Однако деления клеток в ксилеме не происходило во время всего периода культивирования, в результате чего слой камбия естественным образом был отделен от ксилемы. Через 30 дней культивирования ткань начинала разделяться на слой камбия и содержащий флоэму верхний слой, который представлял собой аморфный слой каллуса (фигура 1(а)), после чего ткань естественным образом полностью разделялась на два слоя и эти слои по отдельности культивировались в разных чашках Петри (фигура 1(b)). На фигуре 1(а) надпись «верх» указывает на ткань, содержащую флоэму, кору и эпидермис, надпись «середина» указывает на камбий, надпись «низ» указывает на ксилему, а наконечник стрелки указывает на зону разделения между слоем камбия и тканью, содержащей флоэму, кору и эпидермис. На фигуре 1(b) «А» указывает на клеточную линию, образованную тканью, содержащей флоэму/кору/эпидермис, которая пролиферирует нерегулярно из-за разницы в скорости деления у разных клеток, «В» указывает на клеточную линию, происходящую из камбия, которая пролиферирует с образованием однородного слоя клеток в результате регулярного деления клеток, а «С» указывает на ксилему, в которой деления клеток не происходит. Фигура 1(с) показывает, что происходит индукция клеточной линии, происходящей из прокамбия. На фигуре 1(с) «А» показывает фрагмент ветки через 30 дней культивирования и представляет собой фотографию, демонстрирующую, что прокамбий («низ») отделяется от клеток каллуса, происходящих из ткани, состоящей из первичной флоэмы, коры и эпидермиса, «В» представляет собой фотографию через 35 дней культивирования и показывает, что происходящий из прокамбия слой был изолирован и культивировался, а «С» представляет собой фотографию через 40 дней культивирования и показывает, что каллус, происходящий из ткани, состоящей из первичной флоэмы, коры и эпидермиса, пролиферирует после отделения слоя прокамбия.

После того как ткань была изолирована, как это описано выше, белая и рыхлая часть этой ткани, обладающая хорошей скоростью роста, была субкультивирована (пересеяна) в такой же свежей среде, как среда индукции, с интервалом в 21 день. Состав среды, применявшейся для индукции только клеточных линий, происходящих из прокамбия и камбия, показан ниже в таблице 1.

В среду был добавлен регулятор роста ауксин в концентрации 1-3 мг/л. Культивирование проводилось в темной комнате при контролируемой температуре 25±1°С.

Таблица 1
Среда для индукции клеточных линий из Taxus spp. (среда 1)
	Состав	Содержание (мг/л)
Неорганические соли	KNO3	1011,1
MgSO4·7H2O	121,56
MnSO4·4H2O	10
ZnSO4·7H2O	2
CuSO4·5H2O	0,025
CaCl2·2H2O	113,23
KI	0,75
CoCl2·6H2O	0,025
NaH2PO4·H2O	130,44
Н3ВО3	3
Na2MoO4·2H2O	0,25
FeNaЭДTA	36,7
Витамины	Мио-инозитол	450
Тиамин-HCI	20
Никотиновая кислота	2
Пиридоксин-HCI	2
L-аскорбиновая кислота	100
Лимонная кислота	150
Фитогормоны	Ауксин	1~3
Гибереллиновая кислота	0,5
Аминокислоты	Гидролизат казеина	500
Сахароза		30000
Activalted		100
Gelrite		4000

Для сравнения зародыши и эксплантаты иголок Taxus были простерилизованы и культивировались в среде, приведенной в таблице 1. В результате можно видеть, что зародыши и эксплантаты иголок формируют каллусы за счет процесса дедифференцировки. Каллусы, образующиеся из зародышей и эксплантатов иголок, имеют неправильную форму из-за разницы в скорости деления между разными клетками, как это наблюдается в случае ткани, содержащей флоэму, демонстрируют нестабильную скорость роста и быстро приобретают коричневую окраску. Агрегированные каллусы коричневого цвета, индуцированные из зародышей и эксплантатов иголок, демонстрируют медленный рост, вследствие секреции ими фенольных соединений и неизбежно погибают, а именно через 6 месяцев культивирования каллусы, образованные из зародышей и эксплантатов иголок, было трудно поддерживать в культуре. Однако клетки, ведущие свое происхождение от прокамбия и камбия, стабильно поддерживались без изменения скорости их роста, характера роста и агрегации, когда они культивировались в течение длительного времени, превышающего 20 месяцев, что говорит о возможности создания крупномасштабной клеточной культуры.

1-4. Анализ роста и характеристики выделенных клеточных линий

Клеточные линии, полученные из прокамбия и камбия, помещались в колбы, содержащие жидкую среду, состав которой приведен ниже в таблице 2. После этого клеточные линии в колбах культивировались во вращающемся шейкере (качалке) при 100 оборотах в минуту при 25±1°С. Субкультура поддерживалась в течение 2 недель так, чтобы культивируемые клетки всегда сохраняли высокую жизнеспособность и находились в экспоненциальной фазе роста.

Таблица 2
Среда для выращивания в суспензии клеточных линий из Taxus spp. (среда 2)
	Состав	Содержание (мг/л)
Неорганические соли	KNO3	1011.1
MgSO4·7H2O	121,56
MnSO4·4H2O	10
ZnSO4·7H2O	2
CuSO4·5H2O	0,025
CaCl2·2H2O	113,23
KI	0,75
CoCl2·6Н2О	0,025
NaH2PO4·H2O	130,44
Н3ВО3	3
Na2MoO4·2H2O	0,25
FеNаЭДТА	36,7
Витамины	Мио-инозитол	200
Тиамин-HCI	20
Никотиновая кислота	2
Пиридоксин-HCI	2
L-аскорбиновая кислота	100
Лимонная кислота	150
Фитогормоны	Ауксин	1~3
Гибереллиновая кислота	0,1
Аминокислоты	Аспарагиновая кислота	133
Аргинин	175
Пролин	115
Глицин	75
Сахароза		20000

Клетки каллусов, полученных из зародышей и иголок, также культивировали в среде 2, приведенной в таблице 2, и сравнивались с клеточными линиями настоящего изобретения, полученными из прокамбия и камбия.

Степень агрегации клеток оценивали с помощью микроскопа для биологических исследований СХ31 (Olympus, Japan). В результате, как показано ниже в таблице 3, можно видеть, что более чем 90% клеток в клеточных линиях согласно настоящему изобретению присутствуют в виде одиночных клеток при культивировании в виде суспензии. Как показано на фигуре 1(d), можно видеть, что клеточные линии согласно настоящему изобретению морфологически характеризуются наличием большого количества вакуолей и находятся в недифференцированном состоянии. Стрелка на фигуре 1(d) указывает на вакуоли в клетках, происходящих из прокамбия Taxus.

Таблица 3
Тип клеточных агрегатов в долговременных культурах из Taxus
Крупные клеточные агрегаты	Средние клеточные агрегаты	Мелкие клеточные агрегаты	Популяция одиночных клеток	Источник эксплантата
60±3,2%	30±3,3%	7±0,6%	3±0,9%	зародыш иголки
0	0	9%	91%	камбий
0	0	7,4±0,8%	92,6±0,8%	прокамбий
Крупные клеточные агрегаты, размер больше чем 1,5×103 мкм;Средние клеточные агрегаты 1×103 мкм;Мелкие клеточные агрегаты 4×102 мкм < размер < 1×103 мкм

В то же время для определения возможности крупномасштабного культивирования клеток, каллусы, полученные из зародышей и иголок, и клеточные линии, полученные из прокамбия и камбия, культивировались в воздушном биореакторе (Sung-Won Cytec, Korea) с внутренним объемом 3 л. Культивирование проводилось в жидкой среде, состав которой представлен в таблице 2, в темноте при температуре 25±1°С.

В результате, как это показано в приведенной ниже таблице 4, можно видеть, что время удвоения клеточных культур, полученных из прокамбия и камбия Taxus согласно настоящему изобретению, составило в биореакторе