Способ синтеза рекомбинантного паратиреоидного гормона человека

Способ синтеза рекомбинантного паратиреоидного гормона человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения rhPTH (1-34), также известного как терипаратид, путем создания нового нуклеотида как фрагмента NcoI/XhoI, как указано в Seq. ID №1, кодирующего химерный гибридный белок, как указано в Seq. ID №2, содержащий слитый (химерный) партнер (fusion partner), состоящий из 41 аминокислоты, принадлежащих гену β-галактозидазы Escherichia coli, сайт эндонуклеазного расщепления, фрагмент гена hPTH (1-34), клонирование указанного нуклеотида в вектор экспрессии под контролем промотора Т7, трансформацию Escherichia coli указанным вектором и экспрессирование химерного гибридного белка в способе периодической ферментации с добавлением субстрата. Настоящее изобретение дополнительно относится к индуцированию лактозой с низкой скоростью подачи (питания) для оптимизированной экспрессии rhPTH (1-34) в Escherichia coli. Кроме того, настоящее изобретение дополнительно относится к уникальному, новому двухстадийному ортогональному способу очистки rhPTH (1-34), включающему катионообменную хроматографию необязательно с последующей препаративной хроматографией, выбранной из HIC (хроматография гидрофобного взаимодействия) или RT-HPLC с выходом целевого белка ≥99%. Настоящее изобретение относится к простому, рентабельному, благоприятному с экологической точки зрения способу получения высокочистого rhPTH (1-34).

Предшествующий уровень техники

Паратиреоидный гормон представляет собой пептид, состоящий из 84 аминокислот, вырабатываемый паращитовидной железой. Его физиологическая роль заключается в поддерживании кальция в сыворотке и в реконструировании костей (Dempstor D.W. et al., Endocrine Reviews, 1993, 14, 690-709). Реконструирование кости обычно представляет собой способ продолжительностью от 3 до 6 месяцев, в котором имеется сочетание резорбции кости и костеобразования. Известно, что эстрогены, витамин D, бисфосфонаты ингибируют резорбцию кости, тогда как rhPTH (1-34), анаболическое вещество, увеличивает костную массу. Остеопороз представляет собой болезнь, которая делает кость подверженной переломам, напротив rhPTH (1-34) представляет собой пептидное лекарственное средство, которое произвело революцию в лечении остеопороза. При отдельном применении RhPTH (1-34) стимулирует образование костной массы и вызывает чистое увеличение костной массы в каждом цикле реконструирования, в котором минеральная плотность костной ткани увеличивается, как правило, до 10% в год в области поясничного отдела позвоночника.

Паратиреоидный гормон (РТН) выделяется паращитовидными железами в ответ на снижение концентрации кальция в плазме и обладает некоторыми эффектами, которые восстанавливают нормальные уровни кальция. Показано, что РТН обладает и анаболическим и катаболическим действием на скелет. Длительное повышение РТН вызывает увеличение резорбции кости, тогда как периодически введенный РТН приводит к усиленному формированию кости (Canalis, E., Hock, J.M., и Raisz, L.G. (1994) in The Parathyroidds: Basic и Clinical Concepts, ed by Bilezikian, J.P., Marcus,R., и Levine, M., Raven Press Ltd., NY), хотя клеточный механизм этого двойного действия еще не ясен.

РТН биосинтезируется в виде состоящего из 115-аминокислот предшественника, препропаратиреоидного гормона (препроРТН). Несмотря на то что анаболическая активность РТН (1-84) известна, фактическое структурно-необходимое условие для наличия полной биологической активности заключено в остатках с 1 по 34 на N-конце молекулы (PNAS 68, 63-67, 1971; Endocrinology 93, 1349-1353, 1973).

РТН является чрезвычайно чувствительным к окислению, особенно при остатках метионина Met8 и Met18, и для сохранения его биоактивности нужна интактная N-концевая последовательность. Frelinger, A.L., et al., (J. Biol. Chem., (1984) 259 (9), 5507-5513) разработали способ разделения РТН с окисленным метионином от нативной молекулы и показали, что действенность окисленной молекулы значительно меньше, чем нативного РТН. Для сравнимой биоактивности с РТН полной длины РТН (1-34) нужны обе N и C-концевая спиральная конформация, как показано Jin. L. et al., (J Biol. Chem., (2000) 275 (35), 27238-44. Их модель предполагает наличие рецептор-связывающего кармана для N-конца PTH (1-34) и гидрофобную область взаимодействия с рецептором для С-конца PTH (1-34). Pellegrini M, et al., J.Biol.Chem. (1998) 273 (17), 10420-427 объясняет структуры hPTH (1-34) с высоким разрешением в водном растворе при изучении влияния рН и концентрации соли на вторичную и третичную структуры с помощью КД и ЯМР. Содержание спирали PTH (1-34), исходя из спектра CD, увеличивается в присутствии кислого буфера по сравнению с доброкачественной (benign) водой. Исследования с помощью ЯМР подтверждают наличие спиральной структуры, расположенной на N- и C-концевой части hPTH (1-34). Данная молекула (вне контекста рецепторного взаимодействия) является слишком гибкой, чтобы отдавать предпочтение какому-либо определенному вторичному или третичному свертыванию, при этом экспериментальное ограничение дистанции до 0,06Å дает форму «гибкого стебля» без рецепторного взаимодействия и "U" форму для белка при взаимодействии с рецептором. Было показано, что периодическая (прерывистая) экспозиция лиганда с его рецептором имеет предпочтительное анаболическое действие.

Клонирование и экспрессия терапевтического белка ставит в начале сложную задачу, заключающуюся в наличии подходящего генетического материала. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для клонирования, не должны быть вырожденными, должны иметь сравнимые значения tm и в большинстве случаев располагаться в единственном местоположении в представляющем интерес гене. Обнаружено, что РНК-транскрипт гена РТН (1-84) является положительным в печени, почке, мозге и плацентарной ткани человека. Ген-специфические праймеры, используемые при полимеразной цепной реакции, пригодны в RT-PCR реакции для клонирования в кДНК-фрагмент специфической последовательности. Рекомендуется to fully sequence the insert (дополнить последовательность вставкой) до реклонирования гена. В данной области техники хорошо известно о многочисленных векторах экспрессии Escherichia coli, доступных для лигирования клонированного фрагмента, например, НВ101, JM109, BL21(DE3), ТОР10 для высокоуровневой гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков. Пары праймеров, используемые для клонирования в tag-нуклеотидную последовательность, могут быть сконструированы так, чтобы включать сайты рестрикции для последовательных шагов клонирования, которые содержат представляющий интерес ген с сайтом протеазного разрезания и аффинную метку.

US 5496801 сообщает о препаратах hPTH, которые демонстрируют стабильность при хранении в отношении состава и стабильности гормонов. US5496801 поддерживает лиофилизацию hPTH (1-84) с маннитолом в качестве криозащитного вещества и нелетучим цитратным буфером при значении рН в пределах от 3,5 до 6,5 с получением стабильной, готовой к использованию жидкой композиции для парентерального введения.

US4086196 впервые раскрывает, что все фрагменты РТН, больше чем 1-27 hPTH, и (Ala¹)-hPTH (1-27) обладают полезными биологическими свойствами, US4086196 по существу заявляет hPTH (1-Х) и Ala¹ hPTH (1-Х), в которых Х представляет собой Ser или Ala.

US4086196 также сообщает о синтезе hPTH (1-34) посредством твердофазного пептидного синтеза (SPPS) с помощью хорошо известных в данной области техники способов. К тому же US4086196 раскрывает восстановление биоактивного hPTH (1-34) с помощью гель- фильтрации с последующей ионообменной хроматографией на Whatman-СМ-52 и элюированием, выполняемым вслед за линейным градиентом, использующим ионы аммония в качестве противоионов. Основными ограничениями гель-фильтрационной хроматографии (GFC) являются медленное разделение и низкий пик разрешения, приписываемые некоторым факторам, включая неподходящий выбор матрицы, длину колонки, высокую скорость течения и большие мертвые зоны, захваченные в колонку. Однако GFC является действительно привлекательным вариантом для обессоливания и буферного обмена во время очистки пептидов и белков. К тому же химический синтез часто касается высокого риска и стоимости, и хотя, как ожидается, производство с помощью рекомбинантной генетической технологии заменит этот способ, выход продукта до сих пор является недостаточным. Более того, синтез требует использования методов, которые нуждаются в высоком уровне мастерства и компетенции. Таким образом, желательным является производство hPTH с применением методов рекомбинантных ДНК.

Вследствие простоты культивирования, низкой стоимости и высокого потенциала производства, Escherichia coli представляет собой предпочтительного хозяина для того, чтобы экспрессировать и очищать фармацевтически важные белки.

hPTH вследствие естественной неустойчивости, связанной с прямой экспрессией белка (Morelle et al., 1988, Biochim. Biophys. Acta 950, 459-462), используют стратегию химерного белка. Обычно используемые для экспрессии и нисходящей очистки данного белка слитые (химерные) партнеры включают β-галактозидазу, cro-β-галактозидазу, hGH, Trx и фосфорибулокиназу (Suzuki, Y et al, Appl.Env.Micro 1998, 64, 526-529, Wingender E et al., J. Biol. Chem 264, 4367-4373, Gardella TJ et al., J. Biol. Chem 26, 15854-15859, Xiang Yang Fu et al., Biotechnol. Prog 2005, 21, 1429-1435, WO/1999/005277, C12N15/62). К тому же количество аминокислот, которые были использованы из β-галактозидазы в качестве слитого партнера, было разным для разных белков. В случае инсулина и проинсулина (Shen, S-H. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4627-4631, Guo, L. (1984), Gene 29: 251-25) β-Gal слитый партнер был намного длиннее, чем РТН, на одинаковой задней части промотора (Т7 and lac promoter, Massayuki, Y et al., (1997), US5670340). Большое количество литературы сообщает об экспрессии химерного белка в виде нерастворимых агрегатов при проведении серии стадий денатурирования и повторного свертывания (рефолдинга). В случаях, когда β-галактозидазу использовали в качестве слитого партнера для РТН (1-34), сообщалось об окончательных выходах в пределах от 20 мг/л до 500 мг/л при использовании изопропил-бета-галактозида (IPTG) в качестве индуктора при концентрации 1 мМ. Однако использование IPTG для крупномасштабного производства рекомбинантных белков нежелательно из-за его высокой стоимости и токсичности (Donovan et al., 1996; Figge et al., 1988; Gombert и Kilikian, 1998; Ksinski et al., 1992). Oldenburg K.R., et al., (Protein Exp. Purification 5(3), 278-284. (1994)) описывает способ высокоуровневой экспрессии rPTH (1-34) в E.coli с помощью полигистидин лидерного пептида и восьми копий гена РТН. Oldenburg K.R., et al., также сообщает о «захвате» химерного белка с помощью никель-хелатной (Ni) хроматографии с последующим расщеплением бромцианом (CNBr) и очисткой с помощью RT-HPLC с конечным выходом 300 мг/л высокоочищенного биологически активного hPTH (1-34). Использование бромциана представляет собой экологическую опасность в отношении безопасного обращения и устранения, что жестко ограничивает его использование.

ЕР 794255 раскрывает очистку rhPTH (1-34) с использованием вырезания Кех2 из его химеры. Suzuki. Y, et al. (Applied и Environmental Microbiology 64(2), 526-529 (1998)) получили 0,5 г hPTH (1-34) с чистотой >99% из одного литра культуры Escherichia coli с использованием линкеров β-галактозидазы разной длины вместе с His-tag слитым партнером. Suzuki Y., et al. раскрывают выделение телец включения, солюбилизацию в 8М мочевине, разбавление до концентрации мочевины 3М с последующим Kex2 расщеплением, а затем промежуточную очистку с помощью ионообменной хроматографии, и наконец доочистку с помощью двух стадий обращенно-фазовой хроматографии. Suzuki Y. et al. сообщает, что Кех2, секреторный тип протеазы Кех2 из дрожжей, используемый для ферментативного расщепления, находится под значительным влиянием мочевины в концентрации 3М, необходимой для сохранения химерного белка в растворимой форме, даже добавление 2,5 мМ CaCl₂, чтобы подавить инактивацию, ведет к осаждению химерного белка, которое приводит к использованию молярного отношения 1:2000 фермента к субстрату. Suzuki Y. et al., таким образом все-таки сообщает о высоком выходе целевого белка, но применение Kex2 тем не менее несет ответственность за слишком большую часть первичной стоимости способа производства. Suzuki Y. et al., также подробно сообщает, что использование 97, 117 и 139 аминокислотных фрагментов β-галактозидазы как слитого партнера, разделенного линкером, имеющим SVKKR в качестве сайта расщепления для Kex2, отвечает за высокий выход химерного белка.

Jin. L., et al., J Biol. Chem. (2000), 275(35), 27238-27244) раскрывает способ очистки LY 333334 молекулы rhPTH (1-34) с помощью солюбилизации в 7М мочевине и очистке на обращенно-фазовой колонке, с последующей очисткой на FF SP катионообменной колонке с применением градиента NaCl, а затем методом RT-HPLC, в котором очищенное вещество в 20 мМ глициновом буфере с рН 9 высушивают сублимацией. Он представляет собой метод про-растворителя (pro-solvent method) и может быть опасным в промышленном масштабе. Fu, Xiang-Yang et al, (Biotechnology Progress (2005), 21(5), 1429-1435) сообщает способ очистки тиоредоксин-слияния РТН (1-34) из клеток BL21(DE3) посредством использования Тритона-Х 100 и термической денатурации, вызывающей частичную очистку осаждением. Нагревание проводят при 80°С в течение 15 минут. В данном способе белок обрабатывают при высокой температуре, которая является в целом нежелательной для протеинов и пептидов. CN 1417231 описывает способ восстановления рекомбинантното PTH (1-34) ферментацией, с последующей очисткой телец включения, ренатурацией, расщеплением тромбином и очисткой во время катионообменной хроматографии. CN 1424325 описывает GST химерный РТН (1-34) пептид (с GSP в качестве сайта расщепления) расщепленный тромбином, очистку на аффинной колонке с химотрипсином, расщепление с помощью пролинэндопептидазы и дополнительную хроматографическую очистку. Это трудоемкий способ, а использование двух протеаз увеличивает затраты на способ очистки, ограничивая его коммерческое использование. Biochem. Biophys. Res.Commun., 166, 50-60 (1990) documents а кДНК approach for the synthesis of hPTH.

Chen, J.Y. et al., ((2004), 40 (1), 58-65) раскрывает очистку РТН (1-34) путем экспрессии РТН (1-34) как химеры с целлюлоза-связывающим доменом, расщепления РТН (1-34) с помощью Фактора Ха, очистки с помощью целлюлозной смолы и RT-HPLC с выходом 3 мг/л, который представляет собой очень малопродуктивный способ, нежизнеспособный с коммерческой точки зрения. GST-химерная технология для производства РТН (1-34) также хорошо известна в данной области техники. Gram Hermann et al., (Bio/ Technology (1994), 12(10), 1017-23) описывает способ очистки РТН (1-34) с использованием дипептидилпептидазы IV. Wingender E., et al., (J Biol. Chem. (1989), 264(8), 4367-4373) экспрессировали РТН в E.coli как cro-β-галактозидаза-hPTH химерный белок. Выход из 1 л культуры составлял около 250 мг химерного белка, который они солюбилизировали в мочевине и затем использовали обработку кислотой для высвобождения РТН. Кислые условия расщепления досаждают ограничениями из-за образования дезаминированных или окисленных побочных белковых примесей, которые трудно отделить от некоторых белков и, кроме того, кислое значение рН представляет собой жесткие условия, вредные для биоактивности белка.

ЕР 0483509 В1 относится к кодон-оптимизированному синтетическому гену, производящему hPTH, соответствующий аминокислотной последовательности hPTH, содержащей его ДНК, клетке-хозяину, трансформированной данной DNA и способу получения hPTH с использованием трансформанта в E.coli с IPTG индукцией. ЕР0483509 В1 раскрывает очистку экспрессированного РТН с помощью RT-HPLC. Применение органических растворителей в качестве элюантов в RT-HPLC может повредить белок, что представляет собой масштабную проблему. US 5208041 сообщает о выработке по существу чистого hPTH, характеризуемого единичным пиком переноса при анализе с помощью капиллярного электрофореза при 214 нм, и величиной ЕС50 (как определено в UMR исследовании на аденилатциклазе со 106 основаниями) не больше чем 2 нМ при очистке сырого hPTH с помощью RT-HPLC с катионным агентом для образования пары ионов, например, таким как триэтиламинфосфат. US 5208041 также раскрывает обработку hPTH, полученного или из ткани млекопитающего, из микробных источников РТН или из синтетических источников, по меньшей мере одной стадией фракционирования на колонке до RT-HPLC. US 5208041 приводит пример способа очистки путем обработки всего бульона при рН от 4,0 до 8,0 ледяной уксусной кислотой, очищения центрифугированием, с последующей загрузкой в ионообменную хроматографическую колонку из S-сефарозы, дополнительной обработки элюата промежуточной стадией очистки путем загрузки в HIC-колонку из фенил-сефарозы и в заключение очистки с помощью RT-HPLC с использованием С18 колонки с триэтиламинфосфатом в качестве агента для образования пары ионов. US 5208041 упоминает обнаружение с помощью капиллярного электрофореза 4 раньше необнаруженных незначительных пиков, элюирующих впереди пика РТН, и нескольких замыкающих пиков, которые не были определены при использовании трифторуксусной кислоты (TFA) или гептафтормасляной кислоты (HFBA) в качестве агента для образования пары ионов, таким образом приводя к восстановлению по существу чистого hPTH. US 5208041 не сообщает об использовании каким-либо образом HIC в качестве окончательной стадии очистки для того, чтобы получить очищенный hPTH (1-34) с чистотой ≥99%, которая находится в фокусе настоящего изобретения. Патент США 5457047 относится к последовательностям ДНК, кодирующим варианты РТН, векторам экспрессии, бактериальным хозяевам, применениям и терапевтическим композициям, US 5457047 раскрывает очистку hPTH при помощи СМ-целлюлозы в периодическом способе с последующей RT-HPLC из cro-β-галактозидаза-hPTH химерного белка.

US 6590081 сообщает о синтезе чистой кристаллической формы терипаратида и способах получения и очистки фрагментированного РТН. US 6590081 подробно сообщает о преимуществе кристаллической формы гормона для чистоты продукта и стабильности хранения. Также, чтобы создать более эффективные и пригодные для орального применения аналоги РТН, подробная информация о структуре пептида должна способствовать описанию молекулярных взаимодействий между лигандом и рецептором. US 6590081 также раскрывает, что кристаллический РТН к тому же может быть включен в состав других композиций, таких как, например, таблетки, капсулы или суппозитории, например, то же самое легко растворяется в стерильном растворе в пузырьках. US 6590081 заявляет кубические, гексагональные и пластинчатые кристаллы hPTH (1-34) и способ очистки РТН для получения того же самого.

Liu, Q., et al., in Protein Expr Purif., 2007 Aug., 54(2): 212-9, раскрывает крупномасштабный способ получения hPTH (1-84) из E.coli с использованием стратегии растворимого химерного белка, путем конструирования кодон-оптимизированного синтетического гена, кодирующего hPTH (1-84), и клонирования того же самого в рЕТ32а (+) вектор, экспрессируемый в клетках Е.coli BL21 (DE3) как растворимый His(6)-тиоредоксин-hPTH (1-84) химерный белок. Liu, Q., et al., придерживается продолжения стадий очистки «захвата» путем аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов, с последующим энтерокиназным расщеплением, и в конце подвергая то же самое воздействию эксклюзионной хроматографии размеров с количественным выходом 300 мг/л с чистотой 99% после изъятия (сбора) растворимого химерного белка.

Замысел ортогонального способа основывается на полностью контролируемых способах очистки (Gagnon P. The secrets of Orthogonal Process Development. Validated Biosystems, 2006:www.validated.com/revalbio/pdffiles/orthopd.pdf). Идея заключается в том, что сочетание стадий с наибольшей комплементарностью должно обеспечить самую лучшую полную очистку. Сильнейший вариант осуществления идеи обычно достигается, когда соответствующие стадии основаны на разных механизмах разделения. Двухстадийный способ, который включает одну стадию фракционирования на основе размера продукта, и другую на заряде продукта может быть рассмотрен как ортогональный; подобным образом, способ с одной стадией на основе заряда продукта и другой на гидрофобности также может быть ортогональным. Важной особенностью дизайна ортогонального способа является то, что возможность очистки любой одной стадии измеряется только в рамках контекста его потенциального партнера.

Настоящее изобретение содержит ортогональный способ очистки rhPTH (1-34), сочетающий катионообменную хроматографию с HIC для того, чтобы добиться чистоты ≥99% с хорошим выходом.

Крупномасштабное производство терапевтических белков сталкивается с некоторыми проблемами, такими как короткие временные рамки развития, учет стоимости и даже увеличение требований к уровню качества. Уровень техники методов выделения и очистки, конкретно принципы ортогонального разделения, имеют огромное значение для того, чтобы ускорить развитие, уменьшить продолжительность обработки и сократить издержки производства. Препаративная хроматография значительно развита в отношении стабильности матрикса или наличия селективности и предоставляет главную технологию в очистке биомолекул до чистоты свыше 95%. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) приобретает популярность в последние годы, так как она предлагает возможности ортогонального разделения для широко используемых методов очистки на основе ионных взаимодействий. HIC часто является отличным выбором вслед за ионообменной хроматографией в процедуре очистки белка. Оба метода имеют чрезвычайно широкую применимость и являются каноническими подходами относительно друг друга (т.е. разделение в соответствии с гидрофобностью и зарядом, соответственно). Более того, вещество, элюируемое с солевым градиентом при ионообменном разделении, требует минимумальной обработки образца. С другой стороны, несмотря на проявление сходной селективности, HIC является менее денатурирующей по сравнению с обращенно-фазовой хроматографией, использующей более гидрофобные лиганды и органические растворители. В промышленном масштабе требуются взрывобезопасные производственные модули для обращения с токсическими органическими растворителями, размещение больших количеств которых дорого. Следовательно, ортогональный подход сочетания ионообменной хроматографии с последующей HIC является рентабельной, благоприятной с экологической точки зрения технологической платформой для крупномасштабного производства рекомбинантных химерных белков.

Вышеупомянутый предшествующий уровень техники ни сообщает точно ортогональный подход очистки hPTH (1-34) путем сочетания катионообменной хроматографии, как промежуточной стадии очистки с HIC в качестве конечной стратегии очистки, ни сообщает о применении нового способа индуцирования лактозой с хорошим выходом hPTH (1-34), который находится в главном фокусе настоящего изобретения.

Настоящее изобретение включает уникальный новый признак применения ортогонального подхода двухстадийного способа очистки, состоящего из катионообменной хроматографии необязательно с последующей препаративной хроматографией, выбранной из HIC или RT-HPLC. Настоящее изобретение раскрывает простой, рентабельный, благоприятный с экологической точки зрения способ получения высокочистого hPTH (1-34). Другим уникальным признаком настоящего изобретения является стратегия индуцирования лактозой при периодическом добавлении для получения оптимизированной экспрессии hPTH (1-34) у прокариотического хозяина. Другим признаком настоящего изобретения является создание гибридного химерного белка, состоящего из слитого (химерного) партнера, состоящего из 41 аминокислоты гена β-галактозидазы (LacZ) Escherichia coli, сайта эндонуклеазного расщепления, фрагмента гена rhPTH, в котором выбран слитый партнер, являющийся присущим гену β-галактозидазы Escherichia coli, с высоким содержанием % GC, соответствующей вторичной структурой пептида, the secondary structure of ribonucleotide translating the same и pI химерного фрагмента в качестве помощи, способствующей технологии производства.

Цели изобретения

Первым аспектом настоящего изобретения является способ синтеза rhPTH (1-34), включающий:

i. выделение общей РНК из тканевого источника,

ii. конструирование кДНК, кодирующей химерный нуклеотид ORF как NcoI/XhoI фрагмент, как указано в SEQ. ID NO.:1, путем амплификации кДНК с помощью RT-PCR с использованием ген-специфических праймеров, выбранных из SEQ. ID NO.:3, SEQ. ID NO.:4, SEQ. ID NO.:5, SEQ. ID NO.:6, SEQ. ID NO.:7 и SEQ. ID NO.:8, кодирующих rhPTH (1-34) химерный гибридный белок, как указано в SEQ. ID NO. 2,

iii. трансформацию Escherichia coli вектором экспрессии, содержащим химерный нуклеотид ORF как NcoI/XhoI фрагмент, как указано в SEQ. ID NO.:1, кодирующей rhPTH (1-34) гибридный химерный белок, как указано в SEQ. ID NO.:2, в которой гибридный химерный белок состоит из аффинного конца (affinity handle), слитого (химерного) партнера, сайта эндонуклеазного расщепления и пептида rhPTH (1-34),

iv. культивирование трансформированной Escherichia coli от стадии iii для экспрессии гибридного химерного белка в присутствии индуктора,

v. выделение гибридного химерного белка из культуры в форме телец включения,

vi. захват rhPTH (1-34) гибридного химерного белка стадии v,

vii. расщепление rhPTH (1-34) гибридного химерного белка стадии vi,

viii. очистку rhPTH (1-34), полученного посредством стадии vii с помощью ортогонального способа.

Второй аспект настоящего изобретения раскрывает применение индуцирования лактозой с низкой скоростью подачи для экспрессии гибридного химерного белка rhPTH (1-34), в котором индуцирование лактозой находится в пределах примерно от 10% до 30% общего белка.

Третий аспект настоящего изобретения представляет собой ортогональный способ очистки rhPTH (1-34), включающий:

i. захват солюбилизированного гибридного химерного белка, как указано в SEQ. ID NO.:2, с помощью хроматографии ЕВА (адсорбция на слой вспученного адсорбента),

ii. расщепление элюированного гибридного химерного белка стадии i с помощью эндопептидазы с выходом целевого белка,

iii. очистку целевого белка с помощью катионообменной хроматографии до чистоты ≥98%,

iv. необязательно доочистку целевого белка с помощью HIC или RT-HPLC до чистоты ≥99%.

Четвертый аспект настоящего изобретения раскрывает ортогональный способ очистки rhPTH (1-34), в котором солюбилизированный гибридный химерный белок улавливают на проточной хелатной сефарозной колонке при денатурирующих условиях, захваченный гибридный химерный белок расщепляют энтерокиназой при концентрации мочевины в пределах от 500 мМ до 4000 мМ в течение периода от 4 до 6 часов, расщепленный целевой белок очищают до чистоты ≥98% на SP-XL катионообменной колонке и элюированный целевой протеин необязательно доочищают с помощью HIC (хроматографии гидрофобного взаимодействия) на фенилсефарозе до чистоты ≥99%.

Пятый аспект настоящего изобретения представляет собой rhPTH (1-34) в жидкой форме, в котором rhPTH (1-34) не находится ни в кристаллической форме, ни в аморфной форме.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут видны после рассмотрения следующего подробного описания, которое включает многочисленные иллюстративные примеры осуществления на практике данного изобретения.

Краткое описание чертежей

Способ, с помощью которого могут быть достигнуты цели и преимущества изобретения, будет понятен более полно из подробного описания и сопроводительных чертежей, которые изложены ниже:

фиг.1 показывает анализ амплифицированного ПНР-продукта в 1% агарозном геле, где фрагмент 281 п.о., покрывающий lacZ часть ORF, и область 141 п.о., которая содержит соответствующие нуклеотиды аминокислот 1-34, показана на Дорожке 1. Эти фрагменты были дополнительно расщеплены до 281 п.о. с помощью NcoI/SalI (Дорожка 2) и до 141 п.о. с помощью SalI/XhoI (Дорожка 3). Дорожка 4: pET19b вектор после расщепления с помощью NcoI/XhoI и гель-очистка для применения клонирования, Дорожка 5: 100 п.о. DNA маркер (promega);

фиг.2 показывает минипрепарат ДНК (Miniprep DNA), расщепленной с помощью NcoI/XhoI, показывающий наличие позитивных клонов со вставкой представляющего для нас интерес фрагмента β-галактозидаза-hPTH (1-34) (LacZ). Дорожки 2-12 и 14: показывают полосу вставки 342 п.о. фрагмента 4) β-галактозидаза-hPTH (1-34) (показана стрелкой). Фрагмент вектора 5643 п.о. pET19b показан наверху (показан острием стрелки). Дорожка 13 подтверждает размер фрагмента вектора расщепленного NcoI/XhoI, который показывает отсутствие полосы вставки 342 и.о.;

фиг.3 показывает карту вставки рЕТ-β-галактозидаза-hPTH (1-34) в вектор рЕТ-19b;

фиг.4 показывает RE анализ с помощью NcoI/XhoI на позитивные клоны-трансформанты BL21(DE3), демонстрируя наличие расщепленного фрагмента, 342 п.о. (показан стрелкой). Дорожка 1: Gene roller ladder mix, Дорожка 2-13: Клон # 48 и 49. То же самое было сделано с другими позитивными клонами, упомянутыми на фиг.3;

фиг.5 показывает RE анализ с помощью NcoI/XhoI на позитивные клоны-трансформанты BL21(DE3), демонстрируя наличие расщепленного фрагмента, 342 п.о. (показан стрелкой). Дорожка I: Gene roller ladder mix. Дорожка 2-6: Клон #48 и 49. То же самое было сделано с другими позитивными клонами, упомянутыми на фиг.4;

фиг.6 показывает профиль питания и ферментации клона rhPTH (1-34);

фиг.7 показывает ферментный анализ экспрессии генов химерного rhPTH (1-34). Дорожка 1: маркер, Дорожка 2: неиндуцированный, Дорожка 3: индуцированный лактозой;

фиг.8 показывает ЕВА-хроматограмму с проточной хелатной сефарозой;

фиг.9 показывает Кумасси окрашенный SDS-PAGE профиль химерного rhPTH (1-34) с помощью проточной хелатной сефарозы на ЕВА. Дорожка 1: исходный материал, Дорожка 2: несвязанный (проскок), Дорожка 3: смыв. Дорожка 4: элюирование;

фиг.10 показывает Кумасси окрашенный SDS-PAGE анализ EK расщепления химерного rhPTH (1-34). Дорожка 1: нерасщепленный. Дорожка 2: EK расщепленный образец;

фиг.11 показывает ионообменную хроматограмму с использованием SP-XL колонки;

фиг.12 показывает анализ фракций ионообменной хроматографии с помощью гель-электрофореза. Дорожка 1: образец нагружен на IEX, Дорожка 2: FT, Дорожка 3: IEX элюирование;

фиг.13 показывает хроматограмму очистки rhPTH (1-34) с помощью HIC;

фиг.14 показывает RT-HPLC анализ фракции 1 хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC);

фиг.15 показывает хроматографический обращено-фазовый профиль rhPTH (1-34);

фиг.16 показывает анализ на чистоту rhPTH (1-34) с помощью RT-HPLC.

Подробное описание изобретения

Один вариант осуществления настоящего изобретения касается способа синтеза rhPTH (1-34), включающего:

i. выделение общей РНК из тканевого источника,

ii. конструирование кДНК, кодирующей химерный нуклеотид ORF как NcoI/XhoI фрагмент, как указано в SEQ. ID NO.:1, путем амплификации кДНК с помощью RT-PCR с использованием ген-специфических праймеров, выбранных из SEQ. ID NO.:3, SEQ. ID NO.:4, SEQ. ID NO.:5, SEQ. ID NO.:6, SEQ. ID NO.:7 и SEQ. ID NO.:8, кодирующих rhPTH (1-34) химерный гибридный белок, как указано в SEQ. ID NO. 2,

iii. трансформацию Escherichia coli вектором экспрессии, содержащим химерный нуклеотид ORF как NcoI/XhoI фрагмент, как указано в SEQ. ID NO.:1, кодирующей rhPTH (1-34) гибридный химерный белок, как указано в SEQ. ID NO.:2, в которой гибридный химерный белок состоит из аффинного конца, слитого (химерного) партнера, сайта эндонуклеазного расщепления и пептида rhPTH (1-34),

iv. культивирование трансформированной Escherichia coli от стадии iii для экспрессии гибридного химерного белка в присутствии индуктора,

v. выделение гибридного химерного белка из культуры в форме телец включения,

vi. захват rhPTH (1-34) гибридного химерного белка стадии v,

vii. расщепление rhPTH (1-34) гибридного химерного белка стадии vi,

viii. очистку rhPTH (1-34), полученного посредством стадии vii с помощью ортогонального способа.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения касается применения индуцирования лактозой с низкой скоростью подачи для экспрессии гибридного химерного белка rhPTH (1-34), в котором индуцирование лактозой находится в пределах примерно от 10% до 30% общего белка.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения касается ортогонального способа очистки rhPTH (1-34), включающего:

i. захват солюбилизированного гибридного химерного белка, как указано в SEQ. ID NO.:2, с помощью хроматографии ЕВА (адсорбция на слой вспученного адсорбента),

ii. расщепление элюированного гибридного химерного белка стадии i с помощью эндопептидазы с выходом целевого белка,

iii. очистку целевого белка с помощью катионообменной хроматографии до чистоты ≥98%,

iv. необязательно доочистку целевого белка с помощью HIC или RT-HPLC до чистоты ≥99%.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения касается ортогонального способа очистки rhPTH (1-34), в котором солюбилизированный гибридный химерный белок улавливают на проточной хелатной сефарозной колонке при денатурирующих условиях, захваченный гибридный химерный белок расщепляют энтерокиназой при концентрации мочевины в пределах от 500 мМ до 4000 мМ в течение периода от 4 до 6 часов, расщепленный целевой белок очищают до чистоты ≥98% на SP-XL катионообменной колонке и элюированный целевой протеин необязательно доочищают с помощью HIC (хроматографии гидрофобного взаимодействия) на фенил-сефарозе до чистоты ≥99%.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения касается rhPTH (1-34) в жидкой форме, в которой rhPTH (1-34) не находится ни в кристаллической форме, ни в аморфной форме.

Термин "кДНК" или комплементарная ДНК при использовании здесь относится к синтетической ДНК, транскрибированной со специфической РНК с помощью фермента обратная транскриптаза.

Термин "ORF" или открытая рамка считывания при использовании здесь относится к части генома организма, которая содержит последовательность оснований, потенциально кодирующих белок.

Термин "β-галактозидаза" и "LacZ" используются здесь как синонимичные термины.

Фраза "ген-специфические праймеры" имеет в виду праймеры, полностью комплементарные для гибридизации с целевым полинуклеотидом для синтеза удлиненного продукта праймера, который является комплементарным целевому полинуклеотиду.

Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) наносит минимальное структурное повреждение биомолекулам, и их биологическая активность сохраняется благодаря более слабому взаимодействию, чем при аффинной, ионообменной или обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ) (Fausnaugh et al., 1984; Regnier, 1987). HIC представляет собой альтернативный путь использования гидрофобных свойств протеинов при работе в более полярной и менее денатурирующей окружающей среде, чем при ОФХ, так как данная методика требует использования неполярных растворителей для элюирования белков из-за сильной связи с адсорбентом (E1 Rassi, 1996).

РТН представляет собой одноцепочечный пептид, состоящий из 84 аминокислот, у которого структурные требования в отношении полной биологической активности удовлетворяются первыми 34 NH₂-концевыми аминокислотами. Устранение некоторых аминокислот или из NH₂ или СООН конца активного фрагмента РТН (1-34) приводит к прогрессирующему спаду биологической активности, так что область непрерывной последовательности 2-26 определяется как минимальная последовательность, необходимая для биологической активности, как установлено посредством активации почечной аденилатциклазы. Rossenblatt, M. et al., подробно сообщает, что синтетический аналогичный (Nle-8, Nle-18, Tyr-34)bPTH-(3-34) амид, который включает модификации, показанные с bPTH (1-34) и для усиления биологической активности и придания устойчивости к окислению, будет ингибировать bPTH (1-84) активность, когда присутствует в эквимолярных количествах с нативным гормоном. Известные виды биологической активности РТН представлены во фрагменте, который включает только первые 34 аминокислоты (Tregear, G.W., Rietschoten, J.V., Greene. E., Keutmann, H.T., Niall, H.D, Reit, B., Parsons, J.A., и Potts, J.T., Jr.(1973) Endocrinology 93, 1349-1353)), a функция 50 остатков на карбоксильном конце неизвестна. Взаимодействие 1-34 РТН с его рецепторами изменяется и при окислении остатка метионина в положениях 8 и 18 (Tashjian, A.H., Ontjec, D.A., и Munson, P.L. (1964) Biochemistry 3, 1175-1182; Frelinger, A.L., III, и Zull, J.E. (1984) J.Biol.Chem. 259, 5507-5513; Frelinger, A.L., III, и Zull, J.E. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 244, 641-649) и при устранении аминокислот на амино-конце гормона (Martin, K.J., Bellorin-Font, E., Freitag, J., Rosenblatt, М., и Slatopolsky, E. (1981) Endocrinology 109, 956-959; Mckee, R.L., Goldman, M.E., Caulfield, M.P., deHaven, P.A., Lave, J.J., Nutt, R.F., и Rosenblatt, М. (1988) Endocrinology 122, 3008-3010; Goldman, M.E., McKee, R.L., Caulfield, M.P., Reagen, J.E., Levy, J.J., Gay, C.T., DeHaven, P.A., Rosenblatt, М., и Chorev, M. (1988) Endocrinology 123, 2597-2599). Окисленные пептиды являются полными агонистами со сниженной аффинностью (сродством) (Frelinger, A.L., III, и Zull, J.E. (1984) J. Biol.Chem. 259, 5507-5513; Frelinger, A.L., III, и Zull, J.E. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 244, 641-649), а пептиды с делециями на амино-конце являются частичными агонистами или антагонистами со сниженной аффинностью (Martin, K.J., Bellorin-Font, E., Freitag, J., Rosenblatt, М., и Slatopolsky, E. (1981) Endocrinology 109, 956-959; Mckee, R.L., Goldman, M.E., Caulfield, M.P., deHaven, P.A., Lave, J.J., Nutt, R.F., и Rosenblatt, М. (1988) Endocrinology 122, 3008-3010). Окисление остатка 8 имеет самое большое влияние на аффинность гормона, и делеция (устранение) остатков 1 и 2 вызывает самые драматические эффекты на биологическую активность. Таким образом, 3-34 РТН является очень слабым агонистом, а 7-34 фрагмент является антагонистом. Представляется, что или измененные остатки прямо вовлекаются в рецепторное связывание, или что окисление или устранение вызывает вторичные или третичные структурные изменения в пептиде, так что рецепторное связывание или активация станов