Виросомы, включающие гемагглютинин, выделенный из вируса гриппа, полученного в линии клеток, композиции, содержащие указанные виросомы, способы изготовления и применение

Виросомы, включающие гемагглютинин, выделенный из вируса гриппа, полученного в линии клеток, композиции, содержащие указанные виросомы, способы изготовления и применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к областям иммунологии и вакцинологии. В частности, изобретение относится к улучшенным виросомам, композициям, включающим виросомы, и их применению.

Предпосылки создания изобретения

Одной из первостепенных задач медицины является разработка современных вакцин для профилактики и эффективной доставки терапевтических веществ для лечения заболеваний. В настоящее время виросомы известны как везикулы, которые можно использовать в качестве средств для доставки антигенов и/или в качестве носителей терапевтических веществ.

Виросомы представляют собой комплексы, состоящие из липидов и как минимум одного белка вирусной оболочки, которые получают in vitro. Липиды либо выделяют из яиц или растений, либо получают искусственно, а часть липидов получают из того же вируса, из которого получен белок оболочки. В сущности, виросомы представляют собой восстановленные (реконструированные) пустые вирусные оболочки без нуклеокапсида, содержащего генетический материал вируса(вирусов)-источника. Виросомы не способны к самовоспроизведению и являются всего лишь пузырьками, обладающими способностью к слиянию. Функциональность таких виросом заключается в том, что активность их мембран в отношении слияния весьма сходна с требующей низких значений рН способностью интактного вируса вызывать слияние мембран, которую обеспечивает исключительно вирусный белок слияния. Как и вирусы, виросомы быстро интернализуются в клетки по механизму опосредованного рецепторами эндоцитоза или путем слияния с клеточной мембраной.

В основном, используемые виросомы представляют собой так называемые иммуностимулирующие реконструированные виросомы гриппа (IRIV). IRIV - это сферические однослойные пузырьки со средним диаметром 150 нм, состоящие из липидного бислоя, состоящего из фосфолипидов, в основном, фосфатидилхолинов (PC) и фосфатидилэтаноламинов (РЕ). Виросомы IRIV содержат функциональные гликопротеины вирусной оболочки - гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) вируса гриппа, встроенные в мембрану, представляющую собой фосфолипидный бислой.

Биологически активный гемагглютинин не только придает структурную стабильность и гомогенность составам, содержащим виросомы, но и вносит значительный вклад в иммунологические характеристики, поскольку обеспечивает сохранение способности вируса вызывать слияние. При необходимости, IRIV содержат молекулы гемагглютинина более чем одного штамма вируса и таким образом представляют собой химерные IRIV.

IRIV были разработаны путем внедрения гемагглютинина (НА, ГА) штамма вируса гриппа А в липосомы, состоящие из фосфатидилхолина. Гликопротеин гемагглютинин оболочки вируса гриппа специфичным образом направляет виросомы к антигенпрезентирующим клеткам (АПС) и опосредует слияние с их мембраной их эидосом. Данный процесс обеспечивает оптимальное процессирование и презентацию антигенов иммунокомпетентным клеткам. Происходит активация продуцирования цитокинов Т-лимфоцитами, что, в свою очередь, стимулирует продуцирование больших количеств специфичных антител В-лимфоцитами. Более того, также происходит стимуляция В-лимфоцитов в результате прямого взаимодействия с комплексом антиген-виросома.

Виросомы являются высокоэффективными системами адъювант/переносчик в современной вакцинации/терапии, обладающими отличными характеристиками в качестве средств доставки антигена и высоким иммуногенным потенциалом, в то же время позволяющими минимизировать риск возникновения побочных эффектов. Кроме того, виросомы обладают эффектом адъюванта (WO 92/19267), эффектом транс-адъюванта (заявка на европейский патент ЕР 05027624) и неспецифичным иммуностимулирующим (Европейский патент на изобретение ЕР 06027120) эффектом.

Более 50 лет противогриппозные вакцины производили в клетках куриных эмбрионов. Тем не менее, традиционная стандартная методика чрезвычайно длительна и трудоемка. В настоящее время производство вакцин в эмбрионах занимает до 9 месяцев с момента выделения нового идентифицированного штамма вируса до получения конечного продукта. Это может затруднить решение неожиданных проблем, таких как выявление пандемичных штаммов, неудачи при производстве и сезонные изменения штаммов вируса гриппа. Более того, традиционная методика на основе эмбрионов требует огромных количеств яиц, переноса вирусного изолята в яйца и дополнительной очистки для уменьшения количества примесей эмбриональных белков и минимализации риска возникновения аллергии на альбумины яиц.

Способ, основанный на использовании клеточных линий, является более быстрым и гибким в отношении размножения вирусов и позволяет получать штаммы, которые не удается эффективно выращивать в куриных эмбрионах (например, Гонконгский грипп птиц в 1997). Кроме того, использование линий клеток при получении вирусов имеет некоторые преимущества с точки зрения безопасности получаемой вакцины: вакцина не содержит добавок антибиотиков, нет необходимости в токсичных консервантах (таких, как тиомерсал), уровень эндотоксинов понижен, исключено возникновение аллергии на яичные белки, рост вирусов происходит в среде, не содержащей белка и сыворотки (нет вспомогательных агентов/BSE), высока степень очистки вакцины.

В последнее время значительные усилия были направлены на разработку систем культур клеток для производства вакцин. Большая часть упомянутых систем основана на линиях клеток млекопитающих, таких как клетки Vero, MDCK, BHK и PerC6. Опубликовано несколько сообщений о разработке вакцин в культурах клеток млекопитающих. Тем не менее, существенным недостатком противовирусных вакцин, полученных в упомянутых культурах клеток, является риск возникновения аутоиммунных реакций к белкам клеток млекопитающих.

Процесс слияния виросом необходим для эффективной доставки антигенов/лекарственных средств (Schoen P и др., 1999). Соответственно, существует необходимость в разработке способа получения виросом с улучшенными характеристиками фузогенности (способности к слиянию) и иммуногенности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение решает указанную задачу путем создания новых виросом, содержащих гемагглютинин вируса гриппа, полученного в линиях клеток птиц. Такие новые виросомы характеризуются как повышенной способностью вызывать слияние и повышенной иммуногенностью по сравнению с виросомами, содержащими гемагглютинин вируса гриппа, полученными стандартным методом в куриных эмбрионах.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к виросомам, содержащим гемагглютинин, причем гемагглютинин выделен из вируса гриппа, полученного в линии клеток птиц.

«Линия клеток птиц» в контексте настоящего изобретения - это культура клеток, выбранная по признаку однородности из популяции клеток, полученной из, как правило, гомогенной ткани птицы (такой, как орган). Данный термин не включает яйца птиц, такие как, например, куриные. Таким образом, «гемагглютинин, выделенный из вируса гриппа, полученного в линии клеток птиц», означает, что гемагглютинин выделен из вирусов, выращенных в культуре клеток птицы, а не из вирусов, выращенных в яйцах (куриных эмбрионах). Предпочтительные линии клеток птиц включают, но не ограничиваются перечисленными, первичные линии клеток, такие как фибробласты куриных эмбрионов (CEF); постоянные/иммортализованные линии клеток, например, DF-1 (US 5672485), PBS (US 5989805) и HD11.

Кроме того, настоящее изобретение относится к виросомам, содержащим гемагглютинин, причем способность к слиянию указанных виросом как минимум на 50% выше, чем способность к слиянию виросом, содержащих гемагглютинин, выделенный из вирусов гриппа, выращенных в куриных эмбрионах, и имеющий ту же первичную структуру, или пептидную последовательность. Согласно предпочтительному варианту осуществления виросомы согласно настоящему изобретению обладают значительно более высокой иммуногенностью, чем виросомы, содержащие гемагглютинин, полученный из вирусов гриппа, выращенных в куриных эмбрионах. В предпочтительном случае способность к слиянию виросом согласно настоящему изобретению как минимум на 30% выше способности к слиянию виросом, содержащих гемагглютинин, выделенный из вирусов гриппа, выращенных в клетках млекопитающих.

Неожиданно оказалось, что качество способности виросом к слиянию зависит от процесса выращивания вируса гриппа, из которого получают виросомы. Согласно предпочтительному варианту осуществления гемагглютинин, входящий в состав виросомы, выделяют из вирусов гриппа, полученных в клеточной линии. Предпочтительно гемагглютинин выделяют из вирусов гриппа, выращенных в линии клеток птиц.

Заявка на патент WO 2006/108846 (автор Vivalis) относится к использованию стволовых клеток эмбриона птицы, предпочтительно линии клеток ЕВх, для получения вирусных векторов и вирусов. Однако в WO 2006/108846 не содержится ни предпосылок для использования в виросомах гемагглютинина, полученного из вирусов, выращенных в линиях клеток.

Виросома может представлять собой химерную виросому, в которой когда гемагглютинин выделен из, по меньшей мере, двух разных штаммов вируса гриппа. Кроме того, виросома может быть лиофилизирована. В предпочтительном варианте осуществления изобретения виросома нагружена антигеном. В более предпочтительном варианте виросома согласно настоящему изобретению остается ненагруженной/пустой.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к композициям, включающим виросому согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления, указанная композиция представляет собой вакцину. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция является иммуногенной и дополнительно включает липосому и как минимум одну молекулу антигена. В предпочтительном случае указанная по меньшей мере одна молекула антигена заключена в липосому. внедрить по меньшей мере одну молекулу антигена в липосому.

Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к применению виросом согласно настоящему изобретению в качестве средства доставки антигена в фармацевтической композиции для получения иммунного ответа против антигенов различного происхождения. Виросомы согласно настоящему изобретению также можно применять для получения фармацевтических композиций для вакцинации или иммунизации. Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим виросомам, не нагруженным антигеном. Соответственно, настоящее изобретение относится к применению виросом согласно настоящему изобретению в качестве неспецифичных иммуностимулирующих агентов для получения фармацевтических композиций для стимуляции эффективного иммунного ответа против антигенов различного происхождения. Наконец, изобретение относится к применению виросом согласно настоящему изобретению в получении фармацевтических композиций для лечения или предотвращения заболевания или нарушения.

Согласно другому аспекту данное изобретение относится к наборам, включающим виросому или композицию согласно настоящему изобретению.

Следующий аспект включает способ вакцинации или иммунизации пациента виросомами или композициями согласно настоящему изобретению, включающий собой введение указанных виросом или композиций пациенту для стимуляции иммунного ответа. Также в настоящее изобретение включает способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения (такого как инфекционные заболевания и/или злокачественные опухоли) у пациента с использованием виросом или композиций согласно настоящему изобретению, включающий введение указанных виросом или композиций указанному пациенту.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения виросом согласно настоящему изобретению, включающему этапы обработки целого вируса гриппа детергентом или короткоцепочечным фосфолипидом, отделение фракции, содержащей гемагглютинин, и удаление детергента, в результате чего происходит восстановление (формирование) виросомы. В качестве альтернативы, этап отделения может осуществлять путем добавления фосфолипидов. Настоящее изобретение также относится к виросомам, полученным упомянутым способом.

Краткие описания графических материалов

На фиг.1 показан Вестерн-блот анализ препаратов виросом с использованием гемагглютинина из линии инфицированных штаммом Новая Каледония гриппа А куриных клеток (полосы 1 и 4), утиных клеток (полосы 2 и 5) или вируса, полученного путем размножения в оплодотворенных яйцах (полосы 3 и 6). Блот А был получен с использованием специфичной в отношении вируса гриппа А поликлональной сыворотки кролика, блот В был получен с использованием моноклональных антител, распознающих определенный эпитоп на субъединице НА 1 гемагглютинина.

На фиг.2 показана способность к слиянию виросом гриппа. Верхняя часть: Графическое изображение способности к слиянию, результаты приведены в Таблице 2, Эксперимент 2, Пример 4.5. Нижняя часть: Соотношение способности к слиянию виросом гриппа, выделенных из клеток и из яиц. Столбики представляют средние соотношения активности образцов при различных разбавлениях, соответствующих концентрации гемагглютинина, от 1 до 6 мкг/ в общем объеме, равном 0,8 мл.

Фигуры 3 и 4 иллюстрируют результаты исследования иммуногенности на мышах. Согласно фиг.4 видна повышенная иммуногенность виросом, содержащих гемагглютинин, выделенный из вируса гриппа, полученного в линии клеток птиц, и содержащих гетерологичный антиген (UK39). Фиг.3А показывает, что источник вируса (линия клеток/культура клеток или яйцо), использованный для получения виросом согласно изобретению, не оказывает значительного влияния на титр антител к гемагглютинину, выделенному из яиц, после одной иммунизации. Фиг.3В демонстрирует повышенную иммуногенность гемагглютинина: более высокий титр антител к гемагглютинину, выделенному из ЕВх, после первой иммунизации виросомами, содержащими гемагглютинин, полученный из вирусов, полученных в клетках Евх. На фиг.4 показаны индивидуальные титры антител, специфичных к гетерологичному антигену UK39. Результаты получены путем вычисления степени разбавления, соответствующей величине оптической плотности, равной 20% максимальной оптической плотности - значение для контрольной сыворотки, присутствующей в каждом планшете. В показанном примере разницу, которую наблюдали между виросомами, содержащими гемагглютинин, выделенный из вирусов, полученных в яйцах, и виросомами, содержащими гемагглютинин, выделенный из вирусов, полученных в линиях клеток, в отношении иммуногенности гетерологичного антигена UK39, была значительной: р=0.002 для линии куриных клеток в сравнении с яйцами и р=0.009 для культуры клеток утки в сравнении с яйцами, с использованием критерия Вилкоксона.

На фиг.5 показана повышенная индукция CD8+ Т-лимфоциток, специфичных к гетерологичному антигену (не гемагглютинину) виросомами, содержащими гемагглютинин, выделенный из вирусов, полученных в линии клеток птиц и нагруженных гетерологичным антигеном, в сравнении с виросомами, содержащими гемагглютинин из вирусов, выделенных из яйца.

Подробное описание изобретения

Определения

В настоящем описании термин «виросома» относится к пузырьку (везикуле), полученному в результате процедуры in vitro и состоящему из липидов и, по меньшей мере, одного белка оболочки вируса. Липиды либо выделены из биологического источника (например, яиц, растений, животных, культур клеток, бактерий, вирусов и т.д.), либо получены синтетически (химический синтез). Виросома может представлять собой восстановленную оболочку вируса, которая может быть получена из различных вирусов и которая не содержит инфекционные нуклеокапсиды и генетический материал вируса-источника, например, иммуностимулирующая реконструированная виросома гриппа (IRIV). Таким образом, виросома представляет собой особый тип липидных везикул, состоящих из липидной мембраны и, по меньшей мере, одного белка оболочки вируса. Термин «белок оболочки вируса» в настоящем описании относится к любому белку, кодируемому оболочечным вирусом, из которого полностью или частично получены виросома согласно настоящему изобретению и который присутствует в липидной мембране виросомы. Белки оболочки вируса иногда выполняют функцию «белков слияния вируса» (фузионные белки), в случае когда они участвуют в слиянии вирусов или виросом с мембранами клеток-мишеней.

Виросома согласно настоящему изобретению может содержать больше одного типа белка оболочки. Источником указанных дополнительных белков, содержащихся в мембране виросомы, необязательно происходят от оболочечных вирусов, может быть любой живой организм (включая микроорганизмы, такие, как бактерии, грибы или паразиты).

Белки оболочки могут быть рекомбинантными белками, при условии, что их биохимические свойства допускают физическое присоединение к липидной мембране. Такие белки оболочки ответственны за функциональность виросомы.

В отличие от вирусных систем виросомы безопасны, поскольку инфекционный нуклеокапсид вируса удален. В настоящее время виросомы, в основном, применяют в качестве вакцин после внедрения антигена в поверхность или в полость виросом. В отличие от вирусоподобных частиц виросомы не формируются самопроизвольно в процессе рекомбинантной экспрессии белка в подходящей экспрессионной системе, а являются продуктом контролируемого процесса in vitro, обеспечивающего крупномасштабное промышленное производство виросом.

В настоящем описании термин «средство доставки антигена» относится к виросоме, содержащей один специфичный для определенного заболевания антиген, помещенный в полость виросомы или встроенный в ее поверхность.

В настоящем описании термин «способность к слиянию» (фузионная активность) относится к способности виросомы к слиянию с клеточной и/или синтетической мембраной. В то время как in vivo виросомы сливаются с наружной мембраной клетки или с мембраной эндосомы, слияние с липосомами является признанной моделью системы для определения способности к слиянию виросом in vitro (Smith, J M и др., 2003). Показано, что слияние вируса гриппа и виросом с липосомами обладает характеристиками, близкими к слиянию с биологическими оболочками мишеней (Stagmann, T. и др., 1989).

Термин «мембрана клетки» (клеточная мембрана) в настоящем описании относится к биологической мембране, присутствующей в клетках в естественных условиях, такой как наружная клеточная мембрана или мембрана эндосом внутри клеток. Термин «синтетическая мембрана», напротив, относится к искусственным мембранам, таким как липидные мембраны липосом. Примером синтетических мембран являются мембраны липосом, состоящие только из фосфатидилхолина (ФХ) и ДПФГ (дипальмитилфосфатидилглицерина) и не содержащие белков, обычно присутствующих в клеточных мембранах.

Способность к слиянию вирусов и виросом обычно измеряют методом флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) (Struck DK и др., 1981). В данном методе используется фотофизический процесс, вызывающий уменьшение флуоресценции одного элемента (донора) путем передачи энергии возбуждения другому элементу (акцептору) без излучения. Необходимо, чтобы спектр испускания донора перекрывал спектр поглощения акцептора. Эффект уменьшения флуоресценции напрямую зависит от расстояния между двумя молекулами: каждое событие, вызывающее некоторое изменение расстояния между молекулами, подавляет эффект гашения (уменьшения флуоресценции), в результате чего происходит высвобождение энергии, которое может быть измерено. Таким образом, данный метод представляет собой ценный in vitro тест для изучения многих биологических явлений, таких как слияние вирусных частиц и биологических клеточных мембран. Были разработаны различные методы изучения слияния, основанные на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET) для демонстрации способности к слиянию вирусных мембран (вирусов или виросом) с липосомами или «тенями» эритроцитов (пустыми эритроцитами) in vitro (Smit JM и др., 2003). Некоторые из этих методов включают мечение мембран мишеней (липосом), другие - мечение исследуемых образцов, а именно вирусов или виросом. Тем не менее, необходимость мечения исследуемого образца несовместимо с контролем качества фармацевтической продукции по цГМФ. Более чувствительный тест для определения слияния, основанный на флуоресцентном резонансном переносе энергии без мечения исследуемых образцов, был разработан компанией Pevion Biotech (Amacker M. и др., 2005).

Способность к слиянию виросом согласно настоящему изобретению может быть измерена методом флюоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), как описано в примерах ниже. Чтобы определить, повышена ли способность к слиянию виросом согласно настоящему изобретению по сравнению с другими виросомами, выполняют следующие этапы: (а) измерение способности к слиянию виросом, содержащих различные количества гемагглютинина, выделенного из вирусов, полученных в линии клеток, и соответствующей виросомы, содержащей такое же количество гемагглютинина, выделенного из вирусов, полученных в яйцах; (b) определение отношения значений способности к слиянию, определенных на этапе (а) (т.е. виросомы, содержащей гемагглютинин из линии клеток, и виросомы, содержащей гемагглютинин из яйца); и (с) усреднение полученных отношений. Таким образом, для сравнения значений способности к слиянию необходимо сделать несколько измерений с разным количеством гемагглютинина для каждого типа виросом. Согласно предпочтительному варианту осуществления способность к слиянию измеряют для виросом, содержащих 3-6 мкг в общем объеме 0,8 мл. Пример вычислений приведен в подразделе 4.5 раздела Примеры ниже. Способность к слиянию рассматриваемой виросомы «на 50% выше», если упомянутое среднее отношение имеет значение ≥1.5.

В настоящем описании термин «иммуногенность» относится к способности определенного вещества (антигена) вызывать иммунный ответ. Чтобы определить, обладает ли виросома согласно настоящему изобретению повышенной (т.е. улучшенной), субъекта иммунизируют виросомой или композицией согласно настоящему изобретению, содержащей гемагглютинин или гемагглютинина в комбинации с дополнительным специфичным (гетерологичным) антигеном, и измеряют титр антител к гемагглютинину или указанному антигену в сыворотке указанного субъекта. Для сравнения, другого субъекта иммунизируют аналогичной виросомой, содержащей гемагглютинин, выделенный из вирусов, полученных в яйце. Виросома обладает «значительно улучшенной» или «значительно повышенной» иммуногенностью, если в применение критерия Вилкоксона к титрам антител к виросомам согласно настоящему изобретению (с гемагглютинином, выделенным из вирусов, полученных в линии клеток) и виросом с гемагглютинином, выделенным из вирусов, полученных в яйце, дает р-значение ниже 0,05. Пример расчетов приведен в подразделе 5.1 раздела Примеры ниже.

Термины «выделенный из линии клеток», «полученный в линии клеток», «продуцированный в линии клеток» взаимозаменяемы и означают, что что-либо получено или произведено в линии клеток или культуре клеток.

Термин «нагруженный антигеном» в настоящем описании относится к виросомам, содержащим дополнительный антиген, отличный от гемагглютинина (то есть «гетерологичный антиген» или «антиген, отличный от гемагглютинина»). Антиген может быть внедрен в виросому (например, внутрь полости), адсорбирован на/связан с поверхностью виросомы, интегрирован в липидную мембрану виросомы и т.п. Виросома с внедренным антигеном может быть использована как средство доставки антигена.

В настоящем описании термин «химерная виросома» относится к виросоме, содержащей гемагглютинин, полученный из по меньшей мере двух различных штаммов вируса гриппа.

В настоящем описании термины «ненагруженный» или «пустой» применительно к виросомам взаимозаменяемы и обозначают тот факт, что характеризуемые таким образом хромосомы не содержат специфичных для какого-либо заболевания антигенов полости и не несут таких антигенов в липидном бислое. Таким образом, «ненагруженные» или «пустые» виросомы содержат только окружающий раствор внутри полости и не содержит белка, за исключением белка гемагглютинина вирусной оболочки и возможных следов нейраминазы, в мембране.

В настоящем описании термины «терапевтический», «терапия», «лечение» и т.п. относятся к действиям, направленным против уже присутствующего заболевания или нарушения или заболевания или нарушения, в отношении которого предполагают, что оно уже присутствует, независимо от того, проявились ли соответствующие симптомы. В этом случае «лечение» или «терапия» относятся к устранению заболевания или нарушения или, по меньшей мере, снижению выраженности симптомов заболевания или нарушения; при этом, если симптомы уже присутствуют, их смягчают, а если симптомы отсутствуют, снижают тяжесть возникающих симптомов или полностью их устраняют. Термины «профилактический», «профилактика», «предотвратить», «предотвращение» в настоящем описании относятся к действиям, предпринимаемым для того, чтобы предотвратить возникновение заболевания у субъекта в случае, если нет подозрения, что в прошлом у данного субъекта уже было указанное заболевание, но предполагают, что субъекту угрожает или будет угрожать опасность возникновения указанного заболевания. Кроме того, указанные термины относятся к предотвращению заболевания, в случае, если пациент уже подвергся соответствующей вакцинации/иммунизации, эффект от которой, тем не менее, недолгосрочен.

В настоящем описании термин «фармацевтический» относится к характеристикам веществ и/или лекарственных препаратов, которые обеспечивают возможность из введения живому животному, предпочтительно человеку.

Термины «потенцирующий», «иммунопотенцирующий», «стимулирующий», «иммуностимулирующий» и т.п. в настоящем описании относятся к веществу или усиливающему влиянию на иммунные функции, которые могут обеспечить разрушение или выведение антигенсодержащих патогенов или злокачетственных новообразований и/или к возникновению иммунитета к ним.

В настоящем описании термин «неспецифический» или «неспецифичный» относится к общей иммуностимулирующей активности виросомы согласно настоящему изобретению и означает, что происходит стимуляция способности иммунной системы предотвращать, противостоять и/или устранять любое из многих заболеваний или нарушений, а не какое-то одно конкретное. Специфическая иммуностимулирующая активность, напротив, относится к стимуляции способности иммунной системы предотвращать, противостоять и/или устранять одно конкретное заболевание. Так, вакцинация против какого-либо конкретного заболевания является примером достижения специфической иммуностимулирующей активности.

Термин «заболевание» или «нарушение» в данном описании относится к аномальному состоянию тела или психики, вызывающему неудобство. Заболевания и нарушения делятся на инфекционные, неинфекционные, неопластические, иммунные или метаболические.

Вирусы гриппа

Вирусы гриппа (Orthomyxoviridae) - это оболочечные РНК-вирусы с РНК, представленной отрицательной цепью, и сегментированным геномом. Вирусы гриппа делят на два рода: первый включает вирусы гриппа А и В, второй включает вирус гриппа С. Такое деление основано на значительных антигенных различиях в их нуклеопротеинах и белках мутрикса. Также указанные три типа вирусов различаются по патогенности и организации генома. Тип А встречается у многих теплокровных животных, а типы В и С являются преимущественно патогенами человека. Вирусы гриппа А далее разделяют по антигенным характеристикам гликопротеинов оболочки гемагглютинина и нейраминидазы, выступающих над поверхность вириона. В настоящее время выделяют 15 подтипов гемагглютинина и 9 подтипов нейраминидазы. Вирусы гриппа А поражают много видов животных, включая птиц, свиней, лошадей, людей и других млекопитающих. Водоплавающие птицы являются естественным резервуаром для всех известных подтипов гриппа А и, возможно, источником генетического материала для появления штаммов, вызывающих пандемии гриппа у людей.

Вирусы гриппа накапливают точечные мутации во время репликации, поскольку в их комплексе РНК-полимеры отсутствует механизм устранения ошибок. Мутации, при которых происходят изменения аминокислот в антигенных участках оболочечных гликопротеинов, могут обеспечить селективные преимущества штамму вируса, заключающееся в избегании существующего иммунитета. Гемагглютинин является основной антигенной детерминантой вируса гриппа, которую распознают и связывают нейтрализующие антитела. Молекула гемагглютинина инициирует инфекцию путем связывания с рецепторами (остатками сиаловой кислоты) на определенных (респираторных) клетках хозяина.

Молекула гемагглютинина состоит из двух различных доменов: корневая структура, выступающая на поверхности вириона и состоящая из НА2 и части НА1 полипептида НА, и глобулярная головка, полностью состоящая из НА1.

Антитела к белку НА ингибируют связывание с рецептором и являются очень эффективными в предотвращении повторного заражения тем же штаммом. Гемагглютинин может ускользнуть от существующего иммунитета благодаря дрейфу антигенов, при котором мутации уже имеющегося гена гемагглютинина препятствуют связыванию антителами, и антигенному сдвигу, при котором вирус приобретает гемагглютинин нового подтипа. Такого рода изменения в большей степени характерны для гемагглютинина, чем для нейраминидазы. Изменения в других белках вируса гриппа происходят гораздо реже. Влияние антигенного дрейфа наиболее выражено у штаммов гриппа, поражающих человека, менее характерно для штаммов, инфицирующих свиней и лошадей, и и в наименьшей степени присуще штаммам, поражающим птиц.

Штаммы гриппа могут быть охарактеризованы генетически путем сравнения отдельных сегментов генов.

В то время как разработка вакцин против штаммов гриппа, вызывающих ежегодные эпидемии, продолжается, мир озабочен угрозой пандемий гриппа. Власти и медицинские службы во всем мире сегодня заняты разработкой стратегий по подготовке к борьбе с пандемической формой гриппа.

Виросомы

Виросомы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для доставки соединения (например, иммуногенной молекулы, лекарственного средства и/или гена) в клетку-мишень. В сравнении с липосомами виросомы обладают преимуществом возможности эффективно проникать в клетку, которую обеспечивает белок оболочки вируса, и с последующим высвобождением содержимого виросомы в клетку. Более того, если в мембрану виросомы встроены некоторые активные белки оболочки вируса, такие виросомы могут высвобождать содержимое в цитоплазму сразу после слияния с клеткой, что позволяет избежать разрушения лекарственного средства в кислой среде эндосомы.

Виросомы согласно настоящему изобретению особенно полезны в области вакцинации, когда задача состоит в стимуляции иммунного ответа на антиген, ассоциированный с конкретным заболеванием или нарушением. В таких случаях антиген обычно инкапсулирован в или связан с виросомой, которая доставляет этот антиген иммунной системе хозяина, которого подвергли вакцинации. Благодаря данному конкретному антигену достигнутое профилактическое и/или терапевтическое действие обязательно будет специфичным в отношении заболевания или нарушения, с которым ассоциирован которому данный антиген.

Кроме того, виросомы могут быть одновременно нагружены несколькими различными эпитопами В- и Т-лимфоцитов (Pδltl-Frank и др. (1999)), включая универсальные эпитопы Т-хелперов (Kumar и др. (1992)) и другие, известные специалистам в данной области. Таким образом, виросомы являются высокоэффективными адъювантами в современной вакцинации, обладающими прекрасными характеристиками в качестве средства доставки антигенов и высоким иммуногенным потенциалом, в то же время минимизирующими риск побочных эффектов.

Функциональность иммуностимулирующих реконструированных виросом гриппа (IRIV) проявляется в том, что их способность к слиянию мембраны в большой степени сходна с хорошо известной, зависимой от низкого рН способности к слиянию мембран интактного вируса, обеспечиваемой исключительно белком оболочки вируса. Как и вирусы, виросомы гриппа быстро интернализуются по механизму рецепторопосредуемого эндоцитоза или опсонизации. В отличие от вирусных систем виросомы безопасны, поскольку из них удален инфекционный нуклеокапсид вируса. Таким образом, виросомы согласно настоящему изобретению являются многообещающими транспортными системами для доставки широкого спектра различных соединений, заключенных во внутренней среде внутри виросом, в водной среде внутри виросомы или встроенных в ее мембрану. Совместное внедрение различных рецепторов в мембрану виросом обеспечивает нацеливание виросом в различные клетки и ткани. В основном, виросомы используют в качестве вакцин после связывания антигена с их поверхностью, или после инкапсуляции антигена в полость виросомы, или используют их адъювантный эффект в случае введения в комбинации с липосомами, связанными с антигеном.

IRIV реконструируют из оболочки вируса гриппа и используют рецептор-опосредуемый эндоцитоз, как и их вирусные аналоги. Медиатором связывания вируса гриппа с рецепторами и его слияния с мембраной эндосомами считается основной гликопротеин оболочки вируса - гемагглютинин (Bungener и др. (2002)). Как и в случае с вирусными векторами, слабокислый рН полости эндосомы запускает механизм слияния мембран виросомы и эндосомы и высвобождение инкапсулированного материала, такого как ДНК, РНК или белки, в цитоплазму клетки. Соответственно, экзогенные антигены, инкапсулированные в виросоме, достигают пути главного комплекса гистосовместимости I (ГКГС I) без необходимости синтеза белка de novo. В процессе слияния белки, присутствующие на поверхности виросом, остаются в полости эндосомы и поэтому, по всей видимости, становятся доступными для пути ГКГС I.

Показано, что коммерчески доступные вакцины на основе виросом (INFLEXAL^® V, EPAXAL^®) весьма эффективны и безопасны (Gluck R. и др. (2000)). Потенциал виросом в качестве систем доставки был продемонстрирован для вакцин на основе нуклеиновых кислот и белков, например, в случае малярии (Pőltl-Frank и др. (1999)). По результатам недавних исследований также можно заключить, что вакцины, содержащие синтетические пептиды и вводимые подкожно с использованием виросомам, способны индуцировать эффективный цитотоксический иммунный ответ (Amacker и др. (2005)).

Получение виросом

Получение виросом - процедура, хорошо знакомая специалистам в данной области. Применяемые методики получения виросом описаны, например, в ЕР 538437 и в Mischler and Metcalfe (2002).

Виросомы согласно настоящему изобретению могут быть реконструированы из липидов вирусной мембраны и белков после солюбилизации вируса гриппа октаэтиленгликоль-монододециловым эфиром, седиментации нуклеокапсида (вирусные гликопротеины и липиды остаются в верхней фракции) и удаления детергента из верхней фракции гидрофобной смолой (Bio-Beads SM2). Способы получения гриппозных виросом описаны в WO 92/19267, виросом других представителей семейства - в WO 04/071492.

Получение виросом, содержащих гемагглютинин, выделенный из разных штаммов вируса гриппа, может быть осуществлено путем использования равных количеств белков этих вирусов, солюбилизированных неионным детергентом октаэтиленгликоль-монододециловым эфиром. После удаления детергента смолой Bio-Beads SM2, становится возможным образование виросом, содержащих разные типы белков оболочки.

Протоколы получения виросом, содержащих материал, полученный из куриных яиц и из клеточных линий, идентичны.

Подтипы вируса гриппа, из которых могут быть получены виросомы согласно настоящему изобретению, включают грипп H1N1, грипп H1N2, грипп H2N2, грипп H3N2, грипп H3N8, грипп H5N1, грипп H5N2, грипп H5N3, грипп H5N8, грипп H5N9, грипп H7N1, грипп H7N2, грипп H7N3, грипп H7N4, грипп H7N7, грипп H9N2 и/или грипп H10N7. Кроме того, по меньшей мере, один белок оболочки вируса может быть получен из следующих штаммов: А/Бангкокский/1/79, гри