Способы усиления деградации или превращения целлюлозного материала

Способы усиления деградации или превращения целлюлозного материала

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Заявление относительно прав изобретений, выполненных в соответствии с федерально финансируемым исследованием и развитием

Это изобретение было выполнено при поддержке Правительства согласно NREL Subcontract No. ZCO-30017-02, Prime Contract DE-AC36-98GO10337, присужденному Министерством электроэнергии. Правительство имеет определенные права в этом изобретении.

Уровень техники

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способам деградации или превращения целлюлозного материала и получения вещества из целлюлозного материала.

Описание известного уровня техники

Целлюлоза является полимером простого сахара глюкозы, ковалентно связанного бета-1,4-связями. Многие микроорганизмы продуцируют ферменты, которые гидролизуют бета-связанные глюканы. Эти ферменты включают в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и бета-глюкозидазы. Эндоглюканазы расщепляют полимер целлюлозы в случайных местоположениях, раскрывая его для атаки целлобиогидролазами. Целлобиогидролазы последовательно высвобождают молекулы целлобиозы с концов полимера целлюлозы. Целлобиоза является водорастворимым бета-1,4-связанным димером глюкозы. Бета-глюкозидазы гидролизуют целлобиозу до глюкозы.

Превращение исходных целлюлозных материалов в этанол имеет преимущества легкой доступности больших количеств исходного материала, возможности желательного избегания сжигания этих материалов или наполнения почвы этими материалами и чистоты этанольного топлива. Древесина, сельскохозяйственные остатки, травянистые культуры и муниципальные твердые отходы рассматриваются в качестве сырья для получения этанола. Эти материалы состоят прежде всего из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. После превращения целлюлозы в глюкозу эта глюкоза легко ферментируется дрожжами в этанол.

В данной области была бы выгодной возможность превращения целлюлозных исходных материалов.

Опубликованная заявка на патент США с регистрационным номером 2003/113734 раскрывает выделенный белок целлюлазы, идентифицированный как EGVII, и нуклеиновые кислоты, которые кодируют EGVII.

Целью данного изобретения является обеспечение выделенных полипептидов, имеющих целлюлолитическую активность, и выделенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих эти полипептиды, для улучшения превращения целлюлозных исходных материалов.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к способам деградации или превращения целлюлозного материала, предусматривающим: обработку целлюлозного материала эффективным количеством одного или более целлюлолитических белков в присутствии эффективного количества полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, где присутствие полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, увеличивает деградацию целлюлозного материала в сравнении с отсутствием полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, и где полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность, выбран из группы, состоящей из:

(а) полипептида, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 смежных положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 смежных положениях;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 70% идентичность со зрелым полипептидом SEQ ID NO:2;

(с) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется, по меньшей мере, при условиях средней строгости с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1, (ii) геномной последовательностью ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, или (iii) комплементарной цепью (i) или (ii); и

(d) варианта, содержащего консервативную замену, делецию и/или инсерцию одной или более аминокислот зрелого полипептида SEQ ID NO:2.

Данное изобретение относится также к способам получения вещества, предусматривающим:

(А) осахаривание целлюлозного материала эффективным количеством одного или более целлюлолитических белков в присутствии эффективного количества полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, где присутствие полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, увеличивает деградацию целлюлозного материала в сравнении с отсутствием полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, и где полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность, выбран из группы, состоящей из:

(i) полипептида, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 смежных положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 смежных положениях;

(ii) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 70% идентичность со зрелым полипептидом SEQ ID NO:2;

(iii) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется, по меньшей мере, при условиях средней строгости с (a) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1, (b) геномной последовательностью ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, или (c) комплементарной цепью (a) или (b); и

(iv) варианта, содержащего консервативную замену, делецию и/или инсерцию одной или более аминокислот зрелого полипептида SEQ ID NO:2

(В) ферментирование осахаренного целлюлозного материала стадии (а) одним или несколькими ферментирующими микроорганизмами; и

(С) извлечение вещества из ферментации.

В предпочтительном аспекте, зрелый полипептид является аминокислотами 20-249 SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте кодирующей зрелый полипептид последовательностью являются полинуклеотиды 77-766 SEQ ID NO:1.

Данное изобретение относится также к композициям детергентов, содержащим такие полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность.

Краткое описание фигур

Фигура 1 показывает последовательность кДНК и расшифрованную аминокислотную последовательность полипептида GH61B Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765), имеющего целлюлолитическую усиливающую активность (SEQ ID NO:1 и 2 соответственно). Предсказанные интроны показаны курсивом. Предсказанный сигнальный пептид подчеркнут.

Фигура 2 показывает рестрикционную карту pTr3337.

Фигура 3 показывает рестрикционную карту pTr61B.

Фигура 4 показывает гидролиз PCS (P020502CS, автоклавированной при 100 МФ, 10 г/л) бульона Trichoderma reesei, экспрессирующего бета-глюкозидазу Aspergillus oryzae (CLF), с добавлением или без добавления GH61B Trichoderma reesei. Гидролиз проводили при 50^оС, рН 5,0 в течение указанных периодов времени. Загрузка Celluclast Plus была равна 2,5 или 3,125 мг на грамм PCS, и эта смесь содержала 2,5 мг CLF и 0,625 мг GH61B на грамм PCS.

Фигура 5 показывает гидролиз PCS (P020502CS, автоклавированной при 100 МФ, 10 г/л) с использованием Celluclast Plus, дополненного белком GH61B. Бульон Aspergillus oryzae, не содержащий рекомбинантного белка (Jal250), добавляли в качестве контроля. Инкубирование выполняли в течение 115 часов при 50^оС.

Определения

Целлюлолитическая усиливающая активность: Термин «целлюлолитическая усиливающая активность» определяется в данном контексте как биологическая активность, которая усиливает гидролиз целлюлозного материала белками, имеющими целлюлолитическую активность. Для целей данного изобретения целлюлолитическую усиливающую активность определяют измерением увеличения редуцирующих сахаров из гидролиза целлюлозного материала целлюлолитическим белком при следующих условиях: 5,0 мг целлюлолитического белка на г целлюлозы в PCS в течение 5-7 дней при 50^оС в присутствии и в отсутствие 0,01-2,5 мг целлюлолитической усиливающей активности на г целлюлозы в PCS в сравнении с контрольным гидролизом с равной нагрузкой общего белка без целлюлолитической усиливающей активности (5,01-7,5 мг целлюлолитического белка на г целлюлозы в PCS). В предпочтительном аспекте, в качестве источника целлюлолитической активности используют смесь Celluclast® 1,5 л (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) в присутствии 3% бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (продуцируемой рекомбинантно в Aspergillus oryzae в соответствии с WO 02/095014) или 3% бета-глюкозидазы Aspergillus fumigatus (продуцируемой рекомбинантно в Aspergillus oryzae в соответствии с примером 22 WO 02/095014) загрузки целлюлазного белка.

Полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность, имеют, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95% и даже наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100% целлюлолитической усиливающей активности полипептида зрелого полипептида SEQ ID NO:2.

Целлюлолитическая активность: Термин «целлюлолитическая активность» определяется здесь как биологическая активность, которая гидролизует целлюлозный материал. Для целей данного изобретения целлюлолитическую активность определяют измерением увеличения гидролиза целлюлозного материала целлюлолитической смесью при следующих условиях: 1-10 мг целлюлолитического белка на г целлюлозы в PCS в течение 5-7 дней при 50^оС в сравнении с контрольным гидролизом без добавления целлюлолитического белка. В предпочтительном аспекте, в качестве источника целлюлолитической активности используют смесь Celluclast® 1,5 л (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) в присутствии 3% бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (продуцируемой рекомбинантно в Aspergillus oryzae в соответствии с WO 02/095014) или 3% бета-глюкозидазы Aspergillus fumigatus (продуцируемой рекомбинантно в Aspergillus oryzae в соответствии с примером 22 WO 02/095014) загрузки целлюлазного белка.

Предобработанная кукурузная солома: Термин «PCS» или «предобработанная кукурузная солома» определяется здесь как целлюлозный материал, полученный из кукурузной соломы обработкой нагреванием и разбавленной кислотой. Для целей данного изобретения PCS получают по способу, описанному в примере 1, или его вариациям по времени, температуре и количеству кислоты.

Гликозидгидролаза Семейства 61: Термин «гликозидгидролаза Семейства 61» или «Семейства GH61» определяется здесь как полипептид, находящийся в Семействе 61 гликозидгидролаз в соответствии с Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolase based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 и Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. В настоящее время Henrissat описывает Семейство GH61 как неклассифицированное, указывая на то, что такие свойства, как механизм, каталитические нуклеофил/основание, каталитические доноры протонов и трехмерная (3-D) структура полипептидов, принадлежащих к этому семейству, являются неизвестными.

Целлюлозный материал: Целлюлозным материалом может быть любой материал, содержащий целлюлозу. Целлюлоза обычно обнаруживается, например, в стеблях, листьях, скорлупках, шелухе и стержнях початков растений или листьях, ветвях и древесине деревьев. Целлюлозным материалом могут также быть, но не ограничиваются ими, травянистый материал, отходы сельскохозяйственного производства, отходы лесоводства, муниципальные твердые отходы, бумажные отходы и отходы целлюлозно-бумажных предприятий. При этом понятно, что целлюлоза может быть в форме лигноцеллюлозы, материала клеточных стенок растений, содержащего лигнин, целлюлозы и гемицеллюлозы в смешанном матриксе.

В предпочтительном аспекте, целлюлозным материалом является кукурузная солома. В другом предпочтительном аспекте, целлюлозным материалом является рисовая солома. В другом предпочтительном аспекте, целлюлозным материалом являются отходы бумажно-целлюлозного производства, в другом предпочтительном аспекте, целлюлозным материалом являются древесные или травянистые растения. В другом предпочтительном аспекте, целлюлозным материалом является багасса (жом сахарного тростника).

Этот целлюлозный материал может быть использован в том виде, в каком он находится, или может быть подвергнут предобработке с использованием общепринятых способов, известных в этой области. Например, физические способы предобработки могут включать в себя различные типы размола, облучения, обработку паром/паровой взрыв и гидротермолиз; химические способы могут включать в себя разбавленную кислоту, щелочь, органический растворитель, аммиак, диоксид серы, диоксид углерода и рН-регулируемый гидротермолиз; и биологические способы предобработки могут включать в себя применение лигнин-солюбилизирующих микроорганизмов (см., например, Hsu, T.-A. Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor & Fransis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., and Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatment for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J.D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M.E., Baker, J. O., and Overend, R.P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, Chapter 15; Gong, C.S., Cao, N.J., Du, J., and Tsao, G.T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., and Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermеntation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; и Vallander, L., and Erirsson, K.-E. L., 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42:63-95).

Выделенный полипептид: Термин «выделенный полипептид» относится в данном контексте к полипептиду, который является, по меньшей мере, на 20% чистым, предпочтительно, по меньшей мере, на 40% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60% чистым, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% чистым, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 90% чистым и даже наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95% чистым, при определении электрофорезом в ДСН-ПААГ.

По существу чистый полипептид: Термин «по существу чистый полипептид» обозначает здесь препарат полипептида, который содержит самое большее 10 мас.%, предпочтительно самое большее 8 мас.%, более предпочтительно самое большее 6 мас.%, более предпочтительно самое большее 5 мас.%, более предпочтительно самое большее 4 мас.%, более предпочтительно самое большее 3 мас.%, даже более предпочтительно самое большее 2 мас.%, наиболее предпочтительно самое большее 1 мас.% и даже наиболее предпочтительно самое большее 0,5 мас.% другого полипептидного материала, с которым он ассоциирован в природе. Таким образом, предпочтительно по существу чистый полипептид является, по меньшей мере, на 92 мас.% чистым, предпочтительно, по меньшей мере, на 94 мас.% чистым, по меньшей мере, на 95 мас.% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 96 мас.% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 97 мас.% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 98 мас.% чистым, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 99 мас.% чистым, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 99,5 мас.% чистым и даже наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 100 мас.% чистым в расчете на общий полипептидный материал, присутствующий в этом препарате.

Полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность, находятся предпочтительно в существенно очищенной форме. В частности, предпочтительно эти полипептиды находятся в «по существу чистой форме», т.е. этот препарат полипептида по существу не содержит другого полипептидного материала, с которым он ассоциирован в нативном состоянии. Это может быть достигнуто, например, получением этого полипептида при помощи хорошо известных рекомбинантных способов или классических способов очистки.

В данном контексте, термин «по существу чистый полипептид» является синонимом терминов «выделенный полипептид» и «полипептид в выделенной форме».

Зрелый полипептид: Термин «зрелый полипептид» определяется здесь как полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность, который находится в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-концевой процессинг, С-концевое укорочение, гликозилирование, фосфорилирование и т.д.

Кодирующая зрелый полипептид последовательность: Термин «кодирующая зрелый полипептид последовательность» определяется здесь как нуклеотидная последовательность, которая кодирует зрелый полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность.

Идентичность: Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность».

Для целей данного изобретения, степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), воплощенного в программе Needle EMBOSS со штрафом за открывание гэпа 10, штрафом за удлинение гэпа 0,5 и матрицей EBLOSUM62. Результат введенной Needle «самой длинной идентичности» используют здесь в виде процентной идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные Остатки × 100)/(Длина Сопоставления - Количество Гэпов в Сопоставлении).

Для целей данного изобретения, степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), воплощенного в программе Needle EMBOSS со штрафом за открывание гэпа 10, штрафом за удлинение гэпа 0,5 и матрицей EDNAFULL. Результат введенной Needle «самой длинной идентичности» используют здесь в виде процентной идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные Остатки × 100)/(Длина Сопоставления - Количество Гэпов в Сопоставлении).

Гомологичная последовательность: Термин «гомологичная последовательность» определяется здесь как последовательности с величиной Е (оценки ожидания), меньшей чем 0,001, с использованием алгоритмов BLASTP (для баз данных белков) или TBLASTN (для баз данных нуклеиновых кислот) с матрицей BLOSUM62, размером слова 3, ценой существования гэпа 11, ценой удлинения гэпа 1, без фильтрации низкой комплексности и с последовательностью зрелого белка GH61B в качестве «запрашиваемой последовательности». См. Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

Полипептидный фрагмент: Термин «полипептидный фрагмент» определяется здесь как полипептид, имеющий одну или несколько аминокислот, делетированных из амино- и/или карбоксил-конца зрелого полипептида SEQ ID NO:2 или его гомологичной последовательности, где этот фрагмент имеет целлюлолитическую усиливающую активность. Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида SEQ ID NO:2 содержит, по меньшей мере, 200 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере, 210 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 220 аминокислотных остатков.

Субпоследовательность: Термин «субпоследовательность» определяется здесь как нуклеотидная последовательность, имеющая один или несколько нуклеотидов, делетированных из 5'- и/или 3'-конца кодирующей зрелый полипептид последовательности SEQ ID NO:1 или ее гомологичной последовательности, где эта субпоследовательность кодирует полипептидный фрагмент, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность. Предпочтительно, субпоследовательность кодирующей зрелый полипептид последовательности SEQ ID NO:1 содержит, по меньшей мере, 600 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере, 630 нуклеотидов и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 660 нуклеотидов.

Аллельный вариант: Термин «аллельный вариант» обозначает здесь любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно посредством мутации и может приводить к полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения кодируемого полипептида) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида является полипептидом, кодируемым аллельным вариантом гена.

Выделенный полинуклеотид: Термин «выделенный полинуклеотид» относится в данном контексте к полинуклеотиду, который является, по меньшей мере, на 20% чистым, предпочтительно, по меньшей мере, на 40% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60% чистым, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% чистым, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 90% чистым и еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% чистым, при определении электрофорезом на агарозе.

По существу чистый полинуклеотид: Термин «по существу чистый полинуклеотид» обозначает здесь препарат полинуклеотида, не содержащий других посторонних или нежелательных нуклеотидов, который находится в форме, подходящей для использования в системах получения белка при помощи генной инженерии. Таким образом, по существу чистый полинуклеотид содержит самое большее 10 мас.%, предпочтительно самое большее 8 мас.%, более предпочтительно самое большее 6 мас.%, более предпочтительно самое большее 5 мас.%, более предпочтительно самое большее 4 мас.%, более предпочтительно самое большее 3 мас.%, даже более предпочтительно самое большее 2 мас.%, наиболее предпочтительно самое большее 1 мас.% и даже наиболее предпочтительно самое большее 0,5 мас.% другого полинуклеотидного материала, с которым он ассоциирован в природе. Однако по существу чистый полинуклеотид может включать в себя природно-встречающиеся 5'- и 3'-нетранслируемые районы, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, по существу чистый полипептид является, по меньшей мере, на 90 мас.% чистым, предпочтительно, по меньшей мере, на 92 мас.% чистым, предпочтительно, по меньшей мере, на 94 мас.% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 96 мас.% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 97 мас.% чистым, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 98 мас.% чистым, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 99 мас.% чистым и даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 99,5 мас.% чистым. Эти полинуклеотиды предпочтительно находятся в основном в чистой форме. В частности, предпочтительно описанные здесь полинуклеотиды находятся в «по существу чистой форме», т.е. препарат полинуклеотида по существу не содержит другого полинуклеотидного материала, с которым он ассоциирован в нативном состоянии. Здесь термин «по существу чистый полинуклеотид» является синонимом терминам «выделенный полинуклеотид» и «полинуклеотид в выделенной форме». Эти полинуклеотиды могут быть геномной ДНК, кДНК, РНК, полусинтетического, синтетического происхождения или любыми их комбинациями.

кДНК: Термин «кДНК» определяется здесь как молекула ДНК, которая может быть получена обратной транскрипцией из зрелой, сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. кДНК не содержит последовательностей интронов, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, который процессируется посредством ряда стадий перед отжигом в виде зрелой сплайсированной мРНК. Эти стадии включают в себя удаление последовательностей интронов посредством процесса, названного сплайсингом. Таким образом, кДНК, полученная из мРНК, лишена любых последовательностей интронов.

Конструкция нуклеиновой кислоты: Термин «конструкция нуклеиновой кислоты» относится в этом контексте к молекуле нуклеиновой кислоты, либо одноцепочечной, либо двухцепочечной, которая выделена из природно-встречающегося гена или которая модифицирована так, что она содержит сегменты нуклеиновых кислот, таким образом, который в противном случае не мог бы существовать в природе. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термина «экспрессионная кассета», когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности.

Регуляторная последовательность: Термин «регуляторные последовательности» определяется здесь как последовательности, включающие в себя все компоненты, которые необходимы или полезны для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной или чужеродной относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей этот полипептид, или нативной или чужеродной относительно друг друга. Такие регуляторные последовательности включают в себя, но не ограничиваются ими, лидер, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Минимально, эти регуляторные последовательности включают в себя промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Эти регуляторные последовательности могут быть обеспечены линкерами с целью введения специфических сайтов рестрикции, облегчающих лигирование регуляторных последовательностей с кодирующим районом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.

Функционально связанные: Термин «функционально связанные» обозначает здесь конфигурацию, в которой регуляторная последовательность помещена в подходящем положении относительно кодирующей последовательности этой полинуклеотидной последовательности, так что эта регуляторная последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности полипептида.

Кодирующая последовательность: В данном контексте термин «кодирующая последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая непосредственно определяет аминокислотную последовательность ее белкового продукта. Границы кодирующей последовательности обычно определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается со стартового кодона ATG или альтернативных стартовых кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG и TGA. Кодирующей последовательностью может быть ДНК, кДНК или рекомбинантная нуклеотидная последовательность.

Экспрессия: Термин «экспрессия» включает в себя любую стадию, участвующую в продуцировании полипептида, в том числе, но не только, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Экспрессирующий вектор: Термин «экспрессирующий вектор» определяется здесь как линейная или кольцевая молекула ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид этого изобретения и которая функционально связана с дополнительными нуклеотидами, которые обеспечивают ее экспрессию.

Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин» в данном контексте включает в себя любой тип клеток, который является восприимчивым в отношении трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. конструкцией нуклеиновой кислоты или экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид.

Модификация: Термин «модификация» обозначает здесь любую химическую модификацию полипептида, состоящего из зрелого полипептида SEQ ID NO:2 или его гомологичной последовательности; а также генетическую манипуляцию ДНК, кодирующей такой полипептид. Этой модификацей могут быть замены, делеции и/или инсерции одной или более аминокислот, а также замены боковых цепей одной или более аминокислот.

Искусственный вариант: В данном контексте, термин «искусственный вариант» обозначает полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность, продуцируемый организмом, экспрессирующим модифицированную нуклеотидную последовательность кодирующей зрелый полипептид последовательности SEQ ID NO:1 или ее гомологичной последовательности. Эту модифицированную нуклеотидную последовательность получают вмешательством человека посредством модификации нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO:1, или ее гомологичной последовательности.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к способам деградации или превращения целлюлозного материала, предусматривающим: обработку целлюлозного материала эффективным количеством целлюлолитического белка в присутствии эффективного количества полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, где присутствие полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, увеличивает деградацию целлюлозного материала в сравнении с отсутствием полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, и где полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность, выбран из группы, состоящей из:

(а) полипептида, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 смежных положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 смежных положениях;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 70% идентичность со зрелым полипептидом SEQ ID NO:2;

(с) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется, по меньшей мере, при условиях средней строгости с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1, (ii) геномной последовательностью ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, или (iii) комплементарной цепью (i) или (ii); и

(d) варианта, содержащего консервативную замену, делецию и/или инсерцию одной или более аминокислот зрелого полипептида SEQ ID NO:2.

Данное изобретение включает в себя также извлечение деградированного или превращенного целлюлозного материала. Растворимые продукты деградации или превращения целлюлозного материала могут быть отделены от нерастворимого целлюлозного материала с использованием технологии, хорошо известной в этой области, такой как центрифугирование, фильтрование и осаждение под действием гравитации.

Данное изобретение относится также к способам получения вещества, предусматривающим:

(А) осахаривание целлюлозного материала эффективным количеством одного или более целлюлолитических белков в присутствии эффективного количества полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, где присутствие полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, увеличивает деградацию целлюлозного материала в сравнении с отсутствием полипептида, имеющего целлюлолитическую усиливающую активность, и где полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность, выбран из группы, состоящей из: (i) полипептида, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 смежных положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 смежных положениях; (ii) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 70% идентичность со зрелым полипептидом SEQ ID NO:2; (iii) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется, по меньшей мере, при условиях средней строгости с (a) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1, (b) геномной последовательностью ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, или (с) комплементарной цепью (а) или (b); и (iv) варианта, содержащего консервативную замену, делецию и/или инсерцию одной или более аминокислот зрелого полипептида SEQ ID NO:2; (В) ферментирование осахаренного целлюлозного материала стадии (а) одним или несколькими ферментирующими микроорганизмами; и (С) извлечение вещества из ферментации.

Полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность, и клетки-хозяева, описанные здесь, могут быть использованы в получении моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов в качестве химических или ферментационных исходных веществ из биомассы для получения этанола, пластиков, других продуктов или промежуточных продуктов. В частности, эти полипептиды и клетки-хозяева могут быть использованы для увеличения количества остатков обработки (сушеной барды, дробины из пивоварения, багассы сахарного тростника и т.д.) посредством частичной или полной солюбилизации целлюлозы или гемицеллюлозы. В повышении переработки целлюлолитическими белками целлюлозного материала в глюкозу, ксилозу, маннозу, галактозу и арабинозу, их полимеров или полученных из них продуктов, описанных ниже, полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность, могут быть в форме неочищенного ферментационного бульона с клетками или без клеток или в форме полуочищенного или очищенного препарата фермента. Целлюлолитический усиливающий белок может быть монокомпонентным препаратом, например белком Семейства 61, мультикомпонентным препаратом белка, например несколькими белками Семейства 61, или комбинацией мультикомпонентного и монокомпонентного препаратов белка. Целлюлолитические усиливающие белки могут повышать активность целлюлолитических белков в кислом, нейтральном или щелочном диапазоне рН. Альтернативно, клетка-хозяин может быть использована в качестве источника такого полипептида в ферментационном процессе с биомассой. Эта клетка-хозяин может также содержать нативные или гетерологичные гены, которые кодируют целлюлолитический белок, а также другие ферменты, применимые в переработке биомассы.

Биомасса может включать в себя, но не ограничивается ими, древесные ресурсы, муниципальные твердые отходы, бумажные отходы, посевы и остатки посевов (см., например, Wiselogel et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Taylor & Francis, Washington DC; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, New York).

Преобладающим полисахаридом в первичной клеточной стенке биомассы является целлюлоза, вторичным наиболее преобладающим полисахаридом является гемицеллюлоза, и третьим полисахаридом является пектин. Вторичная клеточная стенка, образуемая после остановки роста клетки, также содержит полисахариды и укреплена полимерным лигнином, ковалентно сшитым с гемицеллюлозой. Целлюлоза является гомополимером ангидроцеллобиозы и, следовательно, линейным бета-(1-4)-D-глюканом, в то время как гемицеллюлозы включают в себя разные соединения, такие как ксиланы, ксилоглюканы, арабиноглюканы и маннаны в сложных разветвленных структурах со спектром заместителей. Хотя обычно являющаяся полиморфной, целлюлоза обнаруживается в ткани растений прежде всего в виде нерастворимого кристаллического матрикса параллельных глюкановых цепей. Гемицеллюлозы обычно связаны водородными связями с целлюлозой, а также с другими гемицеллюлозами, которые способствуют стабилизации матрикса клеточной стенки.

Полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность, и их полинуклеотиды

В первом аспекте, выделенные полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность, содержат следующий мотив:

[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где x обозначает любую аминокислоту, x(4,5) обозначает любую аминокислоту в смежных положениях 4 и 5 и x(3) обозначает любую аминокислоту в 3 смежных положениях. В вышеуказанном мотиве используется общепринятое однобуквенное сокращение аминокислот IUPAC.

Во втором аспекте, выделенные полипептиды, имеющие целлюлолитическую усиливающую активность, имеют аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (т.е. зрелым полипептидом), по меньшей мере, 75%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95% и даже наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 96%, 97%, 98% или 99%, и имеют целлюлолитическую усиливающую активность (далее «гомологичные полипептиды»). В предпочтительном аспекте, эти гомологичные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, которая отличается десятью аминокислотами, предпочтительно пятью аминокислотами, наиболее предпочтительно двумя аминокислотами и даже наиболее предпочтительно одной аминокислотой от зрелого полипептида SEQ ID NO:2.

Полипептид, имеющий целлюлолитическую усиливающую активность, данного изобретения предпочтительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, который имеет целлюлолитическую усиливающую активность. В предпочтительном аспекте, полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте, полипептид включает зрелый полипептид SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте, полипептид включает