Чипы на основе антител для определения множественных трансдукторов сигналов в редких циркулирующих клетках

Чипы на основе антител для определения множественных трансдукторов сигналов в редких циркулирующих клетках

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Способ осуществления мультиплексного высокопроизводительного иммуноанализа с особо широким динамическим диапазоном, включающий:(a) инкубацию экстракта клеток с множеством серийных разведений первичных антител, иммобилизованных на твердой подложке и специфичных в отношении одного или более аналитов в экстракте клеток, с образованием множества связанных аналитов;(b) инкубацию множества связанных аналитов с вторичными антителами, специфичными в отношении соответствующих аналитов, с образованием множества детектируемых связанных аналитов; детекция включает:(1) множество не зависимых от активированности антител, меченных вспомогательным компонентом, и(2) множество зависимых от активированности антител, меченных первым членом пары усиления сигнала,причем вспомогательный компонент дает окисляющий агент, который достигает первого члена пары усиления сигнала и взаимодействует с ним;(c) инкубацию множества детектируемых связанных аналитов с вторым членом пары амплификации сигнала с образованием усиленного сигнала и(d) детекцию усиленного сигнала, созданного первым и вторым членами усиливающей сигнал пары.

2. Способ по п.1, в котором экстракт клеток включает экстракт циркулирующих клеток солидной опухоли.

3. Способ по п.2, в котором клетки выделяют из образца взятого у пациента материала путем иммуномагнитной сепарации.

4. Способ по п.3, в котором взятый у пациента образец выбирают из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, слюны, мочи, мокроты, промывной жидкости бронхиального лаважа, слезной жидкости, аспирата из соска, лимфы, тонкоигольного пунктата и их комбинаций.

5. Способ по п.3, в котором выделенные клетки выбирают из группы, состоящей из циркулирующих опухолевых клеток, раковых стволовых клеток циркулирующих эндотелиальных клеток, циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников и их комбинаций.

6. Способ по п.3, в котором выделенные клетки стимулировали in vitro факторами роста.

7. Способ по п.6, в котором выделенные клетки перед стимуляцией факторами роста инкубировали с противораковым лекарством.

8. Способ по п.7, в котором противораковое лекарство выбирают из группы, состоящей из моноклональных антител, ингибиторов тирозинкиназы, иммуносупрессивных агентов и их комбинаций.

9. Способ по п.6, в котором выделенные клетки после стимуляции факторами роста лизировали, чтобы получить экстракт клеток.

10. Способ по п.1, в котором один или более аналитов содержат множество молекул-трансдукторов сигналов.

11. Способ по п.1, в котором твердую подложку выбирают из группы, состоящей из стекла, пластика, металлических пластин, стержней, фильтров, гранул, бумаги, мембран, пучков волокон и их комбинаций.

12. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела также содержат детектируемый компонент.

13. Способ по п.12, в котором детектируемый компонент является флуорофором.

14. Способ по п.12, в котором количество детектируемого компонента коррелирует количеством одного или более аналитов.

15. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела непосредственно мечены компонентом, опосредующим передачу сигнала.

16. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела мечены компонентом, опосредующим передачу сигнала, посредством гибридизации олигонуклеотида, конъюгированного с не зависимым от активированности антителом, с комплементарным олигонуклеотидом, конъюгированным с компонентом, опосредующим передачу сигнала.

17. Способ по п.1, в котором зависимые от активированности антитела непосредственно мечены первым членом пары усиления сигнала.

18. Способ по п.1, в котором зависимые от активированности антитела мечены первым членом пары усиления сигнала посредством связывания первого члена аффинной пары, конъюгированного с зависимым от активированности антителом, с вторым членом аффинной пары, конъюгированным с первым членом пары усиления сигнала.

19. Способ по п.18, в котором первый член аффинной пары является биотином.

20. Способ по п.18, в котором второй член аффинной пары является стрептавидином.

21. Способ по п.1, в котором компонент, опосредующий передачу сигнала, является глюкозоокидазой.

22. Способ по п.21, в котором окисляющий агент является перекисью водорода (Н₂O₂).

23. Способ по п.22, в котором первый член пары усиления сигнала является пероксидазой.

24. Способ по п.23, в котором пероксидаза является пероксидазой хрена (HRP).

25. Способ по п.23, в котором второй член пары усиления сигнала является тирамидным реагентом.

26. Способ по п.25, в котором тирамидный реагент представляет собой биотин-тирамид.

27. Способ по п.26, в котором усиленный сигнал создается пероксидазным окислением биотин-тирамида с образованием активированного тирамида.

28. Способ по п.27, в котором активированный тирамид определяется непосредственно.

29. Способ по п.27, в котором активированный тирамид определяется после добавления реагента, детектирующего сигнал.

30. Способ по п.29, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является флуорофор, меченный стрептавидином.

31. Способ по п.29, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является комбинация пероксидазы, меченной стрептавидином, и хромогенного реагента.

32. Способ по п.31, в котором хромогенным реагентом является 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (ТМВ).