Вакцина против вируса синего языка и иммуногенные композиции, способы их применения и способы их получения

Вакцина против вируса синего языка и иммуногенные композиции, способы их применения и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к вакцине или иммуногенной композиции для иммунизации жвачных животных против патогенных штаммов или серотипов вируса синего языка (BTV) и к способу изготовления вакцины и иммунизации жвачных животных этими композициями.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Болезнь синего языка, артропонозное вирусное заболевание, встречается у крупного рогатого скота, овец, коз и диких жвачных животных. Поражения болезнью синего языка у больных животных напоминают инфекционную бычью вирусную диарею, вирус везикулярного стоматита, злокачественную катаральную лихорадку, микотический стоматит, чуму крупного рогатого скота, фотосенсибилизацию и ящур (foot and mouth disease). Вирус синего языка (BTV) считают причиной гидроанэнцефалии у крупного рогатого скота и бесплодия, прерывания беременности и рождения неполноценного потомства у крупного рогатого скота и овец. В литературе описаны двадцать четыре серотипа, вызывающие проблемы, варьирующиеся от бессимптомной инфекции до острой прогрессирующей инфекции. Также был обнаружен хронический, персистентный вирус, выделенный из крупного рогатого скота. При наличии BTV наблюдается выраженная потеря кондиций тела и продажа убойных животных может быть отложена. У BTV-инфицированных овец рост шерсти может быть нарушен в результате развития проплешин, которые приводят к продукции дефектного или малопроизводительного руна. Выраженная слабость после BTV-инфекций может приводить к снижению устойчивости к вторичным бактериальным или хламидийным инфекциям и другим опасным факторам. Отрицательное влияние наблюдается также на репродуктивную эффективность инфицированных животных.

У инфицированных животных наблюдаются прерывания беременности и дефектное потомство, и некоторые животные могут быть бесплодными в течение одного или более сезонов размножения. Наиболее значительный вред, наносимый инфекциями синего языка, представляет собой экономические потери, происходящие в результате эмбарго и жестких требований тестирования, налагаемых на производителей, которые экспортируют крупный рогатый скот, семенную жидкость крупного рогатого скота и овец из эндемичных областей болезни синего языка.

В природных условиях передача вируса осуществляется через укусы по меньшей мере четырех видов Culicoides, например москитов, комаров. Биологическая передача BTV между крупным рогатым скотом и овцами посредством такого же куликоидного вектора (насекомых) была продемонстрирована экспериментально (Luedke et al., 28 AJVR 457 (1967)). Крупный рогатый скот, овцы и многие виды диких жвачных животных могут служить в качестве резервуаров BTV, обеспечивая способность вируса перезимовывать. У крупного рогатого скота была обнаружена персистентная виремия BTV, которая может длиться вплоть до трех лет (Hourrigan, 51 Aust Vet J, 170:(1975)). Как только BTV проникает в страну, вирус практически невозможно уничтожить (Erasmus, 51 Aust Vet J 209). Этиологический агент болезни синего языка принадлежит к семейству Reoviridae, род Orbivirus.

Вирусная этиология болезни синего языка была установлена Theiler в 1906 г. (Erasmus, 51 Aust Vet J 165 (1975)). С тех пор в литературе появилось несколько сообщений, которые (а) подтверждают выделение вируса синего языка из крупного рогатого скота, овец, коз и многих диких жвачных животных и (б) клинические и патологические признаки болезней синего языка, и (в) описывают инфекции, являющиеся результатом различных серотипов BTV. Например, см. Onderstepoort (J Vet Sci Anim Indus 7 (1944); Komarov and Goldsmit, Refuah Vet 96 (1951); Price and Hardy, 124 J Am Med Assn 255 (1954); Shopeetal, 111 J Exp Med 155 (1960); Livingston and Hardy, 25 AJVR 1958 (1964); Luedke et al 30 AJVR 511 (1969); Hourrigan et al, 51 Aust Vet J 170 (1975). Попытки иммунологического контроля болезни синего языка в США впервые были предприняты McKercher и др. 118 AJVR 310 (1975) с помощью вакцины против международного серотипа 10 BTV, выращенной в оплодотворенных куриных яйцах. Этот продукт поставили на поток после того, как Alexander (J V et Sci Indus 231 (1947)) впервые добился успеха в размножении вируса синего языка в куриных эмбрионах.

Ранние протоколы вакцинации рутинно осуществляли в Южной Африке и Израиле с использованием вакцины против аттенуированного в яйце поливалентного живого вируса, содержащей несколько штаммов вируса синего языка. Адаптированная к яйцам вакцина, производимая Cutter Laboratories и используемая в США, была изъята из рынка из-за острых реакций у вакцинированных овец. Впоследствии Kemeny и Drehle, 22 AJVR 921 (1961), адаптировали международный тип 10 BTV из яиц к культурам клеток почки быка. Эту модифицированную живую вирусную вакцину, производимую Colorado Serum Company, используют для овец в США.

Существует потребность в улучшениях в разработке вакцин для применения в иммунизации жвачных животных, в частности овец и ягнят, против вируса синего языка. Настоящее изобретение направлено на эту потребность. Цитирование любой ссылки в данной заявке не следует рассматривать как допущение того, что такая ссылка является доступной в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что вирусы синего языка могут быть дважды инактивированы с использованием способов, описанных в данной заявке, и эти дважды инактивированные вирусы могут быть использованы в получении вакцинных и иммуногенных композиций для иммунизации жвачных животных против различных штаммов и патогенных серотипов BTV. Более того, было установлено, что конкретные комбинации адъювантов и эксципиентов являются эффективными для применения в композициях по изобретению для индукции эффективного иммунного ответа у жвачных животных, которым вводят данные композиции.

Соответственно, в одном из аспектов изобретения предложена композиция для индукции иммунного ответа против вируса синего языка (BTV) у животного, содержащая иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного штамма дважды инактивированного вируса синего языка и биологически приемлемый адъювант.

В одном из воплощений дважды инактивированный BTV, используемый в указанных композициях, инактивируют первый раз инактивирующим агентом в концентрации примерно 10 мМ и инактивируют второй раз инактивирующим агентом в концентрации примерно 5 мМ.

В одном из воплощений инактивирующий агент, используемый для обработки BTV для применения в указанных композициях, представляет собой бинарный этиленимин (BEI).

В одном из воплощений композиция содержит штамм BTV, который представляет собой серотип 4.

В одном из воплощений композиция представляет собой вакцинную композицию или иммуногенную композицию.

В одном из воплощений животное, подлежащее обработке указанной композицией, является жвачным животным, выбранным из группы, состоящей из овец, ягнят, коз, крупного рогатого скота и оленей.

В одном из воплощений животное, подлежащее обработке указанной композицией, представляет собой овцу или ягненка.

В одном из воплощений биологически приемлемый адъювант, используемый с указанной композицией, выбран из группы, состоящей из одного или более чем одного гидрата окиси алюминия, сапонина, SL-CD, карбопола и SP-масла.

В одном из воплощений биологически приемлемый адъювант, используемый с указанной композицией, содержит смесь гидрата окиси алюминия и сапонина. В одном из воплощений гидрат окиси алюминия присутствует в концентрации от примерно 1% до примерно 10%. В одном из воплощений гидрат окиси алюминия присутствует в концентрации от примерно 2% до примерно 5%. В одном из воплощений гидрат окиси алюминия присутствует в концентрации в примерно 3%.

В одном из воплощений иммунный ответ, индуцированный композициями по изобретению, защищает животное против инфекции или уменьшает тяжесть по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией патогенным штаммом вируса синего языка.

Во втором аспекте изобретения предложен способ усиления иммунного ответа у животного на вирус синего языка, или предупреждения или уменьшения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с указанным заболеванием, включающий стадию введения одной или нескольких доз композиции по изобретению, как описано выше.

В одном из воплощений способы усиления иммунного ответа у животного на вирус синего языка, или предупреждения или уменьшения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с указанным заболеванием, являются полезными для достижения такого эффекта у жвачного животного, выбранного из группы, состоящей из овец, ягнят, коз, крупного рогатого скота и оленей. В одном из воплощений жвачное животное представляет собой овцу или ягненка.

В одном из воплощений способы усиления иммунного ответа у животного на вирус синего языка, или предупреждения или уменьшения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с указанным заболеванием, предложены для стадии введения композиций - посредством парентерального введения. Стадия парентерального введения может быть осуществлена посредством внутримышечной инъекции.

В одном из воплощений способы усиления иммунного ответа у животного на вирус синего языка, или предупреждения или уменьшения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с указанным заболеванием, предложены для стадии введения композиций посредством перорального введения, которая может быть осуществлена посредством ручной доставки или массового применения.

В третьем аспекте изобретения предложен способ предупреждения или облегчения вспышки вируса синего языка, который включает стадию введения животному композиции по изобретению.

В одном из воплощений предложен способ предупреждения или облегчения вспышки вируса синего языка для лечения животного, которое представляет собой жвачное животное, выбранное из группы, состоящей из овец, ягнят, коз, крупного рогатого скота и оленей. В одном из воплощений жвачное животное представляет собой овцу или ягненка.

В одном из воплощений предложен способ предупреждения или облегчения вспышки вируса синего языка для стадии введения композиций по изобретению посредством парентерального введения. Стадия парентерального введения может быть осуществлена посредством внутримышечной инъекции.

В одном из воплощений предложен способ предупреждения или облегчения вспышки вируса синего языка для стадии введения композиций по изобретению посредством перорального введения. Стадия перорального введения может быть осуществлена посредством ручной доставки или массового применения.

В четвертом аспекте изобретения предложен способ получения инактивированного цельного вируса синего языка (BTV), включающий стадии:

а) обработки BTV инактивирующим агентом с использованием соотношения инактивирующего агента к BTV 1:10;

б) гомогенизации смеси инактивирующий агент / BTV со стадии (а) в течение по меньшей мере 15 минут;

в) декантации смеси со стадии (б) в стерильный контейнер и перемешивания смеси в течение примерно 24 часов;

г) обработки BTV второй раз инактивирующим агентом с использованием соотношения инактивирующего агента к BTV 1:20;

д) гомогенизации смеси инактивирующий агент / BTV со стадии (г) в течение по меньшей мере 15 минут;

е) декантации смеси со стадии (д) в стерильный контейнер и перемешивания смеси в течение примерно 24 часов; и

ж) нейтрализации инактивирующего агента для корректировки конечного рН до примерно 7,2;

где способ приводит к инактивации BTV при сохранении иммуногенности BTV.

В одном из воплощений предложен способ получения дважды инактивированного BTV, как описано выше, для использования бинарного этиленимина (BEI) в качестве инактивирующего агента. В одном из воплощений конечная концентрация инактивирующего агента на стадии а), как указано выше, составляет примерно 10 мМ. В одном из воплощений конечная концентрация инактивирующего агента на стадии г), как указано выше, составляет примерно 5 мМ.

В одном из воплощений в способе, описанном выше для получения дважды инактивированного цельного BTV, используют вирус синего языка, который представляет собой серотип 4.

В пятом аспекте изобретения предложено применение по меньшей мере одного дважды инактивированного штамма BTV для получения лекарственного средства для иммунизации жвачных животных против различных штаммов и серотипов BTV. В одном из воплощений по меньшей мере один дважды инактивированный штамм BTV для применения в получении лекарственного средства представляет собой серотип 4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем способы по настоящему изобретению и методология лечения будут описаны, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данной заявке, используется только в целях описания конкретных воплощений и не предназначена быть ограничивающей.

Как использовано в этом описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают в себя множественные ссылки, если контекст явно не указывает на обратное. Таким образом, например, ссылка на "способ" включает в себя один(одну) или более способов и/или стадий типа, описанного в данной заявке, и/или которые станут очевидными специалистам в данной области после прочтения этого описания и т.д.

Соответственно, в настоящей заявке могут быть использованы традиционная молекулярная биология, микробиология и методы рекомбинантной ДНК в пределах знаний специалиста в данной области. Такие методы полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring-Harbor, New York (в данной заявке "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1985)); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I.Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); P.M.Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данной заявке, могут быть использованы для практического осуществления или тестирования изобретения, теперь будут описаны предпочтительные способы и материалы. Все упомянутые в данной заявке публикации включены посредством ссылки во всей своей полноте.

Определения

Термины, используемые в данной заявке, имеют значения, распознаваемые и известные специалистам в данной области, однако для удобства и полноты конкретные термины и их значения приведены ниже.

Термин "примерно" или "приблизительно" означает "статистически значимый диапазон значения". Такой диапазон может находиться в пределах порядка величины, типично в пределах 50%, более типично в пределах 20%, более типично в пределах 10% и еще более типично в пределах 5% данного значения или диапазона. Допустимая вариация, охваченная термином "примерно" или "приблизительно", зависит от конкретной исследуемой системы и может быть легко оценена средним специалистом в данной области.

"Адъювант" означает композицию, состоящую из одного или более веществ, которые усиливают иммуногенность антигена в композиции, типично вакцинной композиции. Адъювант может служить в качестве тканевого депо, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, который не специфически усиливает иммунный ответ (Hood, et al., Immunology, Second Ed., Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. p.384). Часто первичная вакцинация одним антигеном, в отсутствие адъюванта, не будет способна вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Адъюванты включают в себя, но не ограничиваются этим, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидрат окиси алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы pluronic, полианионы, пептиды, масло или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки и потенциально полезные человеческие адъюванты, такие как N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин, BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно адъювант является биологически приемлемым. В одном из воплощений изобретения композицию вводят в комбинации с двумя адъювантами, гидратом окиси алюминия и сапонином.

Адъюванты, используемые в композициях, описанных в данной заявке, типично представляют собой "биологически приемлемые адъюванты" и, таким образом, могут быть использованы в комбинации с инактивированным BTV, так что полученные композиции могут быть введены in vivo без сопутствующей токсичности для животного. В данной заявке проиллюстрированы композиции, включающие дважды инактивированный BTV в комбинации с одним или более биологически приемлемыми адъювантами, выбранными из группы, состоящей из гидрата окиси алюминия, сапонина, SP-масла, SL-CD или карбопола. В некоторых воплощениях используют два адъюванта для индукции предпочтительного иммунного ответа на BTV. В других воплощениях для применения может рассматриваться смесь метаболизируемого масла, такого как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквалена или сквалана, и полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера, такого как Pluronic®.

Инактивированный штамм BTV или молекула, полученная из него, является "антигенной", когда она способна специфически взаимодействовать с молекулой распознавания антигена из иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или Т-клеточный антигенный рецептор. Типично, антигенная молекула представляет собой полипептид или его вариант, который содержит "эпитоп" из по меньшей мере примерно пяти и типично по меньшей мере примерно 10 аминокислот. Антигенный участок полипептида, также называемый в данной заявке "этитопом", может представлять собой такой участок, который является иммунодоминантным для распознавания антителом или Т-клеточным рецептором, или он может представлять собой участок, используемый для генерации антитела на молекулу путем конъюгирования антигенного участка с полипептидом-носителем для иммунизации. Молекула, которая является антигенной, сама по себе не обязательно является иммуногенной, т.е. способной индуцировать иммунный ответ без носителя.

Отмечено, что в этом описании термины, такие как "включает", "включал", "включающий", "содержит", "содержащий" и тому подобное, могут иметь значение, присвоенное им в патентном законодательстве США; т.е. они могут означать "включает в себя", "включают в себя", "включающий" и тому подобное. Такие термины, как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из" имеют значение, присвоенное им в патентном законодательстве США, т.е. они подразумевают включение дополнительных ингредиентов или стадий, которые не умаляют новых или основных характеристик изобретения, т.е. они исключают дополнительные неперечисленные ингредиенты или стадии, которые умаляют новые или основные характеристики изобретения, и они исключают ингредиенты или стадии из предшествующего уровня техники, такие как документы в данной области техники, которые процитированы в данной заявке или включены в данную заявку посредством ссылки, особенно если целью этого документа является определение воплощений, которые являются патентуемыми, т.е. новыми, неочевидными, имеющими изобретательский уровень относительно предшествующего уровня техники, т.е. относительно документов, процитированных в данной заявке или включенных в нее посредством ссылки. И термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значение, присвоенное им в патентном законодательстве США; а именно эти термины являются ограничивающими.

"Иммунный ответ" на вакцину или иммуногенную композицию представляет собой развитие у субъекта гуморального и/или клеточно-опосредованного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в рассматриваемом антигене или вакцинной композиции. Для целей настоящего изобретения "гуморальный иммунный ответ" представляет собой антитело-опосредованный иммунный ответ и включает в себя генерацию антител с аффинностью к антигену/вакцине по изобретению, в то время как "клеточно-опосредованный иммунный ответ" представляет собой иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами. "Клеточно-опосредованный иммунный ответ" вызывается презентацией антигенных этитопов в ассоциации с молекулами класса I или класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). Это активирует антиген-специфические CD4+Т-хелперные клетки или CD8+цитотоксические Т-лимфоцитарные клетки ("CTLs"). CTLs имеют специфичность в отношении пептидных антигенов, которые представлены в ассоциации с белками, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости (МНС) и экспрессируемыми на поверхности клеток. CTLs помогают индуцировать и стимулировать внутриклеточную деструкцию внутриклеточных микробов или лизис клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета вовлекает антиген-специфический ответ хелперными Т-клетками. Хелперные Т-клетки действуют с целью стимуляции функции и фокусирования активности неспецифических эффекторных клеток против клеток, представляющих пептидные антигены в ассоциации с молекулами МНС на их поверхности. "Клеточно-опосредованный иммунный ответ" также относится к продукции цитокинов, хемокинов и других таких молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими лейкоцитами, включая молекулы, происходящие из CD4+и CD8+Т-клеток. Способность конкретного антигена или композиции стимулировать клеточно-опосредованный иммунный ответ может быть определена многочисленными анализами, такими как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), CTL цитотоксические клеточные анализы, посредством анализа Т-лимфоцитов, специфических в отношении антигена у сенсибилизированного субъекта или посредством измерения продукции цитокинов Т-клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Такие анализы хорошо известны в данной области техники. См., например, Erickson et al., J.Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. ImMunol. (1994) 24:2369-2376.

"Иммуногенно эффективное количество" представляет собой количество цельного инактивированного BTV, которое будет вызывать иммунный ответ у животного. Это количество будет зависеть от вида, породы, возраста, размера, состояния здоровья животного-реципиента, и на это количество будет влиять предыдущая экспозиция животного с одним или более чем одним штаммом BTV независимо оттого, является ли этот один или более чем один штамм вирулентным или невирулентным штаммом. Как использовано в данной заявке, "иммуногенно эффективное количество" цельного инактивированного BTV, при применении в комбинации с одним или более подходящими адъювантами, представляет собой такое количество BTV, которое является достаточным для усиления иммуногенности BTV и таким образом обеспечивает защитный иммунитет против заражения патогенным или вирулентным штаммом или серотипом BTV.

Термин "иммуногенный" относится к способности антигена или вакцины вызывать иммунный ответ, либо гуморальный, либо клеточно-опосредованный, либо и тот и другой. Как использовано в данной заявке, термин "иммуногенный" означает, что BTV способен вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Иммуногенный штамм является также антигенным. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при введении животному.

Термин "иммуногенная композиция" относится к любой фармацевтической композиции, содержащей антиген, например микроорганизм, эта композиция может быть использована для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Иммунный ответ может включать в себя Т-клеточный ответ, В-клеточный ответ или и Т-клеточный, и В-клеточный ответ. Композиция может служить для сенсибилизации млекопитающего путем презентации антигена в ассоциации с молекулами МНС на клеточной поверхности. Кроме того, могут быть генерированы антиген-специфические Т-лимфоциты или антитела для обеспечения будущей защиты иммунизированного хозяина. "Иммуногенная композиция" может содержать живую, ослабленную или убитую/инактивированную вакцину, содержащую целый микроорганизм или иммуногенный участок, происходящий из него, который индуцирует либо клеточно-опосредованный (Т-клеточный) иммунный ответ, либо антитело-опосредованный (В-клеточный) иммунный ответ, или и тот и другой, и может защищать животное от одного или более симптомов, ассоциированных с инфекцией микроорганизмом, или может защищать животное от гибели вследствие инфекции микроорганизмом.

Термин "инактивированный" относится к неинфекционной природе микроорганизмов, используемых в вакцине или иммуногенной композиции по изобретению. В частности, специалистам в данной области известны такие вещества, которые могут быть использованы для приведения микроорганизма в неинфекционную форму для вакцинных целей, например BEI. В настоящем изобретении также были разработаны конкретные способы приведения вируса синего языка в неинфекционную форму, но эти способы также были разработаны с особым акцентом на сохранении иммуногенности вакцинного препарата, в то же время приводящем к полной инактивации вирусного препарата.

Как использовано в данной заявке, термин "выделенный" означает, что упомянутое вещество удаляют из его нативного окружения. Таким образом, выделенный биологический материал может быть свободным от некоторых или всех клеточных компонентов, т.е. компонентов клеток, в которых нативное вещество встречается в природе (например, цитоплазмический или мембранный компонент). Вещество выделяют, если оно присутствует в клеточном экстракте или супернатанте. Выделенный белок может быть ассоциирован с другими белками или нуклеиновыми кислотами, или и с теми и другими, с которыми он ассоциирован в клетке, или с клеточными мембранами, если он представляет собой мембранно-ассоциированный белок. Выделенную органеллу, клетку или ткань удаляют из анатомического участка, в котором она обнаруживается в организме. Выделенное вещество может быть, но не обязательно, очищено.

Термин "парентеральное введение", как использовано в данной заявке, означает введение каким-либо другим способом, нежели через желудочно-кишечный тракт, конкретно, введение веществ в организм посредством внутривенной, подкожной, внутримышечной или интрамедуллярной инъекции, а также посредством других непероральных и неинтраназальных путей введения, таких как внутрибрюшная инъекция или местное нанесение.

Термин "патогенный" относится к способности любого агента инфекции, такого как бактерия или вирус, вызывать заболевание. В контексте настоящего изобретения термин "патогенный" относится к способности вируса синего языка (BTV) вызывать заболевание у жвачных животных, конкретно у овец или ягнят. "Непатогенный" микроорганизм относится к микроорганизму, который не обладает характеристиками, указанными выше для "патогенных" штаммов BTV. Заболевание, вызванное BTV, часто характеризуется поражениями у инфицированных животных, которые напоминают инфекционную бычью вирусную диарею, вирус везикулярного стоматита, злокачественную катаральную лихорадку, микотический стоматит, чуму крупного рогатого скота, фотосенсибилизацию и ящур. Вирус синего языка (BTV) был назван причиной гидроанэнцефалии у крупного рогатого скота и бесплодия, прерывания беременности и рождения дефектного потомства у крупного рогатого скота и овец.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель, одобренный регулирующим органом федерального правительства, правительства штата или другим регулирующим органом, или перечисленный в фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее, для применения на животных, включая людей, а также на млекопитающих, не являющихся человеком. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, вместе с которым вводят фармацевтическую композицию. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая носители на основе вазелина, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как кокосовое масло, масло соевых бобов, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, при необходимости, также может содержать минорные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или рН-буферные агенты. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов замедленного высвобождения и тому подобного. Композиция может быть изготовлена в виде суппозитория с традиционными связующими агентами, такими как триглицериды. Пероральный препарат может включать в себя стандартные носители, такие как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния фармацевтической чистоты и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W.Martin. Фармацевтический препарат должен соответствовать способу введения.

Термин "осуществление защиты" относится к защите, например, млекопитающего, в частности жвачного животного, например овцы, ягненка, козы или коровы, от инфекции или заболевания путем индуцирования иммунного ответа на конкретный патоген, например вирус синего языка. Такая защита обычно достигается после обработки млекопитающего вакцинными композициями, описанными в данной заявке.

Термин "очищенный", как использовано в данной заявке, относится к веществу, которое было выделено в условиях, которые уменьшают или устраняют присутствие неродственных веществ, т.е. загрязнителей, включая нативные вещества, из которых получают данное вещество. Например, очищенные бактерии или белок типично по существу свободны от клетки-хозяина или культуральных компонентов, включая тканевую культуру или яичные белки, неспецифические патогены и тому подобное. Как использовано в данной заявке, термин "по существу свободный" используют оперативно, в контексте аналитического тестирования вещества. Типично, очищенное вещество, по существу свободное от загрязнителей, является по меньшей мере на 50% чистым; более типично, по меньшей мере на 90% чистым, и более типично, по меньшей мере на 99% чистым. Чистоту можно оценить посредством хроматографии, электрофореза в геле, иммуноанализа, композиционного анализа, биологического анализа и других способов, известных в данной области техники. Способы очистки хорошо известны в данной области техники. Термин "по существу чистый" означает высшую степень чистоты, которая может быть достигнута с использованием традиционных методов очистки, известных в данной области техники.

"Сапонины" описаны в: Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol.2 pp.363-386). Сапонины представляют собой стероидные или тритерпеновые гликозиды, широко распространенные в растительном и животном царствах. Сапонины известны образованием коллоидных растворов в воде, которые пенятся при встряхивании, и осаждением холестерина. Когда сапонины находятся рядом с клеточными мембранами, тогда они создают пороподобные структуры в мембране, которые вызывают разрыв мембраны. Гемолизис эритроцитов является примером этого феномена, который является свойством некоторых, но не всех, сапонинов. Сапонины известны в качестве адъювантов в вакцинах для системного введения. Адъювантная и гемолитичекая активность отдельных сапонинов широко изучалась в данной области техники (Lacaille-Dubois and Wagner, выше). Например, "Quil А" (полученный из коры южноамериканского дерева Quillaja Saponaria Molina) и его фракции описаны в патенте США №5057540 и "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, С.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2):1-55, и ЕР 0362279 В1. Дисперсные структуры, названные иммунностимулирующими комплексами (ISCOMS), содержащие фракции Quil А, являются гемолитическими и были использованы в изготовлении вакцин (Morein, В., ЕР 0109942 В1). По сообщениям, эти структуры обладают адъювантной активностью (ЕР 0109942 В1; WO 96/11711). Гемолитические сапонины QS21 и QS17 (очищенные посредством HPLC фракции Quil А) были описаны в качестве сильнодействующих системных адъювантов, и способ их получения раскрыт в патенте США №5057540 и ЕР 0362279 В1. Также в этих ссылках описано применение QS7 (негемолитическая фракция Quil А), который действует в качестве сильнодействующего адъюванта для системных вакцин. Применение QS21 также описано у Kensil и др. (1991, J. Immunology vol.146, 431-437). Также известны комбинации QS21 и полисорбата или циклодекстрина (WO 99/10008). Дисперсные адъювантные системы, содержащие фракции Quil А, такие как QS21 и QS7, описаны в WO 96/33739 и WO 96/11711. Другие сапонины, которые были использованы в исследованиях системной вакцинации, включают в себя сапонины, полученные из других видов растений, таких как Gypsophila и Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992). Также известно, что сапонины использовали в исследовании наносимых на слизистую оболочку вакцин, которые с переменным успехом приводили к индукции иммунных ответов. Как было показано ранее, сапонин Quil А не оказывает влияния на индукцию иммунного ответа в том случае, когда антиген вводят интраназально (Gizurarson et al. 1994 Vaccine Research 3, 23-29), в то время как другие авторы успешно использовали этот адъювант (Maharaj et al., Can. J.Microbiol, 1986, 32(5):414-20. Chavali и Campbell, Immunobiology, 174(3):347-59). ISCOMs, содержащие сапонин Quil А, были использованы во внутрижелудочных и интраназальных вакцинных препаратах и продемонстрировали адъювантную активность (Mcl Mowat et al, 1991, Immunology, 72, 317-322; Mcl Mowat and Donachie, Immunology Today, 12, 383-385). QS21, нетоксичная фракция Quil А, также была описана в качестве перорального и интраназального адъюванта (Sumino et al., J.Virol., 1998, 72(6):4931-9, WO 98/56415). Было описано применение других сапонинов в исследованиях интраназальной вакцинации. Например, сапонины Chenopodium quinoa были использованы как в интраназальной, так и во внутрижелудочной вакцинах (Estrada et al., Comp. Immunol. Microbiol. Infect, Dis., 1998, 21(3):225-36).

Термин"SL-CD" относится к сульфолипо-циклодекстрину, который подпадает под семейство циклодекстриновых адъювантов, описанных в патентах США №№6610310 и 6165995. Типично, SL-CD готовят в виде препаратов в смеси с метаболизируемым маслом, таким как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквалан, и предпочтительно с неионным поверхностно-активным веществом, таким как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.

Термин "SP-масло" относится к адъюванту, который представляет собой масляную эмульсию, содержащую: от 1% до 3% об./об. полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блоксополимера; от 2% до 6% об./об. сквалана; от 0,1% до 0,5% об./об. полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата; и забуференный солевой раствор.

Термин "жвачное животное" относится к любой разновидности копытных, парнокопытных и обычно рогатых млекопитающих, которые характеристически имеют желудки, разделенные на четыре отдела, включая коров, овец, жирафов, коз и оленей.

Как использовано в данной заявке, "лечение" (включая его вариации, например "лечить" или "леченный") относится к любому одному или более из следующего: (1) предупреждение инфекции или повторной инфекции, как в традиционной вакцине, (2) уменьшение тяжести или устранение симптомов, и (3) существенное или полное устранение рассматриваемого патогена или расстройства. Отсюда, лечение может быть осуществлено профилактически (до инфицирования) или терапевтически (после инфицирования). В настоящем изобретении профилактическое лечение является предпочтительным способом. Согласно конкретному воплощению настоящего изобретения предложены композиции и способы, которые лечат, включая профилактически, и/или терапевтически иммунизируют животное-хозяина от вирусной инфекции. Способы по настоящему изобретению являются полезными для придания млекопитающему, предпочтительно жвачн