Иммуногенные композиции, способы получения таких композиций и плазмида, включенная в такие композиции

Иммуногенные композиции, способы получения таких композиций и плазмида, включенная в такие композиции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Все процитированные здесь документы включены полностью с помощью ссылки.

Область техники

Изобретение относится к области экспрессии белка, в особенности к области экспрессии поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) для применения в получении вакцин.

Уровень техники

Вакцины против гепатита В доступны уже в течение многих лет (например, смотри главу 16 ссылки 1), и их активным ингредиентом является поверхностный антиген (HBsAg) вируса гепатита В (HBV). В исходных HBV вакцинах применяли HBsAg, который очищали из человеческой крови, тогда как вакцины на основе рекомбинантно экспрессирующегося HBsAg стали широко доступны в 1990 годы. С тех пор HBsAg также вводят в качестве компонента в мультивалентные вакцины, т.е. вакцины, содержащие смесь иммуногенов из более чем одного патогена, так что введение вакцины может одновременно иммунизировать пациента против более чем одного патогена. Эти мультивалентные вакцины обычно включают HBsAg плюс, по меньшей мере, 'DTP' (дифтерия, столбняк, коклюш) антигены.

Исходная одновалентная рекомбинантная вакцина против HBV ENGERIX B™ включает адъювант на основе гидроксида алюминия. Совсем недавно стали доступны одновалентные вакцины против HBV на основе более современных адъювантов, например, 'AS04' адъювант [2] применяют в продукте FENDRIX™ фирмы GSK, RC-529 адъювант в продукте SUPERVAX™ фирмы Berna Biotech, или CpG олигонуклеотидные адъюванты, такие как CPG7909 [3] фирмы Coley Pharmaceuticals.

Для рекомбинантной экспрессии HBsAg описано большое разнообразие систем. Хозяева, используемые для экспрессии, включают бактерии, дрожжи (включая виды Saccharomyces, Hanensula и Pichia), культуру клеток млекопитающих (включая клетки CHO, клетки COS, клетки Bu3), клетки насекомых (используя бакуловирусные векторы) и растительные клетки (например, 'съедобные вакцины').

Целью изобретения является представить дополнительные и улучшенные системы для рекомбинантной экспрессии HBsAg, особенно для получения HBsAg, который применяют в комбинированных вакцинах (тех, которые содержат DTP-антигены) или в новых одновалентных HBV вакцинах.

Описание изобретения

Ранние сообщения о рекомбинантной экспрессии HBsAg фокусировались на E.coli [4-6], мышиных клетках [7], клетках человека [8], клетках обезьяны [9] и на дрожжах [10-12]. Однако совсем недавно привлекла к себе повышенное внимание экспрессия в рекомбинантных растениях [13-24], а также экспрессия в дрожжах Pichia pastoris [25, 26] и в Hanensula polymorpha [27, 28].

Несмотря на развитие этих современных экспрессирующих систем, HBsAg согласно изобретению экспрессируется в хозяине Saccharomyces cerevisiae. При экспрессии HBsAg на основе дрожжей доступны разнообразные варианты выбора, включая выбор вида и штамма дрожжей, условий культивирования, промотора, применяемого для контроля экспрессии, последовательностей терминации гена, применяемых кодонов и т.д. Согласно изобретению HBsAg экспрессируется в хозяине Saccharomyces cerevisiae, несущем плазмиду, имеющую последовательность, кодирующую HBsAg, где плазмида включает: (1) расположенный выше промотор из гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы для контроля экспрессии последовательности, кодирующей HBsAg; и (2) расположенный ниже последовательности, кодирующей HbsAg, терминатор транскрипции ARG3. Плазмиды могут также включать: (3) маркер селекции LEU2; (4) последовательность плазмиды 2μ; и (5) последовательность начала репликации функциональную в Escherichia coli.

HBsAg может экспрессироваться в этом хозяине Saccharomyces cerevisiae и может быть очищен для применения в производстве вакцин и, в особенности, в производстве комбинированных вакцин и в новых одновалентных HBV вакцинах. Этот экспрессирующийся в дрожжах материал является подходящим для применения в комплексных вакцинах, несмотря на сообщения в ссылке 29 о том, что экспрессирующийся в S.cerevisiae HBsAg может иметь иммуноподавляющий потенциал.

Мультивалентные вакцины

Таким образом, в изобретении представлен способ получения мультивалентной иммуногенной композиции, включающий стадии: (а) получение HBV компонента путем очистки HBsAg после экспрессии в хозяине по изобретению S.cerevisiae; (b) получение, по меньшей мере, одного отличного от HBV компонента; и (с) смешивание HBV и отличного от HBV компонентов для получения мультивалентной композиции.

В изобретении также представлена мультивалентная иммуногенная композиция, включающая (а) HBV компонент, включающий HBsAg, экспрессирующийся в хозяине по изобретению S.cerevisiae; и (b) по меньшей мере, один отличный от HBV компонент. Композиция также обычно включает один или несколько адъювантов.

Эти мультивалентные композиции в особенности пригодны для одновременной защиты детей от инфекции HBV и отличных от HBV патогенов. Типичным пациентом является ребенок первого года жизни, который получит первую дозу композиции в возрасте 6-9 недель. Две или три следующие дозы обычно будут вводить с интервалами примерно 6-8 недель. Композицию можно также применять для завершения графика первичной иммунизации другой вакциной. Композицию можно также применять для ревакцинации, например, детей в возрасте 1-16 лет.

Одновалентные вакцины

В изобретении также представлен способ получения одновалентной иммуногенной композиции, включающий стадии: (а) получение HBV компонента путем очистки HBsAg после экспрессии в хозяине по изобретению S.cerevisiae; (b) объединение HBsAg с адъювантом для получения иммуногенной композиции. Адъювантом предпочтительно является адъювант, отличный от гидроксида алюминия, и более предпочтительно адъювант, состоящий не только из соли алюминия.

В изобретении также представлена одновалентная иммуногенная композиция, включающая (а) HBV компонент, включающий HBsAg, экспрессирующийся в хозяине по изобретению S.cerevisiae; и (b) адъювант.

Эти одновалентные композиции в особенности пригодны для защиты от и/или для лечения инфекций вируса гепатита В у пациентов, для которых существующие адъювантные вакцины (такие как продукт ENGERIX B™) оказались неэффективными. Подгруппы пациентов, которым композиции особенно подходят, включают: пациентов с иммунной недостаточностью; пациентов, находящихся на гемодиализе; пациентов перед диализом; пациентов с почечной недостаточностью; пациентов с почечным нарушением; пациентов с ранним почечным нарушением, которым не требуется гемодиализ; пациентов, ожидающих трансплантации печени, например, прибывающих в списках ожидания; пациентов с конечной стадией почечного нарушения; пациентов, перенесших трансплантацию органа (особенно трансплантацию печени), например, за 6 месяцев до первой дозы вакцины по изобретению; пациентов, кто получает (или получил, например, за 6 месяцев до первой дозы вакцины по изобретению) лечение иммуноглобулином гепатита В (HBIg); пациентов с гаплотипом HLA DQ2 [30]; пациентов с гаплотипом HLA DR3 [30]; пациентов с гаплотипом HLA DR7 [30]; пациентов с HLA аллелем DQB1*0202 [31]; пациентов, инфицированных ВИЧ; хронических носителей ВИЧ; пациентов, которые недавно перенесли переливание крови; пациентов, получающих иммуноподавляющие лекарственные средства; пациентов, страдающих AIDS; пациентов с асцитом; пациентов с циррозом; пациентов с энцефалопатией; пациентов, получающих лечение интерфероном, и в особенности ifn-α; пациентов, курящих сигареты; пациентов, курящих сигары; пациентов с индексом массы тела ≥30 кг/м²; и пациентов, которые получили HBsAg вакцину, но у которых не произошла сероконверсия (например, они имеют титр анти-HBsAg в сыворотке <10 мIU/мл после стандартного первичного графика дозирования, такого как 3 дозы ENGERIX B™).

Эти пациенты могут иметь почечный клиренс креатинина менее чем 30 мл/мин (пределы скорости выведения для здоровых мужчин составляют ~100-140 мл/мин и 90-130 мл/мин для женщин). Пациентам предпочтительно, по меньшей мере, 15 лет, например, между 15 и 40 годами, между 40 и 60 годами или даже более 60 лет. Пациентов в возрасте свыше 55 лет можно было успешно лечить, не взирая на любые лежащие в основе заболевания.

Поверхностный антиген гепатита В

Вирион HBV состоит из внутреннего ядра, окруженного белками внешней оболочки или капсидом. Основным компонентом капсида является белок, обозначенный как 'HBsAg'. Все существующие вакцины против гепатита В содержат HBsAg, когда этот антиген вводят в нормальные вакцины, он стимулирует продукцию анти-HBsAg антител, которые защищают против HBV инфекции.

Для производства вакцины HBsAg можно получать двумя путями. Первый способ включает очистку антигена в форме частиц из плазмы хронических носителей гепатита В, поскольку большие количества HBsAg синтезируются в печени и высвобождаются в кровоток во время HBV инфекции. Второй путь включает экспрессию белка методами рекомбинантной ДНК. Для применения по настоящему изобретению HBsAg рекомбинантно экспрессируется в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.

В отличие от нативного HBsAg (т.е. очищенного из плазмы продукта) HBsAg, применяемый по изобретению, не гликозилирован. Эта форма HBsAg является предпочтительной, так как она высокоиммуногенна и может быть получена без риска заражения продуктами крови.

Экспрессирующийся в дрожжах HBsAg представлен преимущественно в форме по существу сферических частиц (средний диаметр около 20 нм), включающих липидный матрикс, включающий фосфолипиды. В отличие от полученных из плазмы частиц HBsAg экспрессирующиеся в дрожжах частицы могут включать фосфатидилинозитол. Кроме того, липидный матрикс может включать не ионные поверхностно активные вещества, такие как полисорбат 20, который может быть введен в матрикс во время очистки антигена от экспрессирующего хозяина - дрожжей. Применение полисорбата 20 во время разрушения рекомбинантных дрожжевых клеток на начальной стадии очистки HBsAg является одним из путей, когда полисорбат 20 может быть введен в HBsAg частицы. Полисорбат 20 обычно присутствует в весовом соотношении, по меньшей мере, 5 мкг на 100 мкг HBsAg.

Все известные субтипы HBV содержат общий детерминант 'а'. Объединенные с другими детерминантами и субдетерминантами были идентифицированы девять субтипов: aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- и adrq+. Кроме этих субтипов были обнаружены другие варианты, такие как HBV-мутанты, которые были обнаружены у иммунизированных индивидуумов ("ускользнувшие мутанты"). В то время как в некоторых исследованиях обнаружили, что у людей с ослабленным иммунитетом (например, пациентов, находящихся на гемодиалезе) большая часть сывороток инфицирована субтипами adw4 или ayw3 (например, смотри ссылку 32, где 75% сывороток было инфицировано adw4, возрастая до 88% у части пациентов, находящихся на гемодиализе; и ссылку 33, где 58% части образцов пациентов, находящихся на гемодиализе было инфицировано ayw3), наиболее предпочтительным субтипом HBV для применения по изобретению является субтип adw2. Этот субтип был обнаружен у единственного пациента, находящегося на гемодиализе, описанного в ссылке 32, и только в малом количестве при вспышке HBV инфекции в эпидемическом очаге среди пациентов, находящихся на гемодиализе в Калифорнии и Небраска в 1994 году [34] и позже в Бразилии [35, 36], но он является высокоиммуногенным и эффективным у более чем 98% пациентов, находящихся на гемодиализе.

Предпочтительный HBsAg имеет следующую 226-членную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 3):

В изобретении может применяться SEQ ID NO: 3 или последовательность, отличающаяся от SEQ ID NO: 3 и имеющая до 10 (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) единичных аминокислотных замен.

Последовательность, кодирующая HbsAg, может представлять собой следующую 678-членную нуклеотидую последовательность (SEQ ID NO: 4):

За последним кодоном последовательности, кодирующей HBsAg, предпочтительно следует стоп-кодон ТАА (охра). Кроме 'S' последовательности поверхностный антиген может включать всю или часть пре-S-последовательности, такую как вся или часть пре-S1 и/или пре-S2-последовательности. Предпочтительно, однако, применять только S-последовательность, как показано выше.

Промотор GAPDH

Согласно изобретению HBsAg экспрессируется в хозяине Saccharomyces cerevisiae, несущем плазмиду, имеющую расположенный выше промотор из гена глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) и, в особенности, из дрожжевого GAPDH [37-40]. Промотор связан с последовательностью, кодирующей HBsAg, так чтобы регулировать ее транскрипцию.

Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа представляет собой гликолитический фермент, и было обнаружено, что его промотор особенно подходит для контроля экспрессии HBsAg в S.Cerevisiae [41]. Промотор GAPDH, описанный в ссылке 41, имеет следующую 1061-членную последовательность (SEQ ID NO: 5):

Этот промотор может быть использован согласно изобретению, но предпочтительно использовать промотор, включающий следующую 1060-членную последовательность (SEQ ID NO: 1):

Эта последовательность отличается от SEQ ID NO: 5 в следующих положениях: (1) нуклеотидная замена А/С в положении 42; (2) нуклеотидная замена Т/А в положении 194; (3) нуклеотидная мутация С/А в положении 301; (4) нуклеотидная вставка А в положении 471; (5) замена остатка С/Т в положении 569; (6) замена остатка С/Т в положении 597; (7) нуклеотидная вставка Т в положении 604 (пента-Т вместо тетра-Т); и (8) замена 3'-GCTT последовательности на одно А:

В изобретении может применяться промоторная последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность, отличная от SEQ ID NO: 1 и имеющая до 20 точечных мутаций (то есть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), где каждая точечная мутация представляет собой делецию, замену или вставку одного нуклеотида.

1060-членная последовательность предпочтительно располагается непосредственно перед старт-кодоном ATG, кодирующим N-конец HBsAg (SEQ ID NO: 2), например:

Терминатор ARG3

Согласно изобретению HBsAg экспрессируется в хозяине Saccharomyces cerevisiae, несущем плазмиду, имеющую расположенный ниже терминатор транскрипции из ARG3. Терминатор связан с последовательностью, кодирующей HBsAg, так чтобы регулировать ее транскрипцию.

В дрожжах ген ARG3 кодирует фермент орнитинкарбамоилтрансферазу [42], и его последовательность терминации транскрипции применялась в нескольких дрожжевых рекомбинантных системах экспрессии [43-45]. Она пригодна для контроля экспрессии HBsAg в дрожжах, особенно в комбинации с промотором GAPDH.

Последовательность располагается непосредственно за стоп-кодоном ARG3, как описано в GenBank GI:171076, представляет собой следующую 450-членную последовательность (SEQ ID NO: 6):

При увеличении на 250 нуклеотидов, дополнительно введенных в кодирующую последовательность, ген ARG3 включает следующую 700-членную последовательность (SEQ ID NO: 6):

Терминация транскрипции в SEQ ID NO: 7 происходит в области подчеркнутого сайта SacII.

Предпочтительный терминатор для применения по изобретению включает часть обеих последовательностей - кодирующей и расположенной ниже из области ARG3, и особенно включает следующую 689-членную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 8), которая имеет тот же 3'-конец, что и SEQ ID NO: 7:

Эта применяемая последовательность включает EcoRI сайт вблизи 5'-конца (подчеркнут), что облегчает вставку терминатора в желаемое положение.

Также может присутствовать дополнительная расположенная ниже последовательность терминатора из ARG3. Может быть включено до 1500 нуклеотидов из ARG3 (т.е. до 800 дополнительных нуклеотидов ниже SEQ ID NO: 7), например до 1200 нуклеотидов или примерно 1150 нуклеотидов.

В изобретении может применяться последовательность терминатора SEQ ID NO: 8 или последовательность, отличная от SEQ ID NO: 8 и имеющая до 30 точечных мутаций (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40), каждая точечная мутация представляет собой делецию, замену или вставку одного нуклеотида.

689-членная последовательность предпочтительно расположена непосредственно за стоп-кодоном С-конца HBsAg (SEQ ID NO: 9), например:

Плазмида

Ген, кодирующий HBsAg, промотор GAPDH и терминатор ARG3, функционально связаны как часть одной и той же плазмиды. Плазмиды по изобретению также обычно включают 1, 2 или предпочтительно 3 следующих элемента: маркер селекции LEU2; последовательность плазмиды 2µ; и последовательность начала репликации функциональную в E.coli. Эти три компонента были ранее описаны в плазмидах, применяемых для экспрессии HBsAg [45].

Маркер селекции LEU2 часто применяется в генетике дрожжей. LEU2 кодирует 3-изопропилмалат-дегидрогеназу, которая является третьим ферментом в пути биосинтеза лейцина. Маркер LEU2 плазмиды дает возможность синтезировать лейцин из метаболических предшественников и применяется в ауксотрофных по лейцину клетках-хозяевах, например в LEU2-нуль мутантах. Таким образом, маркер LEU2 дает возможность ауксотрофам по лейцину, которые не могут нормально расти без добавления лейцина, расти в отсутствии лейцина.

Последовательность плазмиды 2µ также является известной в генетике дрожжей [46] и применяется для увеличения числа копий плазмиды. Любая подходящая последовательность 2µ плазмиды может применяться в плазмидах по изобретению. Плазмида включает дрожжевую последовательность начала репликации, и обычно она содержится в последовательности 2µ.

Путем включения последовательности начала репликации, функциональной в E.coli, плазмиды могут действовать как шатл-векторы между дрожжами и E.coli, таким образом давая возможность манипуляций с плазмидой в соответствующих системах E.coli.

Таким образом, в изобретении представлена плазмида, содержащая следующие элементы: (1) последовательность, кодирующую HBsAg; (2) расположенный выше промотор из гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы для контроля экспрессии последовательности, кодирующей HBsAg; и (3) расположенный ниже последовательности, кодирующей HbsAg, терминатор транскрипции ARG3. Плазмида может также включать следующие элементы: (4) маркер селекции LEU2; (5) последовательность плазмиды 2µ; и (6) последовательность начала репликации функциональная в E.coli. последовательность, кодирующая HBsAg, предпочтительно кодирует HBsAg с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 или последовательностью, отличной от SEQ ID NO: 3, имеющей до 10 единичных аминокислотных замен (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). Последовательность промотора GAPDH предпочтительно включает SEQ ID NO: 1 или последовательность, отличную от SEQ ID NO: 1, имеющую до 20 точечных мутаций (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20). Последовательность терминатора ARG3 предпочтительно включает SEQ ID NO: 8 или последовательность, отличную от SEQ ID NO: 8, имеющую до 20 точечных мутаций (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20). Плазмида может сохраняться в хозяине S.cerevisiae и может применяться для экспрессии HBsAg.

Плазмиды с последовательностью, имеющей от 14500 до 15000 п.о., являются предпочтительными, например от 14600 до 14700 п.о.

Хозяин S.cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae является широко применяемым дрожжевым хозяином для рекомбинантной экспрессии. По изобретению может применяться любой подходящий S.cerevisiae хозяин. Однако предпочтительно применять хозяин, ауксотрофный по лейцину, так чтобы применять плазмиду с маркером селекции LEU2. Клетка-хозяин может быть leu2-3 Ieu2-112 мутантной.

Дополнительными характеристиками предпочтительных дрожжевых хозяев являются штаммы his3 и/или canl-11. Наиболее предпочтительным дрожжевым хозяином является штамм leu2-3 Ieu2-112 his3 canl-11, такой как штамм DC5.

В изобретении представлен дрожжевой штамм, несущий плазмиду по изобретению. В изобретении также представлено применение этого дрожжевого штамма в производстве композиции по изобретению.

Экспрессия и очистка HBsAg

Методики культивирования дрожжевых культур для рекомбинантной экспрессии белка хорошо известны из уровня техники. Дрожжи могут культивироваться в синтетической среде, например, содержащей очищенные аминокислоты (обычно без лейцина, где применяется маркер LEU2), витамины, соли и т.д. HBsAg может быть затем очищен с помощью способа, включающего стадии, такие как преципитация, ион-обменная хроматография и ультрафильтрация. Другие стадии, которые могут применяться во время очистки, включают гель-проникающую хроматографию и ультрацентрифугирование с хлоридом цезия.

Особенно предпочтительной стадией для повсеместного включения в способ очистки является стадия разрушения клетки в присутствии не ионного детергента, такого как Triton-X100 или эфиры жирных кислот полиоксиэтиленсорбитан, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитан (также известный как полисорбат 80) или более предпочтительно монолаурат полиоксиэтиленсорбитан (также известный как полисорбат 20). Разрушенные клетки можно затем центрифугировать, чтобы получить супернатант, в котором присутствует HBsAg. Белок можно затем очистить из супернатанта, например, с использованием способа, описанного в ссылке 47.

После очистки HBsAg может быть подвергнут диализу (например, с цистеином), который может быть применен для удаления любых ртутных консервантов, таких как тимерозал, который может применяться при получении HBsAg [48].

HBsAg, экспрессированный и очищенный согласно изобретению, может быть объединен с отличными от HBV антигенами для получения мультивалентных вакцин или может быть объединен с новыми адъювантами для получения улучшенных одновалентных вакцин.

Одновалетные иммуногенные композиции

HBsAg, экспрессированный и очищенный согласно изобретению, может быть объединен с новыми адъювантами для получения улучшенных одновалентных вакцин. Три определенных интересующих адъюванта для применения в одновалентных вакцинах представляют собой: CpG-олигонуклеотиды; производные аминоалкилглюкозаминидфосфата; и смесь 3d-MPL с солями алюминия.

CpG-олигонуклеотидные адъюванты представляют собой иммуностимуляторные олигонуклеотиды, которые включают нуклеотидные последовательности, содержащие CpG-мотив (динуклеотидная последовательность, содержащая неметилированный цитозин и следующий за ним гуанозин). Было показано, что бактериальная двухцепочечная РНК или олигонуклеотиды, содержащие палиндромные или поли(dG) последовательности, также являются иммуностимуляторными. CpG могут включать нуклеотидные модификации/аналоги, такие как фосфоротиоатные, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Необязательно гуанозин может быть заменен на аналог, такой как 2'-дезокси-7-деазагуанозин. В ссылках 49-51 приведены примеры возможных аналогов для замен. Адъювантный эффект CpG-олигонуклеотидов дополнительно обсуждается в ссылках 52-57.

CpG-последовательность может быть направлена на TLR9, такой как мотив GTCGTT (SEQ ID NO: 11) или TTCGTT (SEQ ID NO: 12) [58]. Для индуцирования Th1-иммунного ответа CpG-последовательность может быть специфической, такой как CpG-А ODN, или для индуцирования В-клеточного ответа может быть более специфической, такой как CpG-В ODN. CpG-А ODN и CpG-В ODN обсуждаются в ссылках 59-61. Предпочтительно CpG представляет собой CpG-А ODN.

Предпочтительно CpG-олигонуклеотид сконструирован так, что 5'-конец доступен для распознавания рецептором. Необязательно две CpG-олигонуклеотидные последовательности могут быть присоединены с их 3'-концами для образования «иммуномеров». Смотри, например, ссылки 58 и 62-64.

Аминоалкилглюкозаминидфосфатные производные (AGP) включают RC-529 [65-68], который представляет собой аминоалкилглюкозаминид 4-фосфат, продаваемый Корпорацией Corixa.

AS04 представляет собой смесь адъюванта на основе соли алюминия и 3D-MPL адъюванта [69]. При использовании AS04 HBsAg предпочтительно адсорбируется на соли алюминия, например, как описано в ссылке 70. Предпочтительно соль алюминия является фосфатом, и, по меньшей мере, 50% (по весу) общего количества HBsAg адсорбируется на фосфате алюминия, например ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95%, ≥98% или более. Процент адсорбированного материала можно легко измерить путем разделения адсорбированного материала от неадсорбированного, например, путем центрифугирования, при котором адсорбированный на алюминии антиген легко образует осадок, тогда как неадсорбированный антиген останется в супернатанте. Количество HBsAg в супернатанте (например, измеренное с помощью анти-HBsAg ELISA) может быть вычтено из общего количества HBsAg в композиции, и затем может быть рассчитан процент адсорбированного материала. Предпочтительно, что HBsAg адсорбируется полностью, т.е. в супернатанте ничего не детектируется.

3D-MPL адъювант также может быть адсорбирован на фосфат алюминия. Предпочтительно, по меньшей мере, 50% (по весу) общего количества 3D-MPL адсорбируется, например ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95%, ≥98% или более. Процент адсорбированного материала может быть измерен тем же способом, что и для HBsAg. В композиции, имеющей общую концентрацию 3D-MPL 50 мкг/мл, концентрация не адсорбированного 3D-MPL должна быть менее чем 25 мкг/мл, например, ≤20 мкг/мл, ≤15 мкг/мл, ≤10 мкг/мл, ≤5 мкг/мл, ≤2 мкг/мл, ≤1 мкг/мл и т.д.

Адъюванты на основе фосфата алюминия описаны ниже более подробно.

3-О-деацилированный монофосфориллипид А (3D-MPL) также обозначается как 3 де-О-ацилированный монофосфориллипид А или как 3-О-дезацил-4'-монофосфориллипид А. Название обозначает, что положение 3 восстановленного конца глюкозамина в монофосфориллипиде А является деацилированным. Он был получен из лишенного гептозы мутанта Salmonella minnesota и является химически подобным липиду А, но лишенным кислото-лабильной фосфорильной группы и основно-лабильной ацильной группы. Он активирует клетки линий моноцитов/макрофагов и стимулирует высвобождение некоторых цитокинов, включающих IL-I, IL-12, TNF-α и GM-CSF. Получение 3D-MPL впервые было описано в ссылке 71, и продукт производился и продавался Корпорацией Corixa под торговой маркой MPL™. Дополнительные подробности можно найти в ссылках 72-75. 3D-MPL может быть включен в комбинацию с триэтаноламином, триэтиламмонием или ионом триэтиламина.

3D-MPL может принимать форму смеси родственных молекул, отличающихся их ацилированием (например, имеющим 3, 4, 5 или 6 ацильных цепей, которые могут быть различными по длине). Два моносахарида 2-дезокси-2-амино-глюкозы являются N-ацилированными по их углеродному положению 2 (т.е. по положению 2 и 2'), а также имеет место О-ацилирование по положению 3'. Группа, присоединенная к атому углерода 2, имеет формулу -NH-CO-CH₂-CR¹R^1'.

Группа, присоединенная к атому углерода 2', имеет формулу -NH-CO-CH₂-CR²R^2'. Группа, присоединенная к атому углерода 3', имеет формулу -NH-CO-CH₂-CR³R^3'. Характерная структура показана ниже:

Группы R¹, R² и R³ каждая независимо являются -(CH₂)_n-CH₃. Значение n предпочтительно находится между 8 и 16, более предпочтительно между 9 и 12 и наиболее предпочтительно 10.

Группы R^1', R^2' и R^3' каждая независимо может являться: (а) -H; (b) -OH; или (c) -O-CO-R⁴, где R⁴ является или -H, или (CH₂)_m-CH₃, где значение m предпочтительно находится между 8 и 16 и более предпочтительно 10, 12 или 14. В положении 2 m предпочтительно 14. В положении 2' m предпочтительно 10. В положении 3' m предпочтительно 12. Группы R^1', R^2' и R^3', таким образом, предпочтительно являются -О-ацильными группами из додекановой кислоты, тетрадекановой кислоты или гексадекановой кислоты.

Когда все R^1', R^2' и R^3' представляют собой -Н, то 3D-MPL имеет только 3 ацильные цепи (одна на каждое из положений 2, 2' и 3). Когда только два из R^1', R^2' и R^3' представляют собой -Н, то 3D-MPL может иметь 4 ацильные цепи. Когда только один из R^1', R^2' и R^3' представляет собой -Н, то 3D-MPL может иметь 5 ацильных цепей. Когда ни один из R^1', R^2' и R^3' не является -Н, то 3D-MPL может иметь 6 ацильных цепей. Применяемый согласно изобретению 3D-MPL адъювант может представлять собой смесь этих форм, имеющих от 3 до 6 ацильных цепей, но предпочтительно включать в смесь 3D-MPL с 6 ацильными цепями, и в особенности обеспечивать, чтобы форма с 6 ацильными цепями составляла, по меньшей мере, 10% по весу от общего количества 3D-MPL, например ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50% или более. Было обнаружено, что 3D-MPL с 6 ацильными цепями является наиболее активной формой адъюванта.

Наиболее предпочтительная форма 3D-MPL для включения в композиции по изобретению имеет формулу (II), показанную ниже.

В водных условиях 3D-MPL может образовывать мицелярные агрегаты или частицы различного размера, например диаметром <150 нм или >500 нм. Каждая из них или обе эти частицы могут применяться по изобретению, и лучшие частицы могут быть выбраны с помощью типового теста. Было опубликовано, что меньшие частицы (например, достаточно маленькие, чтобы получить чистую водную суспензию 3D-MPL) являются лучшими [76] и предпочтительны для применения согласно изобретению. Предпочтительные частицы имеют средний диаметр менее чем 220 нм, более предпочтительно менее чем 200 нм, менее чем 150 нм и менее чем 120 нм. Они могут иметь даже средний диаметр менее чем 100 нм. Однако в большинстве случаев средний диаметр не бывает ниже чем 50 нм.

После того как 3D-MPL адсорбируется на фосфат алюминия, не представляется возможным непосредственно измерить размер частицы, но размер частицы можно измерить перед тем, как произойдет адсорбция.

Диаметр частицы можно оценить с помощью типовой методики динамического светорассеяния, с помощью которой обнаруживают средний диаметр частицы. Когда указанная частица имеет средний диаметра х нм, то в основном будет распределение частиц около этой величины, но, по меньшей мере, 50% количества частиц (например, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% и более) будет иметь диаметр в пределе х±20%.

Мультивалентные иммуногенные композиции

HBsAg, экспрессированный и очищенный согласно изобретению, может быть объединен с одним или несколькими отличными от HBV антигентами для получения мультивалентных вакцин. Отличные от HBV антигены могут включать бактериальные и/или вирусные антигены. Типичные отличные от HBV компоненты для применения согласно изобретению включают, но не ограничены ими:

дифтерийный анатоксин ('D')

столбнячный анатоксин ('Т')

коклюшный антиген ('Р'), который может быть или клеточным ('wP') или бесклеточным ('аР')

антиген вируса гепатита А (HAV)

конъюгированный капсульный сахарид Haemophilus influenzae типа b ('Hib')

инактивированный полиовирус (IPV)

конъюгированный капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С ('MenC')

конъюгированный капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы A ('MenA')

конъюгированный капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы W135 ('MenW135')

конъюгированный капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы Y ('MenY')

конъюгированный капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae

антиген вируса кори

антиген вируса свинки

антиген вируса краснухи

антиген вируса ветряной оспы

антиген вируса гриппа

Может применяться более чем один из этих отличных от HBV антигенов. Следующие комбинации антигенов наиболее предпочтительны:

Двухвалентные вакцины: HBV-HAV; HBV-Hib.

Трехвалентные вакцины: HBV-D-T.

Четырехвалентные вакцины: HBV-D-T-P.

Пятивалентные вакцины: HBV-D-T-P-Hib; HBV-D-T-P-IPV.

Шестивалентные вакцины: HBV-D-T-P-Hib-IPV.

Семивалентные вакцины: HBV-D-T-P-Hib-MenA-MenC; HBV-D-T-P-Hib-IPV-MenC.

Дифтерийный анатоксин ('D') описан более подробно в главе 13 ссылки 1. Предпочтительными дифтерийными анатоксинами являются те, которые получены с помощью обработки формальдегидом. Дифтерийный анатоксин может быть получен с помощью выращивания C.diphtheriae в ростовой среде (например, среде Fenton или среде Linggoud & Fenton), в которую может быть добавлен бычий экстракт с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и преципитацией. Анатоксинный материал может затем быть обработан с помощью способа, включающего стерильную фильтрацию и/или диализ. Количества дифтерийного анатоксина могут быть выражены в международных единицах (IU). Например, NIBSC утверждает 'Третий Международный Стандарт Дифтерийного Адсорбированного Анатоксина 1999' [77,78], где содержится 160 IU на ампулу. В качестве альтернативы IU системы Lf единица («единицы флокуляции» или «доза флокуляции осадков») определяется как количество анатоксина, которое при смешивании с Международной Единицей анатоксина приводит к получению оптимальной флоккулирующей смеси [79]. Например, NIBSC утверждает 'Дифтерийный Анатоксин, План' [80], где содержится 300LF на ампулу, а также утверждает 'Первый Международный Совет по Реагентам для Дифтерийных Анатоксинов для Флокуляционных Тестов' [81], где содержится 900LF на ампулу.

Столбнячный анатоксин ('Т') описан более подробно в главе 27 ссылки 1. Предпочтительными столбнячными анатоксинами являются те, которые получены с помощью обработки формальдегидом. Столбнячный анатоксин может быть получен с помощью выращивания C.diphtheriae в ростовой среде (например, среде Latham, выделенной из бычъего казеина) с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и преципитацией. Материал может затем быть обработан с помощью способа, включающего стерильную фильтрацию и/или диализ. Количества столбнячного анатоксина могут быть выражены в международных единицах (IU). Например, NIBSC утверждает 'Третий Международный Стандарт Столбнячного Адсорбированного Анатоксина 2000' [82, 83], где содержится 469 IU на ампулу. В качестве альтернативы IU системы Lf единица («единицы флокуляции» или «доза флокуляции осадков») определяется как количество анатоксина, которое при смешивании с Международной Единицей анатоксина приводит к получению оптимальной флоккулирующей смеси [79]. Например, NIBSC утверждает 'Первый Международный Совет по Реагентам для Столбнячных Анатоксинов для Флокуляционных Тестов' [84], где содержится 1000LF на ампулу.

Коклюшный антиген ('Р') может быть или клеточным ('wP'), или бесклеточным ('аР'). Клеточные коклюшные антигены обычно принимают форму инактивированных B.pertussis клеток. Получение клеточных коклюшных антигенов хорошо задокументировано (например, смотри главу 21 ссылки 1), например, они могут быть получены путем тепловой инактивации культуры B.pertussis в фазе I. Количества wP антигенов могут быть выражены в международных единицах (IU). Например, NIBSC утверждает 'Третий Международный Стандарт Коклюшной Вакцины' [85], где содержится 46 IU на ампулу. Каждая ампула содержит вымороженный-высушенный осадок 2 мл аликвот водного раствора, который содержал 10 литров бактериальной суспензии (эквивалентно 180 единицам мутности по определению U.S. Стандарта Мутности), разведенной в восьми литрах M/15 буфера Соренсена pH 7,0. В качестве альтернативы IU системе также используется единица 'OU' («единицы мутности») (например, 4 OU может быть примерно 1 IU). Бесклеточные коклюшные антигены, в настоящий момент используемые в вакцинах, включают коклюшный анатоксин (РТ), филаментный гемагглютинин (FHA), пертактин (также известный как '69 кДа белок внешней мембраны') и фимбрии (например, аглютиногены 2 и 3). В изобретении предпочтительно применяются два из и предпочтительно все три из PT, FHA и пертактина (т.е. без применения фимбрий). Эти три антигена предпочтительно получают путем выделения из B.pertussis культуры, выращенной в модифицированной жидкой среде Stainer-Scholte. PT и FHA могут быть выделены из ферментационного бульона (например, путем адсорбции на гидроксиапатитный гель), тогда как пертактин может быть экстрагирован из клеток с помощью тепловой обработки и флоккуляции (например, с применением хлорида бария). Антигены могут быть очищены с помощью последовательных стадий хроматографии и/или преципитации. PT и FHA могут быть очищены с помощью гидрофобной хроматографии, аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии. FHA и пертектин могут быть обработаны формальдегидом перед применением согласно изобретению. РТ предпочтительно детоксифицируется путем обработки формальдегидом и/или глутаральдегидом. В качестве альтернативы этой процедуре химической детоксификации РТ может быть представлен как мутантный РТ, в котором ферментативная активность уменьшена путем мутагенеза [86], но детоксификация путем химической обработки является предпочтительной. Количества бесклеточных кокл